β-淀粉样蛋白所致拟AD大鼠模型行为学特征
【摘要】 目的 探讨Aβ所致AD大鼠模型Morris水迷宫行为学特征。方法 12月龄SD大鼠，随机分为假手术组与模型组，模型组给予右侧海马一次性注射凝聚态Aβ1-402μl(10μg)。假手术组给予等量双蒸水。术后23天进行Morris水迷宫检测。结果 模型组大鼠在第2次训练和最后1次训练，其在各象限平均潜伏期和平均游泳距离均大于假手术组(P<0.05，P<0.01)。结论 Aβ所致AD大鼠模型空间学习记忆功能明显受损。
关键词 阿尔茨海默病 行为学模型 Morris水迷宫 β淀粉样蛋白
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0481-04
The praxiological characters of the rat AD model which were caused by Aβ
, 百拇医药 Cheng Long，Tian Jinzhou，Huang Qifu，et al.
The Dongzhimen Hospital Affiliated Beijing Traditional Chinese Medical University，Beijing100700.
【Abstract】 Objective To investigate the praxiology characters of the rat AD model which were caused by Aβ.Methods 12month old SD rats were divided into sham operation groupw and model group randomly.Model groups were injection with condensed Aβ 1～40 2μl(10μg)into rat right hippocampi，and the sham operation group were injection with distilled wate.To detect the praxiology of these rat by Morris water maze23days later.Result The avˉerage incubation period and average swim distance of model group rats in each quadrant were significantly longer than sham group at the2 nd and the last discipline(P<0.05or P<0.01).Conclusion The space study and memory funcˉtion of rat AD model which were caused by Aβwas impaired significantly.
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Key words Alzheimer’s disease praxiology model morris water maze Aβ
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以渐进性的学习、记忆、行为和人格障碍为主要临床特征的神经精神疾病。神经病理学特征是老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样血管病变以及突触和神经元的丢失。神经元损害、认知损害和记忆丧失的程度与β-淀粉样物质沉积范围有关 [1，2] 。实验显示，β-淀粉样片段，以及β-淀粉样蛋白(1-40)，对原代培养的海马细胞具有神经毒作用，直接注射入大鼠海马可造成AD的特征性病理变化。1994年日本学者Atsumi Nitta等 [3] 研究者提出β-淀粉样蛋白脑内注射的大鼠可被用于AD的动物模型，应用β-淀粉样蛋白直接脑内注射建立阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)动物模型的方法受到广泛重视，但由于Aβ片段、状态以及注射脑区和方法的不同，实验结果也较不一致 [4] 。近年来，国内外一些学者发现凝聚态Aβ1-40海马注射具有明确的在体神经毒作用，可较好的模拟AD行为学和病理表现 [5] 。但是仍缺乏深入的行为学研究，我们用Morris水迷宫行为评价该模型的行为学特征具有重要意义。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 12月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄，体重450±50g，由中国医学科学院实验动物研究所提供(动物SCKJ1-00-0005)。动物于实验前1周运到实验室，在安静环境下分笼饲养，温度控制在22±1℃的范围内，相对湿度60%，光线自动控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替，给予充足清洁饮水、摄食。
1.2 主要试剂 Amyloidβ-protein，Fragment1-40(Sigma公司，Lot59H49552)，抗Amyloidβ-protein多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnolgoy，Inc)，SABC试剂盒以及DAB购自武汉BOSTER公司。PBS、4%多聚甲醛、甲醇刚果红染液(国产分析纯试剂配置)。
2 方法
, 百拇医药 2.1 动物筛选与分组 用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。随机分为假手术组6只。模型组20只，分别于手术后0.5h(n=3)、3天(n=3)、7天(n=3)、14天(n=3)、28天(n=8)取材。
2.2 β-淀粉蛋白立体定向微注射于大鼠的右侧海马区。Aβ1～40用无菌双蒸水配制成5g/L，-20℃保存。聚集态的Aβ1～40形成:Aβ1～40溶液在37℃保温箱中放置7天 [6] 。模型组大鼠用10%的水合氯醛(0.035ml/kg)麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，用脑立体定位仪，常规备皮消毒，参照包新明等著《大鼠脑立体定向图谱》，前囟后4mm，右侧旁开2.8mm，DV3mm即为海马区注射点，在颅骨上用牙钻打孔，钻薄颅骨而不钻透，由微量注射器稍用力即透颅骨，缓慢注射2μl(10μg)Aβ1-40，在5min内注完，并留针5min，缝合皮肤并消毒。假手术组在海马内注射等量的双蒸水。单笼饲养至大鼠完全清醒。28天组术后第23天开始进行行为测试，测试结束后进行病理检查。
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3 观察指标
Morris水迷宫行为测定:中国医学科学院药物研究所研制。水迷宫为直径130cm，高50cm的圆形水池，水深30cm，水温保持26±1℃，放入500g市售食用速溶奶粉，混匀。池壁上标有东南西北四个入水点，它们将水池等分为四个象限，分别称SW、NW、SE及NE象限，在SW象限正中离池壁33cm处放一个直径为9cm，高29cm的圆形透明平台，平台顶低于水面1cm。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机。同步记录大鼠运动轨迹。训练期间迷宫外参照物保持不变。手术后第23天开始，实验历时5天，第一天让大鼠自由游泳2min;第一天第2次开始训练，随后每天训练1次，共5天。训练时选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(潜伏期)及游泳速度。如果大鼠在120s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期为120s，每次训练间隔60s。 数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。
统计学处理:统计各组游泳时间和游泳长度，以均数±标准差表示，数据采用社会科学统计程序软件(SPSS10.0for Windows)进行t检验。
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4 结果
Morris水迷宫行为测定结果 表1为模型组与假手术组游泳时间的比较，而游泳长度的比较见表2。与假手术组相比，模型组4个象限游泳时间和游泳长度均大于假手术组，详见表3～10。
表1 各组游泳时间的比较 (略)
表2 模型组与假手术组游泳长度比较 (略)
表3 模型组与假手术组在第一象限游泳时间的比较 ( 略)
表4 模型组与假手术组在第一象限游泳长度比较 ( 略)
表5 模型组与假手术组在第二象限游泳时间的比较 (略)
表6 模型组与假手术组在第二象限游泳长度比较 ( 略)
, 百拇医药
表7 模型组与假手术组在第三象限游泳时间的比较 (略 )
表8 模型组与假手术组在第三象限游泳长度比较 ( 略)
表9 模型组与假手术组在第四象限游泳时间的比较 (略 )
表10 模型组与假手术组在第四象限游泳长度比较 ( 略)
5 讨论
Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的 [7] ，可作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具。经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息(外部线索)形成的。平台的位置与大鼠自身所处的位置和状态无关，是一种以异我为参照点的参考认知(alloˉcentric congition)，所形成的记忆是一种空间参考记忆(referˉence memory)。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制主要涉及边缘系统(如海马)以及大脑皮层有关脑区，常伴有Hebb突触修饰 [8] ，属于陈述性记忆(declarative memory)。而临床健忘和痴呆的病人，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出 [9] 。所以从 检测的记忆属性来说，运用Morris水迷宫来进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是比较恰当的。本实验模型组在水中游泳时间和长度明显高于假手术组，表明损伤大鼠学习记忆能力明显下降，从行为学上来评价，该模型是相当成功的。海马结构广泛参与学习记忆，尤其是短期和近期记忆过程。学习记忆并非只是某一部位的突触过程，而是包含着多突触的系统活动过程 [10] 。
, 百拇医药
我们通过分析Aβ所致的大鼠学习记忆障碍模型的行为学特点可以发现，模型组大鼠在第2次训练时，其短期记忆就受到了严重的损害，其在水中的游泳时间和游泳长度均大于假手术组(P<0.05，P<0.01)。之后的3次训练两组差异没有显著性(P>0.05)，而到最后1次训练，各象限的游泳时间和长度又均大于假手术组(P<0.05，P<0.01)，说明模型大鼠的学习能力受到严重的损害。在AD患者脑皮质，由于伴随着胆碱能标记酶、乙酰胆碱转移酶丢失(choline acetyltransferase，CHAT)患者记忆受到损害 [11] 。研究者通过研究发现，将β-淀粉样蛋白持续注入成年大鼠脑室可导致大鼠记忆损害和乙酰胆碱神经元功能障碍。该研究的结果表明，β淀粉样蛋白在脑内沉积与乙酰胆碱神经元变性和学习记忆损害相关，β-淀粉样蛋白脑内注入大鼠可被用于作为一种AD的动物研究模型。我们的研究发现，从手术后3天起，注射区周围毛细血管出现淀粉样蛋白的沉积，并且一直持续28天，伴随局部神经元的严重损伤、脱失和胶质细胞增生(另文发表)。明确的显示了Aβ的神经毒作用，较好的模拟了AD的病理学特征。Aβ注射动物模型可以用来研究治疗AD的药物在Aβ集聚或沉积、代谢、神经毒性作用以及小胶质细胞的炎性反应等方面的作用 [12] 。
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参考文献
1 Mann DM，Yules PO，Marcyniuk B.Correlation between senile plaque and neurotibirllary tangle counts in cerebral cortex and neuronal counts in cortex and subcortical structures in Alzheimer’s disease.Neurosci Lett，1985，56:51-55.
2 Wilcock GK，Esiri MM.aques，tangles and dementia.A quantitative study，J.Neurol.Sci，56(1982)343-356.
3 Atsumi Nitta，Akio Itoh，Takaaki Hasegawa，et al.β-Amyloid protein-induced Alzheimer’s disease animal model.Neuroscience Letters，1994，170:63-64.
, 百拇医药
4 Frautschy SA，Yang F，Calderon L，et al.Rodent models of Alzheimer’s disease:rat A beta infusion approaches to amyloid deposits.Neurobiol Aging，1996，17:311-321.
5 刘辉，陈俊抛，田时雨，等.海马注射β-淀粉样蛋白对大鼠学习记忆及局部神经元的损伤作用.中华神经科杂志，2000，33(6):150-152.
6 Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effect of amyloid peptidesβ-(1-40)andβ-(25-35)injections into the rat nucleus asalis.Neuroscience，1995，66:781-792.
, 百拇医药
7 Morris R GM.Garrud P，Rawlins J N P，et al.Place navigation imparied in rats with hippocampal lesions.Nature，1982，297:681.
8 Lisman J.Amechanism for the Hebb and anti Hebb processes underlying learning and memory.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86:9574.
9 Squire LR，Zola Morgan S.Memory，brain system and behavior.Trends in Neuroscience，1988，11:170.
10 Mcnanghton B L.Hippocampal synaptic enhancement and information storage with distributed memory system.Trends Neurosci，1987，10(10):408-415.
11 Wilcock GK，Esiri MN，Bowen DM，et al.Alzheimer’s disease:correlaˉtion of cortical choline acetyltransferase activity with the severty of deˉmentia andhistological abnormalities.J Neurol Sci，1982，57:407-417.
12 王德生，张守信.老年性痴呆，北京:人民卫生出版社，2001，141-142.
(收稿日期:2003-04-06) (编辑 一坤), 百拇医药(程龙)
关键词 阿尔茨海默病 行为学模型 Morris水迷宫 β淀粉样蛋白
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0481-04
The praxiological characters of the rat AD model which were caused by Aβ
, 百拇医药 Cheng Long，Tian Jinzhou，Huang Qifu，et al.
The Dongzhimen Hospital Affiliated Beijing Traditional Chinese Medical University，Beijing100700.
【Abstract】 Objective To investigate the praxiology characters of the rat AD model which were caused by Aβ.Methods 12month old SD rats were divided into sham operation groupw and model group randomly.Model groups were injection with condensed Aβ 1～40 2μl(10μg)into rat right hippocampi，and the sham operation group were injection with distilled wate.To detect the praxiology of these rat by Morris water maze23days later.Result The avˉerage incubation period and average swim distance of model group rats in each quadrant were significantly longer than sham group at the2 nd and the last discipline(P<0.05or P<0.01).Conclusion The space study and memory funcˉtion of rat AD model which were caused by Aβwas impaired significantly.
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Key words Alzheimer’s disease praxiology model morris water maze Aβ
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以渐进性的学习、记忆、行为和人格障碍为主要临床特征的神经精神疾病。神经病理学特征是老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样血管病变以及突触和神经元的丢失。神经元损害、认知损害和记忆丧失的程度与β-淀粉样物质沉积范围有关 [1，2] 。实验显示，β-淀粉样片段，以及β-淀粉样蛋白(1-40)，对原代培养的海马细胞具有神经毒作用，直接注射入大鼠海马可造成AD的特征性病理变化。1994年日本学者Atsumi Nitta等 [3] 研究者提出β-淀粉样蛋白脑内注射的大鼠可被用于AD的动物模型，应用β-淀粉样蛋白直接脑内注射建立阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)动物模型的方法受到广泛重视，但由于Aβ片段、状态以及注射脑区和方法的不同，实验结果也较不一致 [4] 。近年来，国内外一些学者发现凝聚态Aβ1-40海马注射具有明确的在体神经毒作用，可较好的模拟AD行为学和病理表现 [5] 。但是仍缺乏深入的行为学研究，我们用Morris水迷宫行为评价该模型的行为学特征具有重要意义。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 12月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄，体重450±50g，由中国医学科学院实验动物研究所提供(动物SCKJ1-00-0005)。动物于实验前1周运到实验室，在安静环境下分笼饲养，温度控制在22±1℃的范围内，相对湿度60%，光线自动控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替，给予充足清洁饮水、摄食。
1.2 主要试剂 Amyloidβ-protein，Fragment1-40(Sigma公司，Lot59H49552)，抗Amyloidβ-protein多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnolgoy，Inc)，SABC试剂盒以及DAB购自武汉BOSTER公司。PBS、4%多聚甲醛、甲醇刚果红染液(国产分析纯试剂配置)。
2 方法
, 百拇医药 2.1 动物筛选与分组 用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。随机分为假手术组6只。模型组20只，分别于手术后0.5h(n=3)、3天(n=3)、7天(n=3)、14天(n=3)、28天(n=8)取材。
2.2 β-淀粉蛋白立体定向微注射于大鼠的右侧海马区。Aβ1～40用无菌双蒸水配制成5g/L，-20℃保存。聚集态的Aβ1～40形成:Aβ1～40溶液在37℃保温箱中放置7天 [6] 。模型组大鼠用10%的水合氯醛(0.035ml/kg)麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，用脑立体定位仪，常规备皮消毒，参照包新明等著《大鼠脑立体定向图谱》，前囟后4mm，右侧旁开2.8mm，DV3mm即为海马区注射点，在颅骨上用牙钻打孔，钻薄颅骨而不钻透，由微量注射器稍用力即透颅骨，缓慢注射2μl(10μg)Aβ1-40，在5min内注完，并留针5min，缝合皮肤并消毒。假手术组在海马内注射等量的双蒸水。单笼饲养至大鼠完全清醒。28天组术后第23天开始进行行为测试，测试结束后进行病理检查。
, http://www.100md.com
3 观察指标
Morris水迷宫行为测定:中国医学科学院药物研究所研制。水迷宫为直径130cm，高50cm的圆形水池，水深30cm，水温保持26±1℃，放入500g市售食用速溶奶粉，混匀。池壁上标有东南西北四个入水点，它们将水池等分为四个象限，分别称SW、NW、SE及NE象限，在SW象限正中离池壁33cm处放一个直径为9cm，高29cm的圆形透明平台，平台顶低于水面1cm。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机。同步记录大鼠运动轨迹。训练期间迷宫外参照物保持不变。手术后第23天开始，实验历时5天，第一天让大鼠自由游泳2min;第一天第2次开始训练，随后每天训练1次，共5天。训练时选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(潜伏期)及游泳速度。如果大鼠在120s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期为120s，每次训练间隔60s。 数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。
统计学处理:统计各组游泳时间和游泳长度，以均数±标准差表示，数据采用社会科学统计程序软件(SPSS10.0for Windows)进行t检验。
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4 结果
Morris水迷宫行为测定结果 表1为模型组与假手术组游泳时间的比较，而游泳长度的比较见表2。与假手术组相比，模型组4个象限游泳时间和游泳长度均大于假手术组，详见表3～10。
表1 各组游泳时间的比较 (略)
表2 模型组与假手术组游泳长度比较 (略)
表3 模型组与假手术组在第一象限游泳时间的比较 ( 略)
表4 模型组与假手术组在第一象限游泳长度比较 ( 略)
表5 模型组与假手术组在第二象限游泳时间的比较 (略)
表6 模型组与假手术组在第二象限游泳长度比较 ( 略)
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表7 模型组与假手术组在第三象限游泳时间的比较 (略 )
表8 模型组与假手术组在第三象限游泳长度比较 ( 略)
表9 模型组与假手术组在第四象限游泳时间的比较 (略 )
表10 模型组与假手术组在第四象限游泳长度比较 ( 略)
5 讨论
Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的 [7] ，可作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具。经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息(外部线索)形成的。平台的位置与大鼠自身所处的位置和状态无关，是一种以异我为参照点的参考认知(alloˉcentric congition)，所形成的记忆是一种空间参考记忆(referˉence memory)。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制主要涉及边缘系统(如海马)以及大脑皮层有关脑区，常伴有Hebb突触修饰 [8] ，属于陈述性记忆(declarative memory)。而临床健忘和痴呆的病人，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出 [9] 。所以从 检测的记忆属性来说，运用Morris水迷宫来进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是比较恰当的。本实验模型组在水中游泳时间和长度明显高于假手术组，表明损伤大鼠学习记忆能力明显下降，从行为学上来评价，该模型是相当成功的。海马结构广泛参与学习记忆，尤其是短期和近期记忆过程。学习记忆并非只是某一部位的突触过程，而是包含着多突触的系统活动过程 [10] 。
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我们通过分析Aβ所致的大鼠学习记忆障碍模型的行为学特点可以发现，模型组大鼠在第2次训练时，其短期记忆就受到了严重的损害，其在水中的游泳时间和游泳长度均大于假手术组(P<0.05，P<0.01)。之后的3次训练两组差异没有显著性(P>0.05)，而到最后1次训练，各象限的游泳时间和长度又均大于假手术组(P<0.05，P<0.01)，说明模型大鼠的学习能力受到严重的损害。在AD患者脑皮质，由于伴随着胆碱能标记酶、乙酰胆碱转移酶丢失(choline acetyltransferase，CHAT)患者记忆受到损害 [11] 。研究者通过研究发现，将β-淀粉样蛋白持续注入成年大鼠脑室可导致大鼠记忆损害和乙酰胆碱神经元功能障碍。该研究的结果表明，β淀粉样蛋白在脑内沉积与乙酰胆碱神经元变性和学习记忆损害相关，β-淀粉样蛋白脑内注入大鼠可被用于作为一种AD的动物研究模型。我们的研究发现，从手术后3天起，注射区周围毛细血管出现淀粉样蛋白的沉积，并且一直持续28天，伴随局部神经元的严重损伤、脱失和胶质细胞增生(另文发表)。明确的显示了Aβ的神经毒作用，较好的模拟了AD的病理学特征。Aβ注射动物模型可以用来研究治疗AD的药物在Aβ集聚或沉积、代谢、神经毒性作用以及小胶质细胞的炎性反应等方面的作用 [12] 。
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参考文献
1 Mann DM，Yules PO，Marcyniuk B.Correlation between senile plaque and neurotibirllary tangle counts in cerebral cortex and neuronal counts in cortex and subcortical structures in Alzheimer’s disease.Neurosci Lett，1985，56:51-55.
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, 百拇医药
4 Frautschy SA，Yang F，Calderon L，et al.Rodent models of Alzheimer’s disease:rat A beta infusion approaches to amyloid deposits.Neurobiol Aging，1996，17:311-321.
5 刘辉，陈俊抛，田时雨，等.海马注射β-淀粉样蛋白对大鼠学习记忆及局部神经元的损伤作用.中华神经科杂志，2000，33(6):150-152.
6 Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effect of amyloid peptidesβ-(1-40)andβ-(25-35)injections into the rat nucleus asalis.Neuroscience，1995，66:781-792.
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7 Morris R GM.Garrud P，Rawlins J N P，et al.Place navigation imparied in rats with hippocampal lesions.Nature，1982，297:681.
8 Lisman J.Amechanism for the Hebb and anti Hebb processes underlying learning and memory.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86:9574.
9 Squire LR，Zola Morgan S.Memory，brain system and behavior.Trends in Neuroscience，1988，11:170.
10 Mcnanghton B L.Hippocampal synaptic enhancement and information storage with distributed memory system.Trends Neurosci，1987，10(10):408-415.
11 Wilcock GK，Esiri MN，Bowen DM，et al.Alzheimer’s disease:correlaˉtion of cortical choline acetyltransferase activity with the severty of deˉmentia andhistological abnormalities.J Neurol Sci，1982，57:407-417.
12 王德生，张守信.老年性痴呆，北京:人民卫生出版社，2001，141-142.
(收稿日期:2003-04-06) (编辑 一坤), 百拇医药(程龙)