青蒿琥酯抗乙型肝炎病毒体外实验研究
【摘要】 目的 通过体外实验，探讨青蒿琥酯抗乙型肝病毒(HBV)的作用。方法 将青蒿琥酯作用于HBV DNA转染细胞系2.2.15细胞，MTT法检测细胞活力，ELISA法检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg的变化，从而评价青蒿琥酯抗乙肝病毒的效果并探讨其药理机理。结果 青蒿琥酯对2.2.15细胞株的半抑制活性浓度(即毒性浓度)T C 50 =2.9166，对2215细胞分泌HBsAg、HBeAg的半抑制浓度分别是IC 50 =0.39、IC 50 =0.803，治疗指数(TI=T C 50 /IC 50 )分别为7.478、3.63均>2。结论 青蒿琥酯在体外有一定的抗乙肝病毒作用，且有量效关系。
关键词 青蒿琥酯 乙型肝炎病毒 体外实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1795-02
, 百拇医药
Inhibitory effect of artesunate on HBV in vitro
Yan Lianping，Ma Li，Zhang Shulian，et al.
Center of Infectious Disease，No.458Hospital of PLA，Guangzhou 510602.
【Abstract】 Objective To estimate the anbti-HBV effect of Artesunate.Methods Using the Artesunate to treat2215cell in vitro，observing the activity of the cell with MTT，examining the variety of HBsAg or HBeAg by ELISA.Results TC 50 =2.9166，IC 50 =0.39with of HBsAg，IC 50 =0.803with of HBeAg.Therapeutic Index(TI)>2.Conclusion Artesunate is effective in inhibiting HBV replication in vitro.
, 百拇医药
Key words artesunate HBV in vitro
青蒿琥酯是为克服青蒿素治疗剂量大、复发率高、水油中溶解度小等缺点，对青蒿素进行结构改造后的水溶性青蒿素类抗疟药，它也是我国首创的新型抗疟疾病药，具有高效、速效、低毒以及与氯喹无交叉抗疟疾的特点，被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗疟疾药。2.2.15细胞株是体外筛选抗乙肝病毒良好的细胞模型，Sells等人1987年用共转染法将HBV DNA导入肝癌细胞株HepG2，实现了HBV在体外的成功表达并能分泌完整的HBV颗粒 [1] 。笔者以2.2.15细胞株为模型，对青蒿琥酯的体外抗HBV作用进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 青蒿琥酯注射液 60mg/瓶，附溶剂碳酸氢钠注射液1ml/支，广西桂林第二制药厂;培养液:DMEM(含200μg/ml G418)，2，3-二苯基溴化四唑(MTT)均由美国Sigma公司出品;10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司出品);2.2.15细胞株(北大医院病毒室);HBsAg、HBeAg检测试剂盒(华美生物工程公司出品);ELx800全自动酶标仪(产地美国)。
, http://www.100md.com
1.2 2.2.15分泌动力学的测定 将2.2.15细胞按4×10 4 个/ml浓度接种于96孔板，0.1ml/孔，5%CO 2 、37℃培养，每隔2天收集一次培养上清，-20℃贮存，总共收集到14天。统一用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，结果以P/N值表示，见图1。
1.3 药物体外抗-HBV病毒活性的测定及MTT法对2.2.15细胞活力的测定 [2] 将2.2.15细胞按4×10 4 个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板，0.1ml/孔，5%CO 2 、37℃培 养至第3天，弃去培养液，换以含有不同浓度药物的培养基，每个浓度4孔，共设4个浓度，另设不加药物的细胞组作对照。药物作用第4天(培养6天)换以相同浓度的药液，继续培养，第4天(培养9天)，收取培养上清(-20℃储存，统一用ELISA法测HBsAg、HBeAg);加入MTT0.15mg/ml，100μl/孔，培养4h后，弃上清液，加二甲亚砜(DMSO)100μl/孔，振荡器混匀，酶标仪读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。细胞抑制率=[(对照组OD-实验组OD)/对照组OD]×100%。
, 百拇医药
1.4 药物作用后细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg的测定 均采用ELISA法，按试剂盒说明书操作，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，测定波长450nm，参考波长630nm。P/N=实验孔OD/阴性对照OD，P/N≥2.1为阳性;抑制率=[(对照P/N-实验P/N)/(对照P/N-2.1)]×100% [2] 。
2 结果
2.1 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌动力学 2.2.15细胞于第2天开始有HBsAg、HBeAg分泌，以后逐渐增加，第8天分泌值最高，可持续检测至14天。见图1。
图1 2215细胞HBsAg、HBeAg分泌动力学略
2.2 药物对细胞的毒性作用 采用统计学直线回归方程，y=a+bx换算得半抑制(毒性)浓度(TC 50 )=2.9166，r=0.996，且有量效关系。见表1。
, 百拇医药
2.3 青蒿琥酯体外抗病毒作用 采用统计学直线回归方程y=a+bx换算得HBsAg、HBeAg的抑制浓度分别是IC 50 =0.39、0.803，治疗指数(TI=TC 50 /IC 50 )分别是TI=7.478，3.63均>2，见表2。
表1 青蒿琥酯对2.2.15细胞毒性(抑制)的影响略
表2 青蒿琥酯抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响略
3 讨论
2.2.15细胞在含G418的培养条件下，能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒，笔者先检测了2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的生长规律，为本实验选择药物作用时间奠定了基础。
MTT比色法主要原理在于检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力，细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能 [3] ，它在一定程度上反映了细胞的生存活力。以此数据换算所得的TC 50 比传统方法肉眼镜下观察、判断细胞破坏程度的浓度，更客观、可信。
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表1、表2显示，青蒿琥酯对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的半抑制浓度分别是IC 50 =0.39、IC 50 =0.803、对2215细胞株的半抑制活性浓度(即毒性浓度)TC 50 =2.9166，治疗指数(TI=TC 50 /IC 50 )均>2。提示，青蒿琥酯在体外有一定的抗乙肝病毒作用，且有量效关系。
几千年前我国就将提炼青蒿素的艾蒿作为抗疟疾药使用。青蒿素之所以能控制疟疾，是因为它能够与疟疾原虫内部的高浓度铁发生反应。铁是DNA、RNA和蛋白质合成 必须的辅助因子，HBV感染细胞后就可能利用细胞的蛋白质和核酸合成机制及有代谢活性的细胞铁进行病毒复制 [4] 。有研究表明 [5] 血清铁或铁蛋白升高更易成为乙型肝炎病毒的慢性携带者，由此推测，青蒿琥酯抗乙肝病毒的作用机理是否类似于抗疟疾，有待进一步实验证实。而青蒿琥酯作为老药新用，即拓展了该药的市场，更是乙肝患者的福音。
, 百拇医药
参考文献
1 赵建勤，杨明，赵连三，等.扯根菜及其提取物抗乙型肝病毒体外实验研究.中西医结合肝病杂志，2002，12(1):26-27.
2 孟忠吉，张全荣，杨丽华，等.核酶在2.2.15细胞内抗乙肝病毒作用.中西医结合肝病杂志，2002，12(4):221-224.
3 司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版西安公司，1996，186.
4 李晓东.夏瑾瑜，陈盛铎，等.慢性乙型肝炎患者血清锌铁水平临床观察.中西医结合肝病杂志，2001，12(1):17-20.
5 Antonino N，Idier H，Nicole H，et al.Left Ventricular Fibrosis in Renoˉvascular Hypertensive Rats.Hypertension，1995，26:101.
作者单位:1 510602广州解放军第458医院传染病中心分子生物学科
2 沈阳军区空军后勤部卫生防疫队
(编辑 李年令), 百拇医药(杨联萍 马力 张淑莲 张亚红 孔祥平)
关键词 青蒿琥酯 乙型肝炎病毒 体外实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1795-02
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Inhibitory effect of artesunate on HBV in vitro
Yan Lianping，Ma Li，Zhang Shulian，et al.
Center of Infectious Disease，No.458Hospital of PLA，Guangzhou 510602.
【Abstract】 Objective To estimate the anbti-HBV effect of Artesunate.Methods Using the Artesunate to treat2215cell in vitro，observing the activity of the cell with MTT，examining the variety of HBsAg or HBeAg by ELISA.Results TC 50 =2.9166，IC 50 =0.39with of HBsAg，IC 50 =0.803with of HBeAg.Therapeutic Index(TI)>2.Conclusion Artesunate is effective in inhibiting HBV replication in vitro.
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Key words artesunate HBV in vitro
青蒿琥酯是为克服青蒿素治疗剂量大、复发率高、水油中溶解度小等缺点，对青蒿素进行结构改造后的水溶性青蒿素类抗疟药，它也是我国首创的新型抗疟疾病药，具有高效、速效、低毒以及与氯喹无交叉抗疟疾的特点，被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗疟疾药。2.2.15细胞株是体外筛选抗乙肝病毒良好的细胞模型，Sells等人1987年用共转染法将HBV DNA导入肝癌细胞株HepG2，实现了HBV在体外的成功表达并能分泌完整的HBV颗粒 [1] 。笔者以2.2.15细胞株为模型，对青蒿琥酯的体外抗HBV作用进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 青蒿琥酯注射液 60mg/瓶，附溶剂碳酸氢钠注射液1ml/支，广西桂林第二制药厂;培养液:DMEM(含200μg/ml G418)，2，3-二苯基溴化四唑(MTT)均由美国Sigma公司出品;10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司出品);2.2.15细胞株(北大医院病毒室);HBsAg、HBeAg检测试剂盒(华美生物工程公司出品);ELx800全自动酶标仪(产地美国)。
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1.2 2.2.15分泌动力学的测定 将2.2.15细胞按4×10 4 个/ml浓度接种于96孔板，0.1ml/孔，5%CO 2 、37℃培养，每隔2天收集一次培养上清，-20℃贮存，总共收集到14天。统一用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，结果以P/N值表示，见图1。
1.3 药物体外抗-HBV病毒活性的测定及MTT法对2.2.15细胞活力的测定 [2] 将2.2.15细胞按4×10 4 个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板，0.1ml/孔，5%CO 2 、37℃培 养至第3天，弃去培养液，换以含有不同浓度药物的培养基，每个浓度4孔，共设4个浓度，另设不加药物的细胞组作对照。药物作用第4天(培养6天)换以相同浓度的药液，继续培养，第4天(培养9天)，收取培养上清(-20℃储存，统一用ELISA法测HBsAg、HBeAg);加入MTT0.15mg/ml，100μl/孔，培养4h后，弃上清液，加二甲亚砜(DMSO)100μl/孔，振荡器混匀，酶标仪读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。细胞抑制率=[(对照组OD-实验组OD)/对照组OD]×100%。
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1.4 药物作用后细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg的测定 均采用ELISA法，按试剂盒说明书操作，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，测定波长450nm，参考波长630nm。P/N=实验孔OD/阴性对照OD，P/N≥2.1为阳性;抑制率=[(对照P/N-实验P/N)/(对照P/N-2.1)]×100% [2] 。
2 结果
2.1 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌动力学 2.2.15细胞于第2天开始有HBsAg、HBeAg分泌，以后逐渐增加，第8天分泌值最高，可持续检测至14天。见图1。
图1 2215细胞HBsAg、HBeAg分泌动力学略
2.2 药物对细胞的毒性作用 采用统计学直线回归方程，y=a+bx换算得半抑制(毒性)浓度(TC 50 )=2.9166，r=0.996，且有量效关系。见表1。
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2.3 青蒿琥酯体外抗病毒作用 采用统计学直线回归方程y=a+bx换算得HBsAg、HBeAg的抑制浓度分别是IC 50 =0.39、0.803，治疗指数(TI=TC 50 /IC 50 )分别是TI=7.478，3.63均>2，见表2。
表1 青蒿琥酯对2.2.15细胞毒性(抑制)的影响略
表2 青蒿琥酯抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响略
3 讨论
2.2.15细胞在含G418的培养条件下，能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒，笔者先检测了2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的生长规律，为本实验选择药物作用时间奠定了基础。
MTT比色法主要原理在于检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力，细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能 [3] ，它在一定程度上反映了细胞的生存活力。以此数据换算所得的TC 50 比传统方法肉眼镜下观察、判断细胞破坏程度的浓度，更客观、可信。
, http://www.100md.com
表1、表2显示，青蒿琥酯对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的半抑制浓度分别是IC 50 =0.39、IC 50 =0.803、对2215细胞株的半抑制活性浓度(即毒性浓度)TC 50 =2.9166，治疗指数(TI=TC 50 /IC 50 )均>2。提示，青蒿琥酯在体外有一定的抗乙肝病毒作用，且有量效关系。
几千年前我国就将提炼青蒿素的艾蒿作为抗疟疾药使用。青蒿素之所以能控制疟疾，是因为它能够与疟疾原虫内部的高浓度铁发生反应。铁是DNA、RNA和蛋白质合成 必须的辅助因子，HBV感染细胞后就可能利用细胞的蛋白质和核酸合成机制及有代谢活性的细胞铁进行病毒复制 [4] 。有研究表明 [5] 血清铁或铁蛋白升高更易成为乙型肝炎病毒的慢性携带者，由此推测，青蒿琥酯抗乙肝病毒的作用机理是否类似于抗疟疾，有待进一步实验证实。而青蒿琥酯作为老药新用，即拓展了该药的市场，更是乙肝患者的福音。
, 百拇医药
参考文献
1 赵建勤，杨明，赵连三，等.扯根菜及其提取物抗乙型肝病毒体外实验研究.中西医结合肝病杂志，2002，12(1):26-27.
2 孟忠吉，张全荣，杨丽华，等.核酶在2.2.15细胞内抗乙肝病毒作用.中西医结合肝病杂志，2002，12(4):221-224.
3 司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版西安公司，1996，186.
4 李晓东.夏瑾瑜，陈盛铎，等.慢性乙型肝炎患者血清锌铁水平临床观察.中西医结合肝病杂志，2001，12(1):17-20.
5 Antonino N，Idier H，Nicole H，et al.Left Ventricular Fibrosis in Renoˉvascular Hypertensive Rats.Hypertension，1995，26:101.
作者单位:1 510602广州解放军第458医院传染病中心分子生物学科
2 沈阳军区空军后勤部卫生防疫队
(编辑 李年令), 百拇医药(杨联萍 马力 张淑莲 张亚红 孔祥平)