应用FCM监测肾移植患者颗粒酶B、穿孔素表达的临床意义
【摘要】 目的 探讨肾移植患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素的表达与急性排斥反应的关系。方法 用流式细胞分析仪(FCM)动态监测慢性透析(n=26)、急性排斥反应(n=12)、肾功能延迟恢复(n=10)、肾功能稳定(n=18)组患者的外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达差异和急性排斥反应的关系。结果 ①肾移植术后患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达强度由强到弱依次为急性排斥组、肾功正常组和肾功延迟恢复组。且急性排斥组与其余三组差异有显著性(P<0.05);②其升高时间比临床上出现急性排斥的症状早3天左右。随着急性排斥反应的逆转，其表达也逐渐降低至原有基础水平附近。结论 监测肾移植患者外周血淋巴细胞(PBLC)颗粒酶B、穿孔素的表达是一种有价值的、无创性的急性排斥反应的标志物，不仅有助于急性排斥反应的早期诊断，并可用来评价抗排斥治疗是否有效的手段之一。
关键词 肾移植 颗粒酶B 穿孔素 急性排斥反应 流式细胞分析仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0973-03
, http://www.100md.com
The clinic significance of expression of perforin、granzyme B in renal transplantation
Tian Puxun，Zhao Yubo，Xue Wujun，et al.
Department of Renal Transplantation，First Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an710061.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of the expression of granzyme B and perforin in periphˉeral blood mononuclear cells(PBMC)with acuterejection in renal transplantation.Methods 40cases were renal alloˉgraft recipients，26cases were hemodialysis patients，The expression of granzyme B and perforin of periphereal blood mononuclear cells(PBMC)was studied by FCM.All recipients were divided into four groups:graup1:chronic hemodialysis(n=26)，native control;group2:Acute rejection(n=12);group3:delayed graft function(n=10);group4:stable function(n=18).Results ①Acute rejection group of granzyme B and perforin showed significantly higher than that of other three groups(P<0.05).②The expression increased very distinictive in those who had an aˉcute rejection crisis，and they increased about3days earlier than the appearance of clinical symptoms.Granzyme B and perforin expression could be used as a diagnostic tool for a
, 百拇医药
cute rejection with much favorable sensitivity(75.00%)and specificity(92.86%).Conclusion The detective expression of granzyme B and perforin was beneficial for the evaluˉation of immunological state in renal allograft recipients.This non-invasive method can be used as clinical diagnosis clinical therapeutic evaluat
ion of acute rejection.
Key words renal transplantation granzyme B perforin acute rejection FCM
, http://www.100md.com
随着组织配型、器官保存技术改进，外科技术日益成熟，新型免疫抑制剂的临床应用和移植术后管理经验的丰富，肾脏移植术后人/肾存活率得到了显著的提高，然而排斥反应仍是影响移植肾存活的主要因素。近年来细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化标志物与器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)的关系在临床上引起愈来愈多学者的重视，但有关于简便实用，非侵入性检查早期诊断急性排斥反应并及时治疗仍是移植界探讨的热点 [1～2] ;急性排斥(AR)是肾移植术最常见的排斥反应，发生率约为30%～50%，且极易导致急性和(或)慢性移植物失功 [2，4] ，故AR的早期诊断，及时治疗及疗效评估就显得尤为重要。
我们采用流式细胞分析仪对2001年2月～2002年2月在我院接受肾移植40例患者的外周血淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B的表达进行动态监测，观察肾移植患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达在早期诊断急性排斥及评估其治疗效果中的临床价值。现报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 患者共66例(男44例，女22例)，年龄20～52岁(平均35.5岁)，其中原发病:慢性肾小球肾炎55例，多囊肾5例，慢性肾盂肾炎4例，紫癜性肾炎2例;所有患者分为四组，急性排斥组(acute rejection，AR，n=12)、肾功延迟恢复组(delayed graft function，DGF，n=10)、肾功能组(stable renal allograft recipient，SRAR，n=18)、慢性透析组
(chronic hemodialysis，n=26)(见表1)。急性排斥患者手术后时间为1～4个月，平均2.23个月。肾功延迟恢复组术后移植肾功能恢复至正常的时间为2～6周，平均2.4周，DGF时采用小剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)+MMF+生物免疫抑制剂(OKT3或抗CD25单克隆抗体)方案。慢性透析组平均透析时间12.45个月(2～19个月)，每周血液透析1～3次，效果稳定。所有病例均接受诱导性和维持性免疫抑制方案，环孢素A(CsA)+霉酚酸酯(MMF)+强的松(Pred)和他可莫司(FK506)+MMF+Pred，其中3例免疫抑制剂方案由CsA+MMF+Pred切换为FK506+MMF+Pred后急性排斥逆转。 表1 临床分组(略)
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1.2 方法
1.2.1 急性排斥反应的诊断 依据临床表现、实验室检查、影像检查、病理活检等并排除其他原因造成的移植肾功能异常，如环孢素肾中毒、急性肾小管坏死、移植肾感染等。移植肾病理诊断标准参照Banff Classification(Banff1997)国际分类标准。
1.2.2 采血方法 采集外周静脉血3ml，注入装有0.4%EDTA200μl的试管中，加盖的轻轻摇匀，使血液抗凝。
1.2.3 实验步骤 应用聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，向Per+试管中加入2%甲醛缓冲 液(pH7.2～7.4)混合30min，以1000r/min离心5min，弃去上清。再加入2μg/ml的抗Per的单抗2μl，抗Per的单抗是由美国Ancell公司生产[Monoclonal anti-human perforin/FITC;CATALOG#:358-040]，置冰上孵育45min，然后用2%甲醛缓冲液(pH7.2～7.4)洗涤一次。在鞘液中混匀后立即分析，或者加入0.5ml的1%甲醛，2℃～8℃避光保存，24h内上机分析。(本实验使用美国COULTER公司生产的EPICS ELITE流式细胞分析仪);在GrB+试管中加入抗GrB的单抗1μl(抗GrB的单抗是由瑞士APOITECH生产[Monoˉclonal Antibody to Granzyme B/FITC(human);CATALOG#:804-121f-T100])，冰上孵育30min。用PBS液洗涤，弃去上清。鞘液中混匀后立即分析，或者加入0.5ml的1%甲醛，2℃～8℃避光保存，24h内上机分析。GrB-试管的操作步骤基本同GrB+试管，但不加入抗GrB的单抗。
, 百拇医药
1.2.4 统计学处理 实验数据采用SPSS10.0统计分析软件分析。先进行各组数据的正态性检验。随后进行每组均数间的方差显著性分析。
2 结果
2.1 肾移植术后患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素的表达强度由强到弱依次为急性排斥组，肾功正常组和肾功延迟恢复组 见表2。表2 不同组别患者外周血穿孔素、颗粒酶B的表达(略)注:慢性透析组:chronic hemodialysis，CHD;肾功正常组:stable renal allograft recipient，SRAR;急性排斥组:acute rejection，AR;肾功延迟恢复组:delay graft functio
n，DGF
将临床分组的分别标为:(1)急性排斥组(AR);(2)延迟恢复组(DGF);(3)肾功正常组(SRAR);(4)慢性透析组(CHD)，可将以上的两个表转换为下表:(略)
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2.2 穿孔素、颗粒酶B的表达与急性排斥反应的关系 (1)肾移植术后发生急性排斥的患者，其穿孔素和颗粒酶B的表达与术前相比有明显的升高，其穿孔素表达较慢性透析组、肾功正常组、延迟恢复组分别升高2.55、1.77、1.78倍，其颗粒酶B表达较慢性透析组、肾功正常组、延迟恢复组分别升高1.57、1.84、1.81倍。95%可信区间为(穿孔素%)9.9092～12.4442和(颗粒酶B%)0.6848～1.2952。(2)PBL穿孔素、颗粒酶B表达升高的时间比临床上出现急性排斥的症状早3天左右;急性排斥患者经MP/OKT 3 冲击治疗后5～10天内，随着排斥反应的逆转，其PBL穿孔素和颗粒酶B的表达也逐渐降低至有基础水平附近。(3)PBL穿孔素和颗粒酶B的表达具有一定的相关性，因此可以联合监测这两个指标，以增加其用于早期诊断的准确性和敏感性。(单用穿孔素为诊断指标，其灵敏度为83.33%;特异度为78.57%。单用颗粒酶B为诊断标准，其灵敏度83.33%;特异度为82.14%。使用穿孔素和颗粒酶B进行联合检测，其灵敏度为75.00%;特异性为92.86%)。表3 急性排反应时患者外周血穿孔素、颗粒酶B的表达比较 (略)
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3 讨论
目前认为，移植肾急性排斥反应(AR)的发生机制主要是细胞免疫应答，即CD +4 Th细胞和CD +8 TC细胞(细胞毒性T淋巴细胞，CTL)是主要的效应细胞，CTL发挥其细胞毒性作用可能通过两个彼此独立的途径，其一是增加穿孔素、颗粒酶B的表达，即杀伤细胞识别靶细胞后，排放其特有的杀伤颗粒，诱导细胞凋亡，杀伤颗粒中穿孔素通过在靶细胞膜上打孔，内渗致细胞死亡，同时颗粒酶B进入细胞引起DNA裂解;只有活化的杀伤性淋巴细胞才能有Perforin、Granzyme B的表达，它是活化的杀伤性淋巴细胞的标志性分子之一;该分子在器官移植急性排斥发应时其表达水平明显升高 [2，4，5] ，而肿瘤的病人中其表达水平低或不表达，目前这方面已作为肿瘤治疗的新切入点 [6] ;其二是Fas L的表达，Fas L与靶细胞表面的Fas L抗原结合，引起靶细胞和CTL的自身凋亡。移植肾急性排斥反应与穿孔素、颗粒酶B的表达的关系:临床上诊断移植肾病变最可靠的方法为组织学活检，AR时CTL的活化较形态学改变出现的更早，故找寻无创伤性、灵敏度高、准确的检查以判断移植肾AR时CTL的活化指标就显得尤为重要 [5，7，8] 。
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本研究采用流式细胞分析仪动态监测肾移植术后患者外周血淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B的表达。结果显示，肾移植术后发生急性排斥的患者其穿孔素和颗粒酶B的表达与术前相比有明显的升高，PBL穿孔素和颗粒酶B的表达具有一定的相关性，可以联合监测这两个指标，以增加其用于早期诊断的敏感性和特异性。当存在急性排斥反应时，它们的表达将会有明显的升高，而且这种升高早于临床出现急性排斥症状3天左右。因此，我们认为在动态监测PBL穿孔素、颗粒酶B表达的过程中，当其表达较基础值升高50%以上时，就应密切结合临床有无高敏患者、有无高危因素，如多次移植、既往发生过急性排斥反应、应用可降低FK506及CsA药物浓度的药物(如利福平、丙戊酸钠、安定等)等，应动态监测尿中淋巴细胞，必要时行彩色多普勒、ECT、移植肾穿刺等检查。本研究中的12例急性排斥患者PBL颗粒酶B、穿孔素的表达均较原基础值升高1.5倍以上，其中还有10例的PBL颗粒酶B、穿孔素的表达较原基础值升高2～3倍。
在评估抗排斥治疗是否有效方面，PBL颗粒酶B、穿孔素的表达也是一客观、灵敏、有价值的无创指标。本研究中的12例急性排斥患者动态监测PBL颗粒酶B、穿孔素表达的过程中，有1例经抗排斥治疗无效，其颗粒酶B、穿孔素的表达无下降，移植肾功能损害明显，最后切除移植肾;而其余11例患者经全面监测，抗排斥治疗后排斥反应逆转， 且在给予相应的有效治疗后的5～10天内，其表达水平降至原有基础水平或接近于原有基础水平，而此时的移植肾的肾功生化、彩色多普勒检查也恢复正常。
, 百拇医药
移植肾功能延迟恢复(DGF)是肾移植术后的一种常见并发症，其发生相关的危险因素包括供者、受者免疫因素和肾脏保存方法等其他因素，其临床治疗中往往使用低剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)，其血药浓度常低于理想治疗窗浓度范围，急性排斥反应的发生率增加，影响移植物的近期与长期存活率 [9] ，应预防急性排斥反应的发生。本研究中肾功延迟恢复的患者均未发生急性排斥反应，而实验结果也显示其PBL颗粒酶B、穿孔素的表达与肾功立即恢复正常及肾功长期稳定的患者表达情况差异无显著性，与急性排斥组患者的表达有显著差异，这与我们临床治疗DGF时采用小剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)+MMF+生物免疫抑制剂(OKT3或抗CD25单克隆抗体)方案，有效地防止了急性排斥反应的发生有关。
综上所述我们认为:(1)动态监测PBL颗粒酶B、穿孔素的表达是一种早期诊断肾移植患者急性排斥反应的有效方法;(2)动态监测PBL穿孔素、颗粒酶B的表达是一种评估抗排斥治疗疗效的有灵敏、特异、无创性指标之一;(3)监测PBL颗粒酶B、穿孔素的表达对于肾功延迟恢复患者更有临床意义。但是应注意，在诊断急性排斥时需紧密结合临床。
, 百拇医药
参考文献
1 Bernad A，Laurence L，Alberti I.The two-signal model ofT-cell actiˉvation after30gears.Transplantation，2002，73:31.
2 Vasconcellos LM，Schachter AD，Zheng XX.Cytotoxic lymphocyte gene expression in peripheral blood leukocytes correlates with rejecting renal allografts.Transplantation，1998，66(5):562.
3 Higaki Y，Yamado O，Okamura T，et al.Gramzyme B-containing Lymˉphocyte involvement in epidermal injury in graft-versus-host disease.Dermatology，2001，202(2):94-98.
, 百拇医药
4 Hong SW，Jeong HJ，Kim SI，et al.Granzyme B and TIA-1expression in chronicand acute rejection on chronic renal allograft rejection.Yosei Med J，2001，42(3):285-290.
5 Dugre FJ，Gaudreau S，Belles-Isles M，et al.Cytokine and cytotoxic molecule gene expression determined in peripheral blood mononuclear cells in the diagnosis of acute renal rejection.Transplantation，2000，70(7):1074-1080.
6 Li XM，Zeng WS，Zhang YL，et al.Cloning and purification of Human Gran B in E coli.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mill Med Unˉviv)，2002，23(17):1556-1558.
, 百拇医药
7 Pascoe MD，Marshall SE，Welsh KI，et al.Increased accuracy of renal allograft rejection diagnosis using combined perforin，granzyme B，and Fas ligand fine-needle aspiration immunocytology.Transplantation，2000，69(12):2547-2553.
8 Li B，Hartono C，Ding R.Noninvasive diagnosis of renal-allograft reˉjection measurement of mRNA for perforin and granzyme B in urine.N Engl J Med，2001，344(13):947-954.
9 Melaren AJ，Jassen W，Gray DY，et al.Delay graft function:Risk factors andrelative effects of early function and acute rejection on long-term survival incadaveric renal transplantation.Clin Transplant，1999，13(3):266-272.
(收稿日期:2003-09-11)
作者单位:710061西安交通大学第一医院肾移植科
(编辑曲 全), http://www.100md.com(田普训)
关键词 肾移植 颗粒酶B 穿孔素 急性排斥反应 流式细胞分析仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0973-03
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The clinic significance of expression of perforin、granzyme B in renal transplantation
Tian Puxun，Zhao Yubo，Xue Wujun，et al.
Department of Renal Transplantation，First Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an710061.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of the expression of granzyme B and perforin in periphˉeral blood mononuclear cells(PBMC)with acuterejection in renal transplantation.Methods 40cases were renal alloˉgraft recipients，26cases were hemodialysis patients，The expression of granzyme B and perforin of periphereal blood mononuclear cells(PBMC)was studied by FCM.All recipients were divided into four groups:graup1:chronic hemodialysis(n=26)，native control;group2:Acute rejection(n=12);group3:delayed graft function(n=10);group4:stable function(n=18).Results ①Acute rejection group of granzyme B and perforin showed significantly higher than that of other three groups(P<0.05).②The expression increased very distinictive in those who had an aˉcute rejection crisis，and they increased about3days earlier than the appearance of clinical symptoms.Granzyme B and perforin expression could be used as a diagnostic tool for a
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cute rejection with much favorable sensitivity(75.00%)and specificity(92.86%).Conclusion The detective expression of granzyme B and perforin was beneficial for the evaluˉation of immunological state in renal allograft recipients.This non-invasive method can be used as clinical diagnosis clinical therapeutic evaluat
ion of acute rejection.
Key words renal transplantation granzyme B perforin acute rejection FCM
, http://www.100md.com
随着组织配型、器官保存技术改进，外科技术日益成熟，新型免疫抑制剂的临床应用和移植术后管理经验的丰富，肾脏移植术后人/肾存活率得到了显著的提高，然而排斥反应仍是影响移植肾存活的主要因素。近年来细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化标志物与器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)的关系在临床上引起愈来愈多学者的重视，但有关于简便实用，非侵入性检查早期诊断急性排斥反应并及时治疗仍是移植界探讨的热点 [1～2] ;急性排斥(AR)是肾移植术最常见的排斥反应，发生率约为30%～50%，且极易导致急性和(或)慢性移植物失功 [2，4] ，故AR的早期诊断，及时治疗及疗效评估就显得尤为重要。
我们采用流式细胞分析仪对2001年2月～2002年2月在我院接受肾移植40例患者的外周血淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B的表达进行动态监测，观察肾移植患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达在早期诊断急性排斥及评估其治疗效果中的临床价值。现报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 患者共66例(男44例，女22例)，年龄20～52岁(平均35.5岁)，其中原发病:慢性肾小球肾炎55例，多囊肾5例，慢性肾盂肾炎4例，紫癜性肾炎2例;所有患者分为四组，急性排斥组(acute rejection，AR，n=12)、肾功延迟恢复组(delayed graft function，DGF，n=10)、肾功能组(stable renal allograft recipient，SRAR，n=18)、慢性透析组
(chronic hemodialysis，n=26)(见表1)。急性排斥患者手术后时间为1～4个月，平均2.23个月。肾功延迟恢复组术后移植肾功能恢复至正常的时间为2～6周，平均2.4周，DGF时采用小剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)+MMF+生物免疫抑制剂(OKT3或抗CD25单克隆抗体)方案。慢性透析组平均透析时间12.45个月(2～19个月)，每周血液透析1～3次，效果稳定。所有病例均接受诱导性和维持性免疫抑制方案，环孢素A(CsA)+霉酚酸酯(MMF)+强的松(Pred)和他可莫司(FK506)+MMF+Pred，其中3例免疫抑制剂方案由CsA+MMF+Pred切换为FK506+MMF+Pred后急性排斥逆转。 表1 临床分组(略)
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1.2 方法
1.2.1 急性排斥反应的诊断 依据临床表现、实验室检查、影像检查、病理活检等并排除其他原因造成的移植肾功能异常，如环孢素肾中毒、急性肾小管坏死、移植肾感染等。移植肾病理诊断标准参照Banff Classification(Banff1997)国际分类标准。
1.2.2 采血方法 采集外周静脉血3ml，注入装有0.4%EDTA200μl的试管中，加盖的轻轻摇匀，使血液抗凝。
1.2.3 实验步骤 应用聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，向Per+试管中加入2%甲醛缓冲 液(pH7.2～7.4)混合30min，以1000r/min离心5min，弃去上清。再加入2μg/ml的抗Per的单抗2μl，抗Per的单抗是由美国Ancell公司生产[Monoclonal anti-human perforin/FITC;CATALOG#:358-040]，置冰上孵育45min，然后用2%甲醛缓冲液(pH7.2～7.4)洗涤一次。在鞘液中混匀后立即分析，或者加入0.5ml的1%甲醛，2℃～8℃避光保存，24h内上机分析。(本实验使用美国COULTER公司生产的EPICS ELITE流式细胞分析仪);在GrB+试管中加入抗GrB的单抗1μl(抗GrB的单抗是由瑞士APOITECH生产[Monoˉclonal Antibody to Granzyme B/FITC(human);CATALOG#:804-121f-T100])，冰上孵育30min。用PBS液洗涤，弃去上清。鞘液中混匀后立即分析，或者加入0.5ml的1%甲醛，2℃～8℃避光保存，24h内上机分析。GrB-试管的操作步骤基本同GrB+试管，但不加入抗GrB的单抗。
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1.2.4 统计学处理 实验数据采用SPSS10.0统计分析软件分析。先进行各组数据的正态性检验。随后进行每组均数间的方差显著性分析。
2 结果
2.1 肾移植术后患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素的表达强度由强到弱依次为急性排斥组，肾功正常组和肾功延迟恢复组 见表2。表2 不同组别患者外周血穿孔素、颗粒酶B的表达(略)注:慢性透析组:chronic hemodialysis，CHD;肾功正常组:stable renal allograft recipient，SRAR;急性排斥组:acute rejection，AR;肾功延迟恢复组:delay graft functio
n，DGF
将临床分组的分别标为:(1)急性排斥组(AR);(2)延迟恢复组(DGF);(3)肾功正常组(SRAR);(4)慢性透析组(CHD)，可将以上的两个表转换为下表:(略)
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2.2 穿孔素、颗粒酶B的表达与急性排斥反应的关系 (1)肾移植术后发生急性排斥的患者，其穿孔素和颗粒酶B的表达与术前相比有明显的升高，其穿孔素表达较慢性透析组、肾功正常组、延迟恢复组分别升高2.55、1.77、1.78倍，其颗粒酶B表达较慢性透析组、肾功正常组、延迟恢复组分别升高1.57、1.84、1.81倍。95%可信区间为(穿孔素%)9.9092～12.4442和(颗粒酶B%)0.6848～1.2952。(2)PBL穿孔素、颗粒酶B表达升高的时间比临床上出现急性排斥的症状早3天左右;急性排斥患者经MP/OKT 3 冲击治疗后5～10天内，随着排斥反应的逆转，其PBL穿孔素和颗粒酶B的表达也逐渐降低至有基础水平附近。(3)PBL穿孔素和颗粒酶B的表达具有一定的相关性，因此可以联合监测这两个指标，以增加其用于早期诊断的准确性和敏感性。(单用穿孔素为诊断指标，其灵敏度为83.33%;特异度为78.57%。单用颗粒酶B为诊断标准，其灵敏度83.33%;特异度为82.14%。使用穿孔素和颗粒酶B进行联合检测，其灵敏度为75.00%;特异性为92.86%)。表3 急性排反应时患者外周血穿孔素、颗粒酶B的表达比较 (略)
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3 讨论
目前认为，移植肾急性排斥反应(AR)的发生机制主要是细胞免疫应答，即CD +4 Th细胞和CD +8 TC细胞(细胞毒性T淋巴细胞，CTL)是主要的效应细胞，CTL发挥其细胞毒性作用可能通过两个彼此独立的途径，其一是增加穿孔素、颗粒酶B的表达，即杀伤细胞识别靶细胞后，排放其特有的杀伤颗粒，诱导细胞凋亡，杀伤颗粒中穿孔素通过在靶细胞膜上打孔，内渗致细胞死亡，同时颗粒酶B进入细胞引起DNA裂解;只有活化的杀伤性淋巴细胞才能有Perforin、Granzyme B的表达，它是活化的杀伤性淋巴细胞的标志性分子之一;该分子在器官移植急性排斥发应时其表达水平明显升高 [2，4，5] ，而肿瘤的病人中其表达水平低或不表达，目前这方面已作为肿瘤治疗的新切入点 [6] ;其二是Fas L的表达，Fas L与靶细胞表面的Fas L抗原结合，引起靶细胞和CTL的自身凋亡。移植肾急性排斥反应与穿孔素、颗粒酶B的表达的关系:临床上诊断移植肾病变最可靠的方法为组织学活检，AR时CTL的活化较形态学改变出现的更早，故找寻无创伤性、灵敏度高、准确的检查以判断移植肾AR时CTL的活化指标就显得尤为重要 [5，7，8] 。
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本研究采用流式细胞分析仪动态监测肾移植术后患者外周血淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B的表达。结果显示，肾移植术后发生急性排斥的患者其穿孔素和颗粒酶B的表达与术前相比有明显的升高，PBL穿孔素和颗粒酶B的表达具有一定的相关性，可以联合监测这两个指标，以增加其用于早期诊断的敏感性和特异性。当存在急性排斥反应时，它们的表达将会有明显的升高，而且这种升高早于临床出现急性排斥症状3天左右。因此，我们认为在动态监测PBL穿孔素、颗粒酶B表达的过程中，当其表达较基础值升高50%以上时，就应密切结合临床有无高敏患者、有无高危因素，如多次移植、既往发生过急性排斥反应、应用可降低FK506及CsA药物浓度的药物(如利福平、丙戊酸钠、安定等)等，应动态监测尿中淋巴细胞，必要时行彩色多普勒、ECT、移植肾穿刺等检查。本研究中的12例急性排斥患者PBL颗粒酶B、穿孔素的表达均较原基础值升高1.5倍以上，其中还有10例的PBL颗粒酶B、穿孔素的表达较原基础值升高2～3倍。
在评估抗排斥治疗是否有效方面，PBL颗粒酶B、穿孔素的表达也是一客观、灵敏、有价值的无创指标。本研究中的12例急性排斥患者动态监测PBL颗粒酶B、穿孔素表达的过程中，有1例经抗排斥治疗无效，其颗粒酶B、穿孔素的表达无下降，移植肾功能损害明显，最后切除移植肾;而其余11例患者经全面监测，抗排斥治疗后排斥反应逆转， 且在给予相应的有效治疗后的5～10天内，其表达水平降至原有基础水平或接近于原有基础水平，而此时的移植肾的肾功生化、彩色多普勒检查也恢复正常。
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移植肾功能延迟恢复(DGF)是肾移植术后的一种常见并发症，其发生相关的危险因素包括供者、受者免疫因素和肾脏保存方法等其他因素，其临床治疗中往往使用低剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)，其血药浓度常低于理想治疗窗浓度范围，急性排斥反应的发生率增加，影响移植物的近期与长期存活率 [9] ，应预防急性排斥反应的发生。本研究中肾功延迟恢复的患者均未发生急性排斥反应，而实验结果也显示其PBL颗粒酶B、穿孔素的表达与肾功立即恢复正常及肾功长期稳定的患者表达情况差异无显著性，与急性排斥组患者的表达有显著差异，这与我们临床治疗DGF时采用小剂量钙调磷酸酶抑制剂(CsA、FK506)+MMF+生物免疫抑制剂(OKT3或抗CD25单克隆抗体)方案，有效地防止了急性排斥反应的发生有关。
综上所述我们认为:(1)动态监测PBL颗粒酶B、穿孔素的表达是一种早期诊断肾移植患者急性排斥反应的有效方法;(2)动态监测PBL穿孔素、颗粒酶B的表达是一种评估抗排斥治疗疗效的有灵敏、特异、无创性指标之一;(3)监测PBL颗粒酶B、穿孔素的表达对于肾功延迟恢复患者更有临床意义。但是应注意，在诊断急性排斥时需紧密结合临床。
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参考文献
1 Bernad A，Laurence L，Alberti I.The two-signal model ofT-cell actiˉvation after30gears.Transplantation，2002，73:31.
2 Vasconcellos LM，Schachter AD，Zheng XX.Cytotoxic lymphocyte gene expression in peripheral blood leukocytes correlates with rejecting renal allografts.Transplantation，1998，66(5):562.
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(收稿日期:2003-09-11)
作者单位:710061西安交通大学第一医院肾移植科
(编辑曲 全), http://www.100md.com(田普训)