细胞凋亡参与新生SD大鼠窒息条件下胃肠粘膜损伤作用的研究
【摘要】 目的 阐明细胞凋亡在新生SD大鼠窒息条件下对胃肠粘膜损伤的影响。方法用20只新生SD大鼠建立轻、中、重度窒息模型，采集胃粘膜标本，分别进行电镜、DNA电泳检测细胞凋亡是否存在;采用RNA打点杂交及免疫组化技术检测凋亡基因窒息模型。结果 电镜、DNA电泳证实细胞凋亡只存在于中、重度窒息模型的SD大鼠胃肠粘膜;RNA打点杂交显示Fas基因在SD大鼠轻、中、重度窒息模型中呈逐渐升高的表达;免疫组化表明Fas蛋白在SD大鼠轻、中、重度窒息模型中呈逐渐升高的表达。结论 细胞凋亡参与新生SD大鼠窒息条件下胃肠粘膜损伤;Fas基因与Fas蛋白在SD大鼠轻、中、重度窒息模型呈逐渐升高的表达。
关键词 SD大鼠 窒息模型 细胞凋亡 胃肠粘膜 打点杂交
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1774-03
Studies on the function of gastrointestinal mucous
, 百拇医药
membrane’s injury by cell apotosis under the
condition of asphyxia of newborned SD rats
Li Xia，YinJiao，Liu Xiaoyu，et al.
Department of Pediatrics，Air Force General Hospital，Beijing100036.
【Abstract】 Objective To clarify cell appotosis on the effect of injures of gastrointestinal mucous membrane under the condition of asphyxia of newborned SD rats.Methods To establish asphyxia models of low degree，moderate degree and severe degree of SD，collected samples of gastric mucous membranes，and by using electroscope and DNA electrophoresis to examine cell appotosis;by using RNA dot blot and immunohistochemistry to examine expressed levels of fas gene and FAS protein.Results Established successfully asphyxoia mode of low degree、moderate degree and seˉvere degree of SD rats;cell appotosis was confirmed by electroscope and DNA electrophoresis;expressed levels of fas in asphyxoia mode of low degree，moderate degree and severe degree of SD rats were increasing gradually by RNA dot blot;protein level of FAS in asphyxoia mode of low degree，moderate degree and severe degree of SD rats were increasˉing gradually.Conclusion Cell appotosis took part in injury of gastrointestinal mucous membrane under condition of asphyxia;expressed levels of fas and FAS under the condition of asphyxia of newborned SD rats were increasing graduˉally.
, 百拇医药
Key words SD rat asphyxia model cell apoptosis gastrointestinal mucous membrane dot blot
细胞凋亡参与多种疾病的发生过程 [1] 。新生儿窒息是临床常见的疾病，常导致胃肠粘膜的损害，脑组织的缺血缺氧等。近2年文献报道细胞凋亡参与胃肠粘膜的损害，但窒息条件下，细胞凋亡是否参与胃肠粘膜的损害?本研究以新生SD大鼠建立轻、中、重度窒息模型，模拟新生儿窒息条件，采集胃肠粘膜标本进行研究，来探讨细胞凋亡在新生SD大鼠窒息条件下对胃肠粘膜损伤的影响以及对新生儿窒息胃肠粘膜损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 新生SD大鼠20只，重120～140g，购自本院动物实验中心;化学试剂购自华美公司;α- 32 pdATP购自北京福瑞公司;免疫组化试剂购自GIBCO公司;FAS质粒由崔大祥博士提供。
, 百拇医药
1.2 方法 (1)窒息模型的建立:取SD大鼠20只，随机编号为1～20号，分成轻度、中、重度及正常对照4组，即1～5号为轻度窒息组，6～10号为中度窒息组，11～15号为重度窒息组，16～20号为正常对照组。40mg/kg苯巴比妥麻醉，气管插管，气管阻塞1/2为轻度窒息模型，气管阻塞2/3为中度窒息模型，气管完全阻塞为重度窒息模型。各取15min、60min时的胃肠组织，分离出胃肠粘膜，-20℃保存。(2)组织DNA与RNA的提取及RNA打点杂交按分子克隆 [2] 说明进行。DNA电泳按文献 [3] 进行。(3)病理切片的制作按文献 [4]进行。免疫组化染色按说明进行。电镜标本按要求制作。
2 结果
2.1 DNA电泳结果 轻度窒息组无凋亡带形出现;中度窒息组60min时出现凋亡带形;重度窒息组15min、60min时皆出现凋亡带形，正常对照无凋亡带形出现(见图1)。
, 百拇医药
2.2 电镜结果 轻度窒息组:15min时的细胞结构未见异常改变，60min时的细胞结构中线粒体稍肿胀，细胞核等其它细胞器无明显结构改变。中度窒息组:15min时的细胞稍水肿，线粒体稍肿胀，细胞核膜稍肿胀，余未见明显异常改变;60min时的细胞肿胀，线粒体崩溃，细胞核膜碎裂，细胞核碎裂，核碎片边集，出现凋亡小体。重度窒息组:15min时的细胞肿胀，线粒体肿胀，细胞核肿胀，核碎片边集，出现凋亡小体;60min时的细胞变性坏死，线粒体崩溃，细胞核碎裂，核碎片边集，出现凋亡小体;正常对照无结构改变(见图2)。
2.3 RNA打点杂交结果 见图3。轻度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达无明显改变。中度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达比轻度窒息组明显升高;重度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达比轻度窒息组明显升高，比中度窒息组升高，两组之间差异存在显著性(P<0.01);正常对照组有轻度Fas基因表达。上排为60min，下排为15min。
, 百拇医药
2.4 免疫组化染色结果 见图4。轻度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达无明显改变;中度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达比轻度窒息组明显升高;重度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达比轻度窒息组明显升高，两组之间差异存在显著性(P<0.01)，比中度窒息组升高，但无统计学意义;正常对照组无阳性染色。图1 DNA电泳结果1正常对照组;2 重度窒息组60min;3 重度窒息组15min;4 中度窒息组60min
图2 重度窒息组电镜结果略
图3 RAN打点杂交结果略
图4 中度窒息组免疫组化染色结果棕色处为Fas蛋白阳性染色略
3 讨论
细胞凋亡是基因控制下的细胞自杀性死亡，以细胞DNA降解为特征，是细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，参与了多种临床疾病的形成过程，具有广泛的生理病理意义[5] 。本研究通过建立轻、中、重度窒息模型，模拟新生儿窒息条件，借助组织学与分子生物学技术来研究细胞凋亡在窒息条件下对胃肠粘膜的作用及其意义，DNA电泳及FCMS结果表明，中度窒息60min及重度窒息15min、60min时皆可出现细胞凋亡，表明细胞凋亡参与窒息的病理生理过程。电镜结果显示，随着窒息程度的加重，胃肠粘膜细胞出现一系列改变，如:绒毛脱落，杯状细胞变性，线粒体肿胀渐加重，核膜肿胀并破裂，细胞核碎裂，出现凋亡小体，同时细胞变性渐加重。因此，我们认为，细胞凋亡参与了窒息条件下的病理与生理过程[6～8] 。
, 百拇医药
为了进一步阐明细胞凋亡对窒息条件下的胃肠粘膜的作用，我们对标本进行了Fas基因表达水平的检测，结果显示随着窒息程度的加重，Fas基因表达水平逐渐升高，免疫组化结果显示Fas蛋白表达也渐升高，而且与对照组相比，差异具有显著性，此结果表明Fas基因与蛋白可能参与了在窒息条件下胃肠粘膜损伤的生理与病理过程。因此，我们认为，细胞凋亡可能参与了新生儿窒息条件下的胃肠粘膜损伤的生理与病理过程，Fas基因与蛋白可能参与了这一过程 [9，10] 。
总之，本研究表明窒息条件下胃肠粘膜损伤过程中，细胞凋亡起到一定的作用，而且Fas基因与蛋白参与了在窒息条件下胃肠粘膜损伤的生理与病理过程。揭示新生儿窒息后胃轻瘫、腹胀及出血性坏死性小肠、结肠炎等的病理改变机制，在临床过程中，要想到凋亡对胃肠粘膜的影响，我们的研究对指导临床新生儿窒息诊治具有重要的意义。
参考文献
1 Majno-G，Joris-I.Apoptosis，oncosis and necrosis.An overviewof cell death.Am-J-pathol，1995，146(1):3-15.
, 百拇医药
2 J Sambrook E.F.Fritsch T.Maniatis.Molecular Cloning，A Laboratory Mannual.2 nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，200-380.
3 Charriaut-Marlangue C，Margaill-I，Represa-A，et al.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:an in situ DNA fragmentation analysis.J-Cereb-Blood-Flow-Metab，1996，16(2):186-194.
4 Darzynkiewicz，Bruno S，Bino G D，et al.Features of apoptosic cell meaˉsured by flow cytometry.Cytometry，1994，19:26.
, 百拇医药
5 Potten-CS.Stem cells in gastrointestinal epithelium:numbers，characˉteristics and death.Philos-Trans-R-Soc-Lond-B-Biol-Sci，1998，353(1370):821-830.
6 Ikeda-H，Suzuki-Y，Suzuki-M et al.Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischaemia and ischaemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium.Gut，1998，42(4):530-537.
7 Noda-T，Iwakiri-R，Fujimoto-K，et al.Programmed cell death inˉduced by is chemia-reperfusion in rat intestinal mucosa.Am-J-Physˉiol，1998，274(2):270-276.
, 百拇医药
8 Sun-Z，Wang-X，Wallen-R，et al.The influence of apoptosis on inˉ testinal barrier integrity in rats.Scand-J-Gastroenterol，1998，33(4):415-422.
9 孙梅，韩玉昆.新生儿窒息对消化系统的影响.国外医学.儿科分册，1995，22(1):27-30.
10 Fenton-RG，Hixon-JA，Wright-PW，et al.Inhibition of Fas(CD95)expression and Fas-mediated apoptosis by oncogenic Ras.Canˉcer-Res，1998，58(15):3391-3400.
作者单位:1 100036北京空军总医院儿科
2 第四军医大学动物实验室
(编辑 小川), http://www.100md.com(李侠)
关键词 SD大鼠 窒息模型 细胞凋亡 胃肠粘膜 打点杂交
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1774-03
Studies on the function of gastrointestinal mucous
, 百拇医药
membrane’s injury by cell apotosis under the
condition of asphyxia of newborned SD rats
Li Xia，YinJiao，Liu Xiaoyu，et al.
Department of Pediatrics，Air Force General Hospital，Beijing100036.
【Abstract】 Objective To clarify cell appotosis on the effect of injures of gastrointestinal mucous membrane under the condition of asphyxia of newborned SD rats.Methods To establish asphyxia models of low degree，moderate degree and severe degree of SD，collected samples of gastric mucous membranes，and by using electroscope and DNA electrophoresis to examine cell appotosis;by using RNA dot blot and immunohistochemistry to examine expressed levels of fas gene and FAS protein.Results Established successfully asphyxoia mode of low degree、moderate degree and seˉvere degree of SD rats;cell appotosis was confirmed by electroscope and DNA electrophoresis;expressed levels of fas in asphyxoia mode of low degree，moderate degree and severe degree of SD rats were increasing gradually by RNA dot blot;protein level of FAS in asphyxoia mode of low degree，moderate degree and severe degree of SD rats were increasˉing gradually.Conclusion Cell appotosis took part in injury of gastrointestinal mucous membrane under condition of asphyxia;expressed levels of fas and FAS under the condition of asphyxia of newborned SD rats were increasing graduˉally.
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Key words SD rat asphyxia model cell apoptosis gastrointestinal mucous membrane dot blot
细胞凋亡参与多种疾病的发生过程 [1] 。新生儿窒息是临床常见的疾病，常导致胃肠粘膜的损害，脑组织的缺血缺氧等。近2年文献报道细胞凋亡参与胃肠粘膜的损害，但窒息条件下，细胞凋亡是否参与胃肠粘膜的损害?本研究以新生SD大鼠建立轻、中、重度窒息模型，模拟新生儿窒息条件，采集胃肠粘膜标本进行研究，来探讨细胞凋亡在新生SD大鼠窒息条件下对胃肠粘膜损伤的影响以及对新生儿窒息胃肠粘膜损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 新生SD大鼠20只，重120～140g，购自本院动物实验中心;化学试剂购自华美公司;α- 32 pdATP购自北京福瑞公司;免疫组化试剂购自GIBCO公司;FAS质粒由崔大祥博士提供。
, 百拇医药
1.2 方法 (1)窒息模型的建立:取SD大鼠20只，随机编号为1～20号，分成轻度、中、重度及正常对照4组，即1～5号为轻度窒息组，6～10号为中度窒息组，11～15号为重度窒息组，16～20号为正常对照组。40mg/kg苯巴比妥麻醉，气管插管，气管阻塞1/2为轻度窒息模型，气管阻塞2/3为中度窒息模型，气管完全阻塞为重度窒息模型。各取15min、60min时的胃肠组织，分离出胃肠粘膜，-20℃保存。(2)组织DNA与RNA的提取及RNA打点杂交按分子克隆 [2] 说明进行。DNA电泳按文献 [3] 进行。(3)病理切片的制作按文献 [4]进行。免疫组化染色按说明进行。电镜标本按要求制作。
2 结果
2.1 DNA电泳结果 轻度窒息组无凋亡带形出现;中度窒息组60min时出现凋亡带形;重度窒息组15min、60min时皆出现凋亡带形，正常对照无凋亡带形出现(见图1)。
, 百拇医药
2.2 电镜结果 轻度窒息组:15min时的细胞结构未见异常改变，60min时的细胞结构中线粒体稍肿胀，细胞核等其它细胞器无明显结构改变。中度窒息组:15min时的细胞稍水肿，线粒体稍肿胀，细胞核膜稍肿胀，余未见明显异常改变;60min时的细胞肿胀，线粒体崩溃，细胞核膜碎裂，细胞核碎裂，核碎片边集，出现凋亡小体。重度窒息组:15min时的细胞肿胀，线粒体肿胀，细胞核肿胀，核碎片边集，出现凋亡小体;60min时的细胞变性坏死，线粒体崩溃，细胞核碎裂，核碎片边集，出现凋亡小体;正常对照无结构改变(见图2)。
2.3 RNA打点杂交结果 见图3。轻度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达无明显改变。中度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达比轻度窒息组明显升高;重度窒息组:15min、60min时的Fas基因表达比轻度窒息组明显升高，比中度窒息组升高，两组之间差异存在显著性(P<0.01);正常对照组有轻度Fas基因表达。上排为60min，下排为15min。
, 百拇医药
2.4 免疫组化染色结果 见图4。轻度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达无明显改变;中度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达比轻度窒息组明显升高;重度窒息组:15min、60min时的Fas蛋白表达比轻度窒息组明显升高，两组之间差异存在显著性(P<0.01)，比中度窒息组升高，但无统计学意义;正常对照组无阳性染色。图1 DNA电泳结果1正常对照组;2 重度窒息组60min;3 重度窒息组15min;4 中度窒息组60min
图2 重度窒息组电镜结果略
图3 RAN打点杂交结果略
图4 中度窒息组免疫组化染色结果棕色处为Fas蛋白阳性染色略
3 讨论
细胞凋亡是基因控制下的细胞自杀性死亡，以细胞DNA降解为特征，是细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，参与了多种临床疾病的形成过程，具有广泛的生理病理意义[5] 。本研究通过建立轻、中、重度窒息模型，模拟新生儿窒息条件，借助组织学与分子生物学技术来研究细胞凋亡在窒息条件下对胃肠粘膜的作用及其意义，DNA电泳及FCMS结果表明，中度窒息60min及重度窒息15min、60min时皆可出现细胞凋亡，表明细胞凋亡参与窒息的病理生理过程。电镜结果显示，随着窒息程度的加重，胃肠粘膜细胞出现一系列改变，如:绒毛脱落，杯状细胞变性，线粒体肿胀渐加重，核膜肿胀并破裂，细胞核碎裂，出现凋亡小体，同时细胞变性渐加重。因此，我们认为，细胞凋亡参与了窒息条件下的病理与生理过程[6～8] 。
, 百拇医药
为了进一步阐明细胞凋亡对窒息条件下的胃肠粘膜的作用，我们对标本进行了Fas基因表达水平的检测，结果显示随着窒息程度的加重，Fas基因表达水平逐渐升高，免疫组化结果显示Fas蛋白表达也渐升高，而且与对照组相比，差异具有显著性，此结果表明Fas基因与蛋白可能参与了在窒息条件下胃肠粘膜损伤的生理与病理过程。因此，我们认为，细胞凋亡可能参与了新生儿窒息条件下的胃肠粘膜损伤的生理与病理过程，Fas基因与蛋白可能参与了这一过程 [9，10] 。
总之，本研究表明窒息条件下胃肠粘膜损伤过程中，细胞凋亡起到一定的作用，而且Fas基因与蛋白参与了在窒息条件下胃肠粘膜损伤的生理与病理过程。揭示新生儿窒息后胃轻瘫、腹胀及出血性坏死性小肠、结肠炎等的病理改变机制，在临床过程中，要想到凋亡对胃肠粘膜的影响，我们的研究对指导临床新生儿窒息诊治具有重要的意义。
参考文献
1 Majno-G，Joris-I.Apoptosis，oncosis and necrosis.An overviewof cell death.Am-J-pathol，1995，146(1):3-15.
, 百拇医药
2 J Sambrook E.F.Fritsch T.Maniatis.Molecular Cloning，A Laboratory Mannual.2 nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，200-380.
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, 百拇医药
5 Potten-CS.Stem cells in gastrointestinal epithelium:numbers，characˉteristics and death.Philos-Trans-R-Soc-Lond-B-Biol-Sci，1998，353(1370):821-830.
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8 Sun-Z，Wang-X，Wallen-R，et al.The influence of apoptosis on inˉ testinal barrier integrity in rats.Scand-J-Gastroenterol，1998，33(4):415-422.
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作者单位:1 100036北京空军总医院儿科
2 第四军医大学动物实验室
(编辑 小川), http://www.100md.com(李侠)