短暂热缺血后低温保存对供心心肌细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 研究常温短暂热缺血后低温保存对供心心肌细胞凋亡的影响。方法应用猪原位心脏移植模型，St.Thomas液灌注和保存供心。实验动物随机分为对照组(C组)和热缺血组(W组)。C组(n=6)低温灌注后切取供心;W组(n=6)供心低温灌注前常温缺血5min。4℃保存4h测定心肌ATP含量。另取低温保存供心行原位心脏移植每组各8例，观察供心移植后早期肌钙蛋白I(cTnI)的漏出水平、心排量(CO)。低温保存4h和再灌注2h，取左心室心肌组织以免疫组化法测定Bcl-2表达，原位末端标记法检测心肌细胞凋亡指数(AI)，同时行电镜超微结构观察。结果 与C组相比，W组供心低温保存后ATP明显低于C组(P<0.05);超微结构改变有一定差别，两组心肌细胞凋亡均不明显。供心移植后，C组供心cTnI漏出少，血流动力学指标好于W组;W组供心心肌细胞结构改变明显，AI明显高于C组(P<0.01)，而Bcl-2表达低于C组(P<0.01)。结论 供心热缺血使心肌细胞能量消耗，诱导再灌注后心肌细胞凋亡增加，在一定程度上导致了供心移植后早期结构和功能的异常。
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关键词 热缺血 供心 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)12-1057-04
Effects of brevity warm ischemia and hypothermic storage on
myocardial apoptosis of donor heart
Hou Wenming，Chi Yifan，Sun Zhongdong，et al.
Qingdao Municipal Hospital，Affiliated Hospital of Medical College，Qingdao University，Qingdao266011.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of warm ischemia and hypothermic storage on myocardial apopˉtosis of donor heart.Methods Pig othortopic heart transplantation models were establisted with donor hearts being arˉrested and preserved by St.Thmoas solution.Pigs were randomed to two groups:group C(control group，n=6)，donor hearts were arrested and stored with4℃Thomas solution.As in group W(warm ischemia group，n=6)，the donor hearts had been undergone5min ischemia at room temperature(28℃)befored being cold arrested and preserved.After4hours，ATP contents in myocardial tissue were measured and ultrastructurewas studied by electron microscope.Anˉother donor hearts.8in each group，wre accepted orthotopic transplantations after4℃storage.Cardiac output(CO)and cTnIleakage after reperfusion were compared between the two groups.The protein expression of Bcl-2were estimated by immunohistochemial and apoptosis index(AI)detected with TUNEL method on myocytes at4h storage and2h after reperfusion.ResultsCompare with group C，heart tissue ATP content is lower in group W after4hs storage(P<0.01).Mild histologic changes were observed in the donor of group W.After transplantation，in group W，CO is lower and cTnI level is higher than those of group C(P<0.05).Apoptosis increased in both two groups after2h reperfusion and much higher in group W(P<0.01)and Bcl-2expression increased significantly in C group(P<0.01).Ultrastrucˉture deteriorates significantly in group W.Conclusion Warm ischemia deplets the energy of the donor heart and inˉduced excess apoptosis on myocytes，especially after reperfusion and resultes in dysfunction of donor heart.
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Key words warm ischemia and reperfusion donor heart apoptosis
供心质量是决定手术效果的重要因素，为了扩大供心来源，对施行心脏移植的供、受体在年龄、体重差异和供心缺血时间等的限制有放宽的趋势，这是否会增加手术风险，影响移植手术的效果还值得做进一步的研究 [1] 。本研究采用猪原位心脏移植模型，观察短暂常温热缺血后低温保存对供心心肌细胞凋亡的影响，为进一步改进供心保护提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 体重50～60kg家猪，雌雄不限。供、受体为同窝生、同性别，体重相差<10%，体重大的作为供体。
1.2 实验分组 根据供心切除前有无常温热缺血，分为对照组(C组)和热缺血组(W组)，均采用4℃St.Thomas液行心肌灌注和保存。W组供心阻断升主动脉，造成常温缺血5min后再灌注保护液。
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1.3 动物模型 实验猪术前禁食12h，氯胺酮10mg/kg肌肉注射，气管插管，麻醉呼吸机控制呼吸，芬太尼、咪唑安定静脉复合及异氟醚吸入维持麻醉 [2] 。心电监测，耳缘静脉穿刺建立输液通路，约50ml/h滴注平衡液。右侧颈内动脉、颈外静脉切开置管，连接换能器和惠普多功能监护仪，连续测定动脉压(AP)和中心静脉压(CVP)。膀胱切开造瘘，插鼻咽部和肛温探头。采用SARNS-7000体外循环机，西京中号鼓泡式氧合器。体外循环预充:每1L0.9NaCl加入KCL1mEq/kg，肝素50mg。稀释后如HCT<25%，加血预充。体外循环流量2.5～3.5L/min，维持平均动脉压(MAP)60mmHg以上，HCT25%左右，肛温30～32℃。停机前HCT30%以上，肛温37℃左右。主动脉开放前不用血管活性药物。胸骨正中切口，心包倒T型切开暴露心脏和大血管。于主动脉根部缝荷包，插连接三通的灌注针头，便于同时监测灌注压。游离上腔静脉(SVC)、主肺动脉间隙，于心包外膈肌上间隙游离下腔静脉(IVC)。游离左半奇静脉在其进入冠状静脉窦处结扎。结扎上腔静脉，心脏跳动10次后于无名动脉起始段阻断升主动脉，灌注4℃Thomas液1000ml，灌注压<80mmHg。切取供心放入500ml Thomas液中4℃保存4h，取左心室全层心肌标本供检测。供心热缺血组先阻断升主动脉5min，再按上述步骤灌注和保存。供心原位移植:麻醉及切口同供体。主动脉远端插供血管，经右房插SVC管，IVC壁直接插直角管，建立体外循环。阻断升主动脉，剪除受体心脏。注意保留房间隔及部分左房后壁，结扎左半奇静脉。分别于房间隔上、下端缝标志牵引线。取低温保存约2.5h两组供心各8枚，移植前再次经主动脉根部灌注心脏保护液500ml，然后行标准术式原位心脏移植。4-0prolene线先从左房心耳处吻合供受体左房及房间隔，5-0prolene线吻合右房，房间隔采用双重缝合。修剪主、肺动脉，4-0prolene线连续缝合主动脉，同时复温至34℃主动脉根部心尖排气，经左心耳插左心引流管，充分排气后开放主动脉。然后用4-0prolene线连续吻合肺动脉。经右房切口置Swan-Ganz管入肺动脉。主动脉开放后，如室颤则行电除颤，若三次电击不复跳，则静注100mg利多卡因后再行电除颤，如仍不复跳则视为手术失败。供心复跳后，如MAP<60mmHg，多巴胺4～8μg/(kg·min)持续泵入。心率<80bpm，行心外膜临时起搏。测定动、静脉压力和心排量。如能脱离体外循环，静注氯化钙1g。心脏开放2h后结束手术。两组供心冷缺血时间分别为235±13min和227±15min，主动脉阻断时间两组差异无显著性。
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1.4 观察指标 供心切取后即刻低温保存4h分别取左心室组织，测定心肌组织ATP含量(化学发光法)，Bcl-2表达(免疫组化SABC法)，心肌细胞凋亡指数(AI)(TUNEL法，试剂盒由北京中山公司提供);同时用JEM-1200EX型透射电镜观察心肌超微结构。心脏移植再灌注后，观察供心复跳情况。分别于再灌注15min、30min、60min、90min、120min抽取血标本，测定血浆肌钙蛋白I(cTnI)(ELISA法，试剂盒由南京强欣公司提供)。脱离体外循环后测定心排量(CO)，再灌注2h取左心室组织测定Bcl-2和AI，电镜观察超微结构。免疫组化和凋亡染色每张切片光镜200倍放大，用北航医学图像分析管理系统(Mias system4.1)观察。随机选取10个视野，分别计数每个视野中的阳性和阴性细胞数，检测阳性染色平均光密度(MOD)。Bcl-2阳性细胞百分率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%;凋亡指数AI%=MOD×阳性细胞百分比×100%。
1.5 统计学处理 统计数据用ˉx±s表示，两组间比较采用t检验，同组内不同时点均数比较用配对t检验，SPSS1. 0统计软件进行统计学处理，P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 供心移植后血流动力学情况 C组供心移植后5例自动复跳，1例右心房出血死亡，1例停机后鱼精蛋白中和时室颤。6例存活>2h。W组3例自动复跳，1例不复跳，1例电击复跳后反复室速死亡。5例存活2h。供心移植后，两组均持续泵入多巴胺4～6μg/(kg·min)，维持心率80～120bpm，心率<80bpm时行心外膜临时起搏。体外循环结束后测CO C组为1.57±0.22L/min，W组为1.24±0.20L/min，两组差异有显著性(P<0.05)。
2.2 心肌组织ATP含量 见表1。表1 心肌组织ATP含量 (略) 注:两组同时点相比， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01。
W组供心切取后即刻ATP含量明显低于C组，保存4h后进一步减少(P<0.05);而C组在低温保存后，心肌ATP降低不明显，与保存前相比差异无显著性(P>0.05)。2.3 心肌组织Bcl-2表达 见表2。表2 心肌组织Bcl-2阳性细胞百分率 (略)注:两组同时点相比 ˇ P>0.05， ˇˇ P<0.01;组内比较 Δ P<0.05， ΔΔ P<0.01。
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供心低温保存4h，Bcl-2表达在两组均于低水平，两组间差异无显著性(P>0.05);而再灌注2h，Bcl-2表达明显增加，两组均高于再灌注前(P<0.01)，且C组升高更明显，与W组相比差异有显著性(P<0.01)。2.4 心肌凋亡指数(AI) 见表3。表3 心肌细胞凋亡指数 (略) 注:两组同时点相比 ˇ P>0.05， ˇˇ P<0.01;组内比较 Δ P<0.01。
两组供心低温保存4h，心肌细胞凋亡处于低水平，两组间差异无显著性(P>0.05);而再灌注2h，细胞凋亡明显增加，两组均高于再灌注前(P<0.01)，且W组升高更明显，与C组相比差异有显著性(P<0.01)。2.5 供心移植后血浆cTnI水平 见表4。表4 血浆cTnI浓度 (略) 注:两组同时点相比， ˇ P<0.05。
供心再灌注后2h内各时点，cTnI均高于正常，并呈逐渐升高趋势。再灌注后W组同时点均高于C组，且30min后各时点差异有显著性(P<0.05)。
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2.6 心肌结构观察 C组心肌光镜下仅有1例有少量炎症细胞浸润，心肌细胞水肿较轻。电镜下肌纤维排列较整齐，线粒体和糖原颗粒丰富。再灌注2h出现细胞肿胀，局部肌丝排列紊乱，线粒体轻度肿胀，少量空泡变性，糖原颗粒尚丰富(图1)。W组再灌注2h，光镜下可见心内膜水肿，心肌纤维有断裂，中性粒细胞附壁及游出，有心肌局灶坏死。电镜下肌纤维排列紊乱，有断裂;线粒体肿胀，间隙增大，糖原颗粒明显减少，空泡变性多见(图2)。图1 电镜下C组心肌 ×10K(略)图2 电镜下W组心肌 ×10K(略)
3 讨论
目前，临床供心均来源于脑死亡供者。脑死亡是一种病理状态，在早期常伴有全身血流动力学改变。短暂的低血压、心肌缺血可导致心肌的组织学损伤，这可能成为移植后供心功能衰竭并导致死亡的原因之一。有文献报告，心脏移植后早期约50%的患者死于供心功能紊乱 [2] 。对供心造成损害的因素主要包括以下几个方面:(1)供心切取前 是否经历低血压;(2)切取和移植造成的手术创伤;(3)低温缺血以及移植后再灌注损伤;(4)移植后供体的排斥反应等。如何减少这些因素对供心的不良影响，一直是基础和临床研究的热点。
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由于猪心在结构和功能上与人心有许多相似处，尤其是冠状动脉及侧支循环的分布更接近人类，作为研究供心保护的实验模型更为适合 [3] 。我们模拟临床常用方法和程序，采用中度低温、体外循环下猪原位心脏移植模型，供心热缺血和低温保存后接受原位移植，并测定移植后供心的结构、功能以及凋亡的改变，具有更实际的意义。
3.1 热缺血对供心代谢和结构的影响 正常情况下心脏的能量供应来自有氧代谢，心肌细胞利用高能磷酸盐维持膜结构的稳定、电机械活动和基础代谢，其能量的储备却非常有限。缺血状态下，心肌中高能磷酸盐储备迅速下降，细胞发生酸中毒，能量物质的产生、转化和转运都受到影响;随着缺血时间延长，将引起细胞结构的破坏以及功能的丧失。再灌注时虽然氧供得以恢复，但心肌利用氧的能力有不同程度降低，氧化磷酸化的过程发生障碍，这可能与再灌注后大量氧自由基的产生有关。Murry等 [4] 认为，心肌高能磷酸化合物(ATP)的含量是判断心肌保护的重要标志之一。
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本实验结果显示，猪心常温缺血5min，使心肌ATP明显减少;保存4h，ATP降低更明显，均低于无缺血组。同时伴有心肌水肿，心肌细胞结构改变也较C组明显。再灌注后，代表心肌细胞损伤的特异性指标cTnI的水平显著升高，再灌注30～120min各时点W组均高于C组，而W组供心CO却低于C组，两者差异均有显著性(P<0.05)。再灌注2h心肌结构损害进一步加重。由此可见，常温热缺血使心肌细胞的能量代谢紊乱，低温保存以及此后的再灌注进一步加重了心肌损伤，造成了移植后供心早期功能下降。
3.2 热缺血对心肌细胞凋亡的影响 1972年由Kerr等首先提出凋亡(Apoptosis)的概念。它是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束其生命，最后细胞脱落离体或裂解为凋亡小体，被其他细胞吞噬，又叫程序性死亡(Programmed cell death，PCD)。传统观念认为心肌缺血及再灌注损伤主要指心肌的坏死，而目前认为，此过程中还有心肌细胞凋亡的参与，凋亡是心肌缺血和再灌注损伤的特征性改变 [5] 。缺血时凋亡发生于缺血的中心，再灌注时主要位于缺血区和梗死区的边缘。再灌注早期(2～6h)，凋亡是心肌细胞死亡的主要形式，凋亡的水平对心肌缺血再灌注的预后有重要影响。Bcl-2作为调节凋亡的基因颇引人注目，是目前公认的抑制细胞凋亡的基因。正常情况下，Bcl-2在心肌中不表达，心肌细胞受到缺血和再灌注损伤时，诱导Bcl-2基因启动，Bcl-2蛋白表达增加，从而抑制或逆转细胞凋亡。目前认为，Bcl-2在此过程中可能是通过调节线粒体膜的通透性，作用于调节凋亡必不可少的关键酶———半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)，来调节细胞凋亡的发生 [6] 。
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本实验采用免疫组化和特异高效的原位末端标记法，测定热缺血供心的凋亡水平。结果发现，两组供心低温保存4h后心肌凋亡较少，组间也无明显差别，同时Bcl-2处于低水平的表达;再灌注后2h两组凋亡均明显超过再灌注前(P<0.01)，且W组凋亡上调明显高于C组(P<0.01)并与心肌超微结构的改变相一致。而凋亡抑制蛋白Bcl-2再灌注后表达明显增加，且在C组增加更明显(P<0.01)，且与细胞凋亡指数成反比。
上述结果显示，热缺血引发了供心能量供需的失衡，低温保存过程中能量继续消耗;供心移植再灌注后损伤进一步加重，导致了供心功能异常。而热缺血诱导的心肌细胞凋亡增加，可能在其中起重要作用。如何减少热缺血对供心的影响，如改良保护液成分和温度、含血保护液常温持续或低温间断灌注、采用阻断或减少心肌细胞凋亡的措施等，有可能提高供心的保护效果，扩大供心的来源，这些还需要 进一步深入的研究。
参考文献
, 百拇医药 1 Hosenpud JD，Bennett LE，Keck BM，et al.The regisry of the Internaˉtional Society for Heart and LungTransplantation:sixteenth official reˉport.J HeartLung Transplant，1999，18:611-626.
2 邓小明，朱可明.常用实验动物麻醉，上海:第二军医大学出版社，2001，191-195.
3 Weave ME.A quantitative study of the anatomy and distribution of coroˉnary arteries in comparison with animals and man.Cardiovasc Res，1986，20:907.
4 Murry CE，Richand VJ，Reimer KA，et al.Ischemic preconditioning shows energy metabolism and delays ultrastructure damage during a susˉtained ischemic episode.Cir Res，1990，66:913-918.
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5 Gottlieb RA，Burlesen KO，Kloner RA，et al.Reprfusion injury induced apoptosis.Am J Physiol，1998，274:Ⅱ242-248.
6 Marchetti P，Castedo M，Susin SA，et al.Mitochodrial permeability tranˉsition is a central coorrdinating event of apoptosis.J Exp Med，1996，184:1155-1160.
(收稿日期:2003-11-20)
作者单位:266011青岛大学医学院附属青岛市立医院
(编辑李 欣), 百拇医药(侯文明 池一凡 孙忠东 杨铁南 牛兆倬 郭)
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关键词 热缺血 供心 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)12-1057-04
Effects of brevity warm ischemia and hypothermic storage on
myocardial apoptosis of donor heart
Hou Wenming，Chi Yifan，Sun Zhongdong，et al.
Qingdao Municipal Hospital，Affiliated Hospital of Medical College，Qingdao University，Qingdao266011.
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【Abstract】 Objective To evaluate the effects of warm ischemia and hypothermic storage on myocardial apopˉtosis of donor heart.Methods Pig othortopic heart transplantation models were establisted with donor hearts being arˉrested and preserved by St.Thmoas solution.Pigs were randomed to two groups:group C(control group，n=6)，donor hearts were arrested and stored with4℃Thomas solution.As in group W(warm ischemia group，n=6)，the donor hearts had been undergone5min ischemia at room temperature(28℃)befored being cold arrested and preserved.After4hours，ATP contents in myocardial tissue were measured and ultrastructurewas studied by electron microscope.Anˉother donor hearts.8in each group，wre accepted orthotopic transplantations after4℃storage.Cardiac output(CO)and cTnIleakage after reperfusion were compared between the two groups.The protein expression of Bcl-2were estimated by immunohistochemial and apoptosis index(AI)detected with TUNEL method on myocytes at4h storage and2h after reperfusion.ResultsCompare with group C，heart tissue ATP content is lower in group W after4hs storage(P<0.01).Mild histologic changes were observed in the donor of group W.After transplantation，in group W，CO is lower and cTnI level is higher than those of group C(P<0.05).Apoptosis increased in both two groups after2h reperfusion and much higher in group W(P<0.01)and Bcl-2expression increased significantly in C group(P<0.01).Ultrastrucˉture deteriorates significantly in group W.Conclusion Warm ischemia deplets the energy of the donor heart and inˉduced excess apoptosis on myocytes，especially after reperfusion and resultes in dysfunction of donor heart.
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Key words warm ischemia and reperfusion donor heart apoptosis
供心质量是决定手术效果的重要因素，为了扩大供心来源，对施行心脏移植的供、受体在年龄、体重差异和供心缺血时间等的限制有放宽的趋势，这是否会增加手术风险，影响移植手术的效果还值得做进一步的研究 [1] 。本研究采用猪原位心脏移植模型，观察短暂常温热缺血后低温保存对供心心肌细胞凋亡的影响，为进一步改进供心保护提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 体重50～60kg家猪，雌雄不限。供、受体为同窝生、同性别，体重相差<10%，体重大的作为供体。
1.2 实验分组 根据供心切除前有无常温热缺血，分为对照组(C组)和热缺血组(W组)，均采用4℃St.Thomas液行心肌灌注和保存。W组供心阻断升主动脉，造成常温缺血5min后再灌注保护液。
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1.3 动物模型 实验猪术前禁食12h，氯胺酮10mg/kg肌肉注射，气管插管，麻醉呼吸机控制呼吸，芬太尼、咪唑安定静脉复合及异氟醚吸入维持麻醉 [2] 。心电监测，耳缘静脉穿刺建立输液通路，约50ml/h滴注平衡液。右侧颈内动脉、颈外静脉切开置管，连接换能器和惠普多功能监护仪，连续测定动脉压(AP)和中心静脉压(CVP)。膀胱切开造瘘，插鼻咽部和肛温探头。采用SARNS-7000体外循环机，西京中号鼓泡式氧合器。体外循环预充:每1L0.9NaCl加入KCL1mEq/kg，肝素50mg。稀释后如HCT<25%，加血预充。体外循环流量2.5～3.5L/min，维持平均动脉压(MAP)60mmHg以上，HCT25%左右，肛温30～32℃。停机前HCT30%以上，肛温37℃左右。主动脉开放前不用血管活性药物。胸骨正中切口，心包倒T型切开暴露心脏和大血管。于主动脉根部缝荷包，插连接三通的灌注针头，便于同时监测灌注压。游离上腔静脉(SVC)、主肺动脉间隙，于心包外膈肌上间隙游离下腔静脉(IVC)。游离左半奇静脉在其进入冠状静脉窦处结扎。结扎上腔静脉，心脏跳动10次后于无名动脉起始段阻断升主动脉，灌注4℃Thomas液1000ml，灌注压<80mmHg。切取供心放入500ml Thomas液中4℃保存4h，取左心室全层心肌标本供检测。供心热缺血组先阻断升主动脉5min，再按上述步骤灌注和保存。供心原位移植:麻醉及切口同供体。主动脉远端插供血管，经右房插SVC管，IVC壁直接插直角管，建立体外循环。阻断升主动脉，剪除受体心脏。注意保留房间隔及部分左房后壁，结扎左半奇静脉。分别于房间隔上、下端缝标志牵引线。取低温保存约2.5h两组供心各8枚，移植前再次经主动脉根部灌注心脏保护液500ml，然后行标准术式原位心脏移植。4-0prolene线先从左房心耳处吻合供受体左房及房间隔，5-0prolene线吻合右房，房间隔采用双重缝合。修剪主、肺动脉，4-0prolene线连续缝合主动脉，同时复温至34℃主动脉根部心尖排气，经左心耳插左心引流管，充分排气后开放主动脉。然后用4-0prolene线连续吻合肺动脉。经右房切口置Swan-Ganz管入肺动脉。主动脉开放后，如室颤则行电除颤，若三次电击不复跳，则静注100mg利多卡因后再行电除颤，如仍不复跳则视为手术失败。供心复跳后，如MAP<60mmHg，多巴胺4～8μg/(kg·min)持续泵入。心率<80bpm，行心外膜临时起搏。测定动、静脉压力和心排量。如能脱离体外循环，静注氯化钙1g。心脏开放2h后结束手术。两组供心冷缺血时间分别为235±13min和227±15min，主动脉阻断时间两组差异无显著性。
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1.4 观察指标 供心切取后即刻低温保存4h分别取左心室组织，测定心肌组织ATP含量(化学发光法)，Bcl-2表达(免疫组化SABC法)，心肌细胞凋亡指数(AI)(TUNEL法，试剂盒由北京中山公司提供);同时用JEM-1200EX型透射电镜观察心肌超微结构。心脏移植再灌注后，观察供心复跳情况。分别于再灌注15min、30min、60min、90min、120min抽取血标本，测定血浆肌钙蛋白I(cTnI)(ELISA法，试剂盒由南京强欣公司提供)。脱离体外循环后测定心排量(CO)，再灌注2h取左心室组织测定Bcl-2和AI，电镜观察超微结构。免疫组化和凋亡染色每张切片光镜200倍放大，用北航医学图像分析管理系统(Mias system4.1)观察。随机选取10个视野，分别计数每个视野中的阳性和阴性细胞数，检测阳性染色平均光密度(MOD)。Bcl-2阳性细胞百分率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%;凋亡指数AI%=MOD×阳性细胞百分比×100%。
1.5 统计学处理 统计数据用ˉx±s表示，两组间比较采用t检验，同组内不同时点均数比较用配对t检验，SPSS1. 0统计软件进行统计学处理，P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 供心移植后血流动力学情况 C组供心移植后5例自动复跳，1例右心房出血死亡，1例停机后鱼精蛋白中和时室颤。6例存活>2h。W组3例自动复跳，1例不复跳，1例电击复跳后反复室速死亡。5例存活2h。供心移植后，两组均持续泵入多巴胺4～6μg/(kg·min)，维持心率80～120bpm，心率<80bpm时行心外膜临时起搏。体外循环结束后测CO C组为1.57±0.22L/min，W组为1.24±0.20L/min，两组差异有显著性(P<0.05)。
2.2 心肌组织ATP含量 见表1。表1 心肌组织ATP含量 (略) 注:两组同时点相比， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01。
W组供心切取后即刻ATP含量明显低于C组，保存4h后进一步减少(P<0.05);而C组在低温保存后，心肌ATP降低不明显，与保存前相比差异无显著性(P>0.05)。2.3 心肌组织Bcl-2表达 见表2。表2 心肌组织Bcl-2阳性细胞百分率 (略)注:两组同时点相比 ˇ P>0.05， ˇˇ P<0.01;组内比较 Δ P<0.05， ΔΔ P<0.01。
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供心低温保存4h，Bcl-2表达在两组均于低水平，两组间差异无显著性(P>0.05);而再灌注2h，Bcl-2表达明显增加，两组均高于再灌注前(P<0.01)，且C组升高更明显，与W组相比差异有显著性(P<0.01)。2.4 心肌凋亡指数(AI) 见表3。表3 心肌细胞凋亡指数 (略) 注:两组同时点相比 ˇ P>0.05， ˇˇ P<0.01;组内比较 Δ P<0.01。
两组供心低温保存4h，心肌细胞凋亡处于低水平，两组间差异无显著性(P>0.05);而再灌注2h，细胞凋亡明显增加，两组均高于再灌注前(P<0.01)，且W组升高更明显，与C组相比差异有显著性(P<0.01)。2.5 供心移植后血浆cTnI水平 见表4。表4 血浆cTnI浓度 (略) 注:两组同时点相比， ˇ P<0.05。
供心再灌注后2h内各时点，cTnI均高于正常，并呈逐渐升高趋势。再灌注后W组同时点均高于C组，且30min后各时点差异有显著性(P<0.05)。
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2.6 心肌结构观察 C组心肌光镜下仅有1例有少量炎症细胞浸润，心肌细胞水肿较轻。电镜下肌纤维排列较整齐，线粒体和糖原颗粒丰富。再灌注2h出现细胞肿胀，局部肌丝排列紊乱，线粒体轻度肿胀，少量空泡变性，糖原颗粒尚丰富(图1)。W组再灌注2h，光镜下可见心内膜水肿，心肌纤维有断裂，中性粒细胞附壁及游出，有心肌局灶坏死。电镜下肌纤维排列紊乱，有断裂;线粒体肿胀，间隙增大，糖原颗粒明显减少，空泡变性多见(图2)。图1 电镜下C组心肌 ×10K(略)图2 电镜下W组心肌 ×10K(略)
3 讨论
目前，临床供心均来源于脑死亡供者。脑死亡是一种病理状态，在早期常伴有全身血流动力学改变。短暂的低血压、心肌缺血可导致心肌的组织学损伤，这可能成为移植后供心功能衰竭并导致死亡的原因之一。有文献报告，心脏移植后早期约50%的患者死于供心功能紊乱 [2] 。对供心造成损害的因素主要包括以下几个方面:(1)供心切取前 是否经历低血压;(2)切取和移植造成的手术创伤;(3)低温缺血以及移植后再灌注损伤;(4)移植后供体的排斥反应等。如何减少这些因素对供心的不良影响，一直是基础和临床研究的热点。
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由于猪心在结构和功能上与人心有许多相似处，尤其是冠状动脉及侧支循环的分布更接近人类，作为研究供心保护的实验模型更为适合 [3] 。我们模拟临床常用方法和程序，采用中度低温、体外循环下猪原位心脏移植模型，供心热缺血和低温保存后接受原位移植，并测定移植后供心的结构、功能以及凋亡的改变，具有更实际的意义。
3.1 热缺血对供心代谢和结构的影响 正常情况下心脏的能量供应来自有氧代谢，心肌细胞利用高能磷酸盐维持膜结构的稳定、电机械活动和基础代谢，其能量的储备却非常有限。缺血状态下，心肌中高能磷酸盐储备迅速下降，细胞发生酸中毒，能量物质的产生、转化和转运都受到影响;随着缺血时间延长，将引起细胞结构的破坏以及功能的丧失。再灌注时虽然氧供得以恢复，但心肌利用氧的能力有不同程度降低，氧化磷酸化的过程发生障碍，这可能与再灌注后大量氧自由基的产生有关。Murry等 [4] 认为，心肌高能磷酸化合物(ATP)的含量是判断心肌保护的重要标志之一。
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本实验结果显示，猪心常温缺血5min，使心肌ATP明显减少;保存4h，ATP降低更明显，均低于无缺血组。同时伴有心肌水肿，心肌细胞结构改变也较C组明显。再灌注后，代表心肌细胞损伤的特异性指标cTnI的水平显著升高，再灌注30～120min各时点W组均高于C组，而W组供心CO却低于C组，两者差异均有显著性(P<0.05)。再灌注2h心肌结构损害进一步加重。由此可见，常温热缺血使心肌细胞的能量代谢紊乱，低温保存以及此后的再灌注进一步加重了心肌损伤，造成了移植后供心早期功能下降。
3.2 热缺血对心肌细胞凋亡的影响 1972年由Kerr等首先提出凋亡(Apoptosis)的概念。它是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束其生命，最后细胞脱落离体或裂解为凋亡小体，被其他细胞吞噬，又叫程序性死亡(Programmed cell death，PCD)。传统观念认为心肌缺血及再灌注损伤主要指心肌的坏死，而目前认为，此过程中还有心肌细胞凋亡的参与，凋亡是心肌缺血和再灌注损伤的特征性改变 [5] 。缺血时凋亡发生于缺血的中心，再灌注时主要位于缺血区和梗死区的边缘。再灌注早期(2～6h)，凋亡是心肌细胞死亡的主要形式，凋亡的水平对心肌缺血再灌注的预后有重要影响。Bcl-2作为调节凋亡的基因颇引人注目，是目前公认的抑制细胞凋亡的基因。正常情况下，Bcl-2在心肌中不表达，心肌细胞受到缺血和再灌注损伤时，诱导Bcl-2基因启动，Bcl-2蛋白表达增加，从而抑制或逆转细胞凋亡。目前认为，Bcl-2在此过程中可能是通过调节线粒体膜的通透性，作用于调节凋亡必不可少的关键酶———半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)，来调节细胞凋亡的发生 [6] 。
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本实验采用免疫组化和特异高效的原位末端标记法，测定热缺血供心的凋亡水平。结果发现，两组供心低温保存4h后心肌凋亡较少，组间也无明显差别，同时Bcl-2处于低水平的表达;再灌注后2h两组凋亡均明显超过再灌注前(P<0.01)，且W组凋亡上调明显高于C组(P<0.01)并与心肌超微结构的改变相一致。而凋亡抑制蛋白Bcl-2再灌注后表达明显增加，且在C组增加更明显(P<0.01)，且与细胞凋亡指数成反比。
上述结果显示，热缺血引发了供心能量供需的失衡，低温保存过程中能量继续消耗;供心移植再灌注后损伤进一步加重，导致了供心功能异常。而热缺血诱导的心肌细胞凋亡增加，可能在其中起重要作用。如何减少热缺血对供心的影响，如改良保护液成分和温度、含血保护液常温持续或低温间断灌注、采用阻断或减少心肌细胞凋亡的措施等，有可能提高供心的保护效果，扩大供心的来源，这些还需要 进一步深入的研究。
参考文献
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(收稿日期:2003-11-20)
作者单位:266011青岛大学医学院附属青岛市立医院
(编辑李 欣), 百拇医药(侯文明 池一凡 孙忠东 杨铁南 牛兆倬 郭)