当归对兔肾缺血再灌注损伤的防治作用及其免疫机制
【摘要】 目的 探讨当归对兔肾缺血再灌注损伤的防治作用和免疫保护机制。方法 将25只家兔随机均分为手术对照组、单纯缺血再灌注组、当归注射液处理组，采用在体肾缺血再灌注模型，肾动脉夹闭1h再灌注48h后取肾组织作电镜观察并测定血清肌酐(Cr)、肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。结果 与手术对照组相比，单纯缺血再灌注组肾组织细胞发生明显变性，血清Cr值显著增高(P<0.05)，肾组织TNF-α和IL-6含量增加(P<0.05和0.01);与单纯缺血再灌注组相比，当归注射液处理组肾组织结构改变明显减轻，血清Cr显著下降(P<0.05)并恢复到对照水平(P>0.05)，肾组织TNF-α和IL-6含量减少(P<0.05和0.01)，IL-6的含量与手术对照组差异无显著性(P>0.05)，而TNF-α含量显著低于对照组(P<0.05)。结论 当归可能通过抑制炎性细胞因子的释放减轻家兔肾缺血再灌注损伤。
, 百拇医药
关键词 当归 肿瘤坏死因子-α 白细胞介素-6 肾缺血 再灌注损伤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1605-03
The prevention and its immunomechanism of Radix Angelicae
Sinensis on renal ischemia reperfusion injury in rabbits
Wu Yuchuan，Li Lihua，Zhao Chunling，et al
Department of Microbiology and Immunology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To determine the therapeutic effects of Radix Angelicae Sinensis on renal ischemia reperfusion injury in rabbits and to explore its immune mechanism.Methods Twenty-five rabbits were randomly diˉvided into the operation control group，renal ischemia reperfusion(IR)injury group and Radix Angelicae Sinensis-treated(RAS+IR)group.At the reperfusion48hours after renal ischemia1h，the renal tissue were detected by elecˉtron-microscopy and the changes of creatinine(Cr)in serum，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)in the renal tissue were observed.Results The degenerative changes were remarkable under electromicroˉscope in renal tissue in IR group，but the changes in RAS+IR group were slightly.Compared with operation control group，the levels of Cr，TNF-α，IL-6in IR group rabbits were significantly increased(P<0.05，P<0.05and P<0.01respectively).Compared with IR group，these parameters were markedly decreased in RAS+IR group.Concluˉsion RAS has the effect of alleviation on the renal ischemia reperfusion injury by inhibiting the release of inflammaˉtory cytokines.
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Key words radix angelicae sinensis tumor necrosis factor-α interleukin-6 renal ischemia reperfusion injury
细胞内氧自由基生成过多和钙超载是引起组织缺血再灌注(Ischemia reperfusion，IR)损伤的重要因素。近年来的研究发现，许多细胞因子也参与了组织的再灌注损伤过程 [1] 。活血化瘀中药当归(Radix Angelicas Sinensis，RAS)可减轻多种原因所致的肾功能损害 [2，3] ，能改善家兔肾缺血后肾小球滤过率及肾小管重吸收功能 [4] 。当归是否能通过抑制肾缺血再灌注损伤时炎性细胞因子的释放，从而对肾脏起到免疫保护作用，目前尚未见报道。本实验观察了当归注射液对家兔肾再灌注损伤后肾组织中肿瘤坏死因子-α(Tuˉmor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)含量变化的影响，探讨了其防治作用和免疫保护机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 动物:健康成年日本大耳白兔25只，雌雄不拘，体重(1.58±0.21)kg(购于四川大学华西医学部，二级)。药品与试剂:当归注射液(每支2ml，每ml相当于原药材0.05g)，山西省永济制药厂;人TNF-α试剂盒购自西安第四军医大学免疫学教研室;人IL-6检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。仪器:酶标仪(美国Bio-TEKELX800型)，透射电镜(日本日立JEM-100SX型)，紫外分光光度计(日本岛津UV-200S型)，低温离心机(日本久保田KR-180FA型)。
1.2 方法 25只大耳白兔随机均分为手术对照(Control)组、单纯缺血再灌注(IR)组、当归注射液处理(RAS+IR)组。RAS+IR组术前1天、手术当天、术后1天每天注射1次当归注射液，剂量为12.5g/kg加0.9%N.S5ml·kg -1 ·次 -1 。control组和IR组按上述方法注射0.9%N.S5ml·kg -1 ·次 -1 。1%戊巴比妥钠2.5ml/kg耳缘静脉注射。无菌条件下开腹，去左肾，右肾动脉夹闭1h(control组不夹)，去夹恢复血液再灌注。术后48h击昏动物，下腔静脉取血清测肌酐(Creatinine，Cr)含量，取右肾下极组织放入3%戊二醛中固定，以备电镜检查;取右肾上极组织0.5g，加4℃双蒸水4.5ml，并在4℃条件下用电动匀浆机以10000～20000r/min速度研磨，制成10%的组织匀浆，将匀浆用低温离心机以3000～4000r/min离心10～15min后，取适量上清液检测肾组织中的TNF-α和IL-6含量。Cr检测用苦味酸法，TNF-α和IL-6用ELISA夹心法检测(见各试剂盒说明书)。
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1.3 统计学方法 凡计量资料均以ˉx±s表示，采用t检验进行组间比较，以P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 电镜观察 Control组肾小球毛细血管、滤过屏障、近曲小管上皮细胞及细胞器结构正常。IR组肾小球血管内皮细胞变薄，基底膜明显增厚，足细胞的突起融合、消失，肾小囊腔狭窄，肾小球体积缩小。肾小管上皮细胞相邻面的镶嵌连结减少，基底膜皱褶减少至消失，线粒体数量少，电子密度增加，胞质中有大量空泡、管状嵴、板层嵴，内质网扩张，核固缩，核膜不光滑，核异染色质致密块状位于核膜下。RAS+IR组肾小球未见明显病理改变;肾小管上皮细胞基膜明显，未见增厚，细胞器丰富，空泡少，可见溶酶体，线粒体电子密度未见明显增高，细胞间隙略增宽。
2.2 各组兔血清中Cr的含量 肾缺血1h再灌注48h后，与Control组和RAS+IR组相比，IR组血清Cr显著增加;RAS+IR组Cr含量较IR组显著减少(P<0.05)，与Control组间差异无显著性(P>0.05)。见表1。
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表1 各组兔血清中Cr的含量 (略)
2.3 各组兔肾组织中TNF-α和IL-6的含量 肾缺血1h再灌注48h，与Control组和RAS+IR组相比，IR组肾组织TNF-α和IL-6含量显著增加(P<0.05和P<0.01);RAS+IR组TNF-α含量较IR组显著减少(P<0.05)，并显著低于Control组(P<0.05);IL-6含量较IR组也显著减少(P<0.01)，并恢复到Control组水平(P>0.05)。见表2。
表2 肾组织TNF-α和IL-6的含量 (略)
3 讨论
IR的发生机制与多种因素有关，炎性细胞因子水平的增高在其发生过程中起到重要作用。IL-6是由多种淋巴 细胞和非淋巴细胞自发地或在各种刺激下产生的细胞因子，除了具有免疫增强作用和造血作用外，还可参与炎症反应。TNF-α的生物学活性相当广泛，对免疫反应、炎症反应具有重要的调节和介导作用，可刺激单核-巨噬细胞和其它细胞分泌IL-1、IL-6等趋化因子。对于IL-6在各种疾病发生中的作用，存在不同的论点，Madile等发现，正常情况下，肾组织中检测不出明显的IL-6免疫活性 [5] ，国内学者发现IL-6在肺IR、心肌IR和脑梗塞早期炎症反应时分泌增加，活性提高，提示IL-6是缺血性损伤的主要因素之一 [1，6，7] 。一般认为，TNF-α可刺激单核-巨噬细胞产生IL-1、IL-6等，可能是众多细胞因子的重要启动因子，但近来已有人证实，IL-6可通过抑制TNF-α的转录和释放而减轻缺血再灌注损伤 [8] 。说明IL-6与TNF-α可能存在相互作用的机制。也有研究发现，IL-6可能是减轻脑IR损伤的因素之一 [9] 。IL-6在肾IR损伤中的确切作用，尚未见报道。我们的实验结果显示，兔肾缺血1h再灌注48h后，电镜下可见肾组织结构遭到明显破坏，血清Cr含量显著增高，肾组织TNF-α和IL-6水平上升，提示炎性细胞因子TNF-α和IL-6参与了兔肾缺血再灌注损伤。
, 百拇医药
当归是一种传统的活血化瘀中药，对机体多系统均有保护作用。它可促进机体的免疫功能，也可抗炎、镇痛、抗损伤，对缺血再灌注脑组织脂质过氧化物增高具有明显抑制作用 [4] 。当归补血汤对大鼠心肌缺血再灌注引起的心功能减弱具有明显保护作用，机制可能是改善能量代谢和抑制自由基生成或清除氧自由基 [10] 。我们在兔肾缺血1h再灌注48h模型基础上用当归注射液处理后，发现肾组织结构损伤明显减轻，血清Cr恢复到对照组水平，同时，肾组织TNF-α和IL-6含量显著低于IR组，提示当归可能通过抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-6的产生或释放来减轻肾IR损伤。
我们的结果也显示，当归处理组兔肾组织的IL-6可恢复到正常水平，而TNF-α含量却显著低于对照组。其机制不清，是否当归对肾缺血再灌注损伤时TNF-α的产生有较强抑制作用，或与IL-6协同抑制TNF-α的产生和释放，尚有待进一步研究阐明。
, 百拇医药
参考文献
1 向明章，蒋耀光，王如文，等.尼群地平对大鼠肺缺血再灌注损伤后TNF-α、IL-6、IL-8变化的影响.第三军医大学学报，1999，21(1):38-41.
2 郑鸿翱，陈少如，陈少刚，等.当归对急性肾小管坏死的防治作用及其机制.中国病理生理杂志，1997，13(1):76-79.
3 严燕国，艾中立，刘德芳，等.当归注射液对重症胰腺炎胰肾损害的保护作用.肝胆胰外科杂志，2000，12(2):87-89.
4 方文贤，宋崇顺，周立孝.医用中药药理学.北京:人民卫生出版社，1998，666-673.
5 Madile D，Russo P，Bendayan M.Presence of tumor factor alpha and inˉterleukin-6in renal mesangial cell of lupus nephritis patients.Human-Pathol，1995，26(5):558-564.
, http://www.100md.com
6 浦奎，祝善俊，姚智，等.心肌缺血-再灌注时体内细胞因子活性动态变化的实验研究.中华心血管病杂志，1997，25(4):305-307.
7 易兴阳，袁光固，周东，等.脑梗塞患者周围血细胞因子研究.中风与神经疾病杂志，1996，13(6):333-335.
8 Schindler R，Mancilla S，Endres S，et al.Correlations and interations in the production of interleukin-6(IL-6)，IL-1and Tumor necrosis factor(TNF)in Human Blood mononuclear cells.IL-6suppress IL-1and TNF.Blood，1990，75:40-47.
9 邬力祥，曹兆丰，朱心裘，等.谷氨酸和ATP对新生大鼠脑星形胶质细胞IL-6合成的影响.湖南医科大学学报，1997，22(2): 116-118.
10 吴大正，宋纯清，韩之芬，等.当归补血汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的作用.中药药理与临床，1999，15(5):1-3.
基金项目:四川省中医药管理局资助课题(编号9833)
作者单位:1 646000泸州医学院(微生物学与免疫学教研室、生理 学教研室)
2 400046重庆医科大学药学系
(编辑 曲全), http://www.100md.com(邬于川)
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关键词 当归 肿瘤坏死因子-α 白细胞介素-6 肾缺血 再灌注损伤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1605-03
The prevention and its immunomechanism of Radix Angelicae
Sinensis on renal ischemia reperfusion injury in rabbits
Wu Yuchuan，Li Lihua，Zhao Chunling，et al
Department of Microbiology and Immunology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To determine the therapeutic effects of Radix Angelicae Sinensis on renal ischemia reperfusion injury in rabbits and to explore its immune mechanism.Methods Twenty-five rabbits were randomly diˉvided into the operation control group，renal ischemia reperfusion(IR)injury group and Radix Angelicae Sinensis-treated(RAS+IR)group.At the reperfusion48hours after renal ischemia1h，the renal tissue were detected by elecˉtron-microscopy and the changes of creatinine(Cr)in serum，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)in the renal tissue were observed.Results The degenerative changes were remarkable under electromicroˉscope in renal tissue in IR group，but the changes in RAS+IR group were slightly.Compared with operation control group，the levels of Cr，TNF-α，IL-6in IR group rabbits were significantly increased(P<0.05，P<0.05and P<0.01respectively).Compared with IR group，these parameters were markedly decreased in RAS+IR group.Concluˉsion RAS has the effect of alleviation on the renal ischemia reperfusion injury by inhibiting the release of inflammaˉtory cytokines.
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Key words radix angelicae sinensis tumor necrosis factor-α interleukin-6 renal ischemia reperfusion injury
细胞内氧自由基生成过多和钙超载是引起组织缺血再灌注(Ischemia reperfusion，IR)损伤的重要因素。近年来的研究发现，许多细胞因子也参与了组织的再灌注损伤过程 [1] 。活血化瘀中药当归(Radix Angelicas Sinensis，RAS)可减轻多种原因所致的肾功能损害 [2，3] ，能改善家兔肾缺血后肾小球滤过率及肾小管重吸收功能 [4] 。当归是否能通过抑制肾缺血再灌注损伤时炎性细胞因子的释放，从而对肾脏起到免疫保护作用，目前尚未见报道。本实验观察了当归注射液对家兔肾再灌注损伤后肾组织中肿瘤坏死因子-α(Tuˉmor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)含量变化的影响，探讨了其防治作用和免疫保护机制。
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1 材料与方法
1.1 材料 动物:健康成年日本大耳白兔25只，雌雄不拘，体重(1.58±0.21)kg(购于四川大学华西医学部，二级)。药品与试剂:当归注射液(每支2ml，每ml相当于原药材0.05g)，山西省永济制药厂;人TNF-α试剂盒购自西安第四军医大学免疫学教研室;人IL-6检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。仪器:酶标仪(美国Bio-TEKELX800型)，透射电镜(日本日立JEM-100SX型)，紫外分光光度计(日本岛津UV-200S型)，低温离心机(日本久保田KR-180FA型)。
1.2 方法 25只大耳白兔随机均分为手术对照(Control)组、单纯缺血再灌注(IR)组、当归注射液处理(RAS+IR)组。RAS+IR组术前1天、手术当天、术后1天每天注射1次当归注射液，剂量为12.5g/kg加0.9%N.S5ml·kg -1 ·次 -1 。control组和IR组按上述方法注射0.9%N.S5ml·kg -1 ·次 -1 。1%戊巴比妥钠2.5ml/kg耳缘静脉注射。无菌条件下开腹，去左肾，右肾动脉夹闭1h(control组不夹)，去夹恢复血液再灌注。术后48h击昏动物，下腔静脉取血清测肌酐(Creatinine，Cr)含量，取右肾下极组织放入3%戊二醛中固定，以备电镜检查;取右肾上极组织0.5g，加4℃双蒸水4.5ml，并在4℃条件下用电动匀浆机以10000～20000r/min速度研磨，制成10%的组织匀浆，将匀浆用低温离心机以3000～4000r/min离心10～15min后，取适量上清液检测肾组织中的TNF-α和IL-6含量。Cr检测用苦味酸法，TNF-α和IL-6用ELISA夹心法检测(见各试剂盒说明书)。
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1.3 统计学方法 凡计量资料均以ˉx±s表示，采用t检验进行组间比较，以P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 电镜观察 Control组肾小球毛细血管、滤过屏障、近曲小管上皮细胞及细胞器结构正常。IR组肾小球血管内皮细胞变薄，基底膜明显增厚，足细胞的突起融合、消失，肾小囊腔狭窄，肾小球体积缩小。肾小管上皮细胞相邻面的镶嵌连结减少，基底膜皱褶减少至消失，线粒体数量少，电子密度增加，胞质中有大量空泡、管状嵴、板层嵴，内质网扩张，核固缩，核膜不光滑，核异染色质致密块状位于核膜下。RAS+IR组肾小球未见明显病理改变;肾小管上皮细胞基膜明显，未见增厚，细胞器丰富，空泡少，可见溶酶体，线粒体电子密度未见明显增高，细胞间隙略增宽。
2.2 各组兔血清中Cr的含量 肾缺血1h再灌注48h后，与Control组和RAS+IR组相比，IR组血清Cr显著增加;RAS+IR组Cr含量较IR组显著减少(P<0.05)，与Control组间差异无显著性(P>0.05)。见表1。
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表1 各组兔血清中Cr的含量 (略)
2.3 各组兔肾组织中TNF-α和IL-6的含量 肾缺血1h再灌注48h，与Control组和RAS+IR组相比，IR组肾组织TNF-α和IL-6含量显著增加(P<0.05和P<0.01);RAS+IR组TNF-α含量较IR组显著减少(P<0.05)，并显著低于Control组(P<0.05);IL-6含量较IR组也显著减少(P<0.01)，并恢复到Control组水平(P>0.05)。见表2。
表2 肾组织TNF-α和IL-6的含量 (略)
3 讨论
IR的发生机制与多种因素有关，炎性细胞因子水平的增高在其发生过程中起到重要作用。IL-6是由多种淋巴 细胞和非淋巴细胞自发地或在各种刺激下产生的细胞因子，除了具有免疫增强作用和造血作用外，还可参与炎症反应。TNF-α的生物学活性相当广泛，对免疫反应、炎症反应具有重要的调节和介导作用，可刺激单核-巨噬细胞和其它细胞分泌IL-1、IL-6等趋化因子。对于IL-6在各种疾病发生中的作用，存在不同的论点，Madile等发现，正常情况下，肾组织中检测不出明显的IL-6免疫活性 [5] ，国内学者发现IL-6在肺IR、心肌IR和脑梗塞早期炎症反应时分泌增加，活性提高，提示IL-6是缺血性损伤的主要因素之一 [1，6，7] 。一般认为，TNF-α可刺激单核-巨噬细胞产生IL-1、IL-6等，可能是众多细胞因子的重要启动因子，但近来已有人证实，IL-6可通过抑制TNF-α的转录和释放而减轻缺血再灌注损伤 [8] 。说明IL-6与TNF-α可能存在相互作用的机制。也有研究发现，IL-6可能是减轻脑IR损伤的因素之一 [9] 。IL-6在肾IR损伤中的确切作用，尚未见报道。我们的实验结果显示，兔肾缺血1h再灌注48h后，电镜下可见肾组织结构遭到明显破坏，血清Cr含量显著增高，肾组织TNF-α和IL-6水平上升，提示炎性细胞因子TNF-α和IL-6参与了兔肾缺血再灌注损伤。
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当归是一种传统的活血化瘀中药，对机体多系统均有保护作用。它可促进机体的免疫功能，也可抗炎、镇痛、抗损伤，对缺血再灌注脑组织脂质过氧化物增高具有明显抑制作用 [4] 。当归补血汤对大鼠心肌缺血再灌注引起的心功能减弱具有明显保护作用，机制可能是改善能量代谢和抑制自由基生成或清除氧自由基 [10] 。我们在兔肾缺血1h再灌注48h模型基础上用当归注射液处理后，发现肾组织结构损伤明显减轻，血清Cr恢复到对照组水平，同时，肾组织TNF-α和IL-6含量显著低于IR组，提示当归可能通过抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-6的产生或释放来减轻肾IR损伤。
我们的结果也显示，当归处理组兔肾组织的IL-6可恢复到正常水平，而TNF-α含量却显著低于对照组。其机制不清，是否当归对肾缺血再灌注损伤时TNF-α的产生有较强抑制作用，或与IL-6协同抑制TNF-α的产生和释放，尚有待进一步研究阐明。
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, http://www.100md.com
6 浦奎，祝善俊，姚智，等.心肌缺血-再灌注时体内细胞因子活性动态变化的实验研究.中华心血管病杂志，1997，25(4):305-307.
7 易兴阳，袁光固，周东，等.脑梗塞患者周围血细胞因子研究.中风与神经疾病杂志，1996，13(6):333-335.
8 Schindler R，Mancilla S，Endres S，et al.Correlations and interations in the production of interleukin-6(IL-6)，IL-1and Tumor necrosis factor(TNF)in Human Blood mononuclear cells.IL-6suppress IL-1and TNF.Blood，1990，75:40-47.
9 邬力祥，曹兆丰，朱心裘，等.谷氨酸和ATP对新生大鼠脑星形胶质细胞IL-6合成的影响.湖南医科大学学报，1997，22(2): 116-118.
10 吴大正，宋纯清，韩之芬，等.当归补血汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的作用.中药药理与临床，1999，15(5):1-3.
基金项目:四川省中医药管理局资助课题(编号9833)
作者单位:1 646000泸州医学院(微生物学与免疫学教研室、生理 学教研室)
2 400046重庆医科大学药学系
(编辑 曲全), http://www.100md.com(邬于川)