细胞因子对实验性自身免疫性肌炎淋巴细胞B7表达的影响
【摘要】 目的 探讨B7在实验性自身免疫性肌炎(EAM)发病中的作用及γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、IL-12对其的影响。方法用兔肌肉匀浆免疫小鼠建立EAM模型，观察动物发病情况及肌肉病理改变。取小鼠外周血和脾淋巴细胞进行细胞培养并用细胞因子处理，分别应用流式细胞计和逆转录聚合酶链反应(PCR)检测外周血和脾淋巴细胞B7-1，B7-2蛋白和mRNA的表达及细胞因子对其影响。结果 EAM小鼠外周血和脾淋巴细胞上B7-1、B7-2蛋白的表达明显增强，B7-1、B7-2mRNA的表达与蛋白表达的增加相平行。IFN-γ、TNF-α、IL-12使上述表达明显增强，IL-10则抑制其表达。结论 B7表达与EAM的发病密切相关，细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-12可能通过调节EAM小鼠淋巴细胞B7表达而影响EAM的转归。
关键词 细胞因子 B7分子 EAM RT-PCR 流式细胞计
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)01-0001-03
, 百拇医药
The effects of cytokines on the B7expression of lymphocyte in
experimentalautoimmune myositis
Tao Weiyi，Xiao Bo，Peng Yong，et al.
Department of Neurology，Red Cross Hospital，Shengzhen518029.
【Abstract】 Objective To study the effects of IFN-γ，TNF-α，IL-10and IL-12on the B7mRNA and protein expression of lymphocyte in experimental autoimmune myositis(EAM).Methods FACS and RT-PCR techˉniques were used to assay the expression of B7in EAM lymphocytes and effects of cytokines.Results IFN-γ，TNF-αandIL-12increased the expression of B7，but IL-10inhibited all the expressions.Conclusion IFN-γ，TNF-α，IL-10and IL-12effected the B7expression in EAM lymphocytes.
, 百拇医药
Key words cytokine B7 EAM RT-PCR flow cytometry
实验性自身免疫性肌炎(EAM)是一种人工诱导类似人类多发性肌炎(PM)的动物模型，其病理改变与PM基本一致，即肌纤维的坏死和炎性细胞浸润。已有的研究表明PM发病与T细胞的异常活化有关 [1，2] 。T细胞的活化需要第一信号和第二信号参与，第二信号又称协同刺激信号，主要由T细胞上表达的CD28/CTLA-4与抗原递呈细胞(APC)表面的配体B7相互作用所提供 [3] 。本实验着重观察B7在EAM中的表达以及IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α对其影响，试从T细胞活化的角度探讨PM的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料 PE标记的抗B7-1、B7-2单克隆抗体购自美国Pharmingen公司，IL-10、IL-12、rIFN-γ、rTNF-α、RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自美国Promega公司，B7-1、B7-2、β-actin引物由中科院上海细胞生物研究所合成，弗氏完全佐剂(CFA)及其它免疫试剂购自北京邦定生物公司。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 动物模型和分组 健康雄性昆明小鼠40只(6～8周，25～30g)由湖南医科大学实验动物中心提供。随机分为肌炎组10只(EAM)，对照组10只(0.9%NS)。取兔肌肉 ˇ 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:39870909)匀浆0.1ml加等量CFA混匀制成0.2ml抗原乳剂注入EAM组小鼠颈部肌肉和皮下组织，1周后重复诱导1次;对照组用生理盐水取代兔肌肉匀浆加等量CFA混匀注射。发病动物症状体征分级标准见文献 [4] 。两组动物分别于免疫后22天或濒死前，用3%异戊巴比妥钠0.2ml注入小鼠腹腔，麻醉后用无菌注射器于心脏采血，肝素抗凝，同时取脾脏备检。另取大腿肌肉置于10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片做HE染色，行光镜检查。
1.2.2 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2蛋白表达 外周血淋巴细胞分离方法见文献 [5]。脾脏经200目钢网过筛，用Ficoll液分离淋巴细胞，Hank’s液洗2次，重悬于含10%小牛血清的1640培养液中备用。淋巴细胞分为细胞因子处理组和未处理组，分别置于96孔细胞培养板中，在37℃、5%CO 2 中孵育72h。内加5μg/ml ConA诱导，培养基中含45%DMEM、10%FCS、10mM HEPES、50μg/ml青霉素/链霉素;处理组在上述培养基分别加入100U/ml rIFN-γ、250U/ml rTNF-α、10μg/ml IL-10、20μg/ml IL-12刺激，在培养后24、48、72h取细胞因子处理组和未处理组淋巴细胞1×10 7 个，分别加B7-1和B7-2单抗1μg，置4℃孵育30min，4000rpm×5min，取沉淀加PBS洗2次，4000rpm×5min，沉淀加0.5ml PBS及20μl戊二醛固定液，流式细胞计检测淋巴细胞上B7-1和B7-2蛋白的表达。
, 百拇医药
1.2.3 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA表达水平
1.2.3.1 cDNA合成和PCR扩增 取细胞因子处理组和未处理组培养的淋巴细胞1×10 7 个，采用异硫氰酸胍法提取RNA。取样品RNA0.2μg，加Oligo(dT)引物1μl(100ng/μl)，5×反转录缓冲液4μl，95℃5min，冷却后加入Rnasin20U、2.5mM dNTP4μl、AMV转录酶5U，总反应体积20μl，42℃反应60min，然后94℃3min灭活AMV酶，置-20℃冰箱保存。取cDNA反应液10μl，置0.5ml Eppendorf管中，分别加入2.5mM dNTP4μl，Taq酶1U，10×PCR缓冲液5μl，β-actin上、 下游引物各1μl(10pmol/μl)，B7-1或B7-2上下游引物各2μl(10pmol/μl)，引物序列见表1，加去离子双蒸水至终体积50μl，再用50μl石蜡油覆盖，95℃变性5min，反应条件为95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸5min。
, 百拇医药
表1 B7-1、B7-2、β-actin引物序列
1.2.3.2 PCR产物的分析 20μl PCR扩增产物在含有0.5μg/μl溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，时间1h，电压5V/cm。电泳后凝胶在Eagle EyeⅡ型图像处理系统上计算出B7-1、B7-2、β-actin密度，用β-actin密度作为参照，求出B7-1、B7-2基因表达的相对值。
1.3 数据处理 结果以均数±标准差表示(ˉx±s)，用t检验进行统计学处理，并进行相关分析。
2 结果
2.1 发病情况和组织病理学改变 NS组无动物发病，EAM组在免疫后的第14～18天先后发病，22天左右达高 峰。EAM组小鼠发病率为80%，且以中重度为主，体重明显减轻。光镜HE染色显示，发病的小鼠肌肉有大量炎性细胞浸润伴肌纤维的坏死。
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2.2 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2蛋白的表达 如表2所示，NS组B7-1、B7-2有少量表达，EAM组B7-1、B7-2表达明显增加(P<0.01);rIFN-γ、rTNF-α、IL-12处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2表达进一步增加，而IL-10处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2表达则明显受到抑制(P<0.01)。
表2 小鼠外周血和脾淋巴细胞中协同刺激分子蛋白的表达 (ˉx±s) 注:q检验，与NS组比较 ▲ P<0.01，与EAM组比较 ˇ P<0.01， ˇˇ P<0.05
2.3 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA的表达 如表3所示，NS组B7-1、B7-2mRNA表达量较少，EAM组B7-1、B7-2mRNA显著增多，差异具有显著性(P<0.01);rIFN-γ、rTNF-α、IL-12处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2mRNA表达进一步增加，而IL-10处理组与未处 理组相比，B7-1、B7-2mRNA表达则明显抑制，其差异具有显著性(P<0.01)。直线相关分析显示，B7-1、B7-2mRNA表达强度与蛋白表达强度相平行，其相关系数分别为r=0.773，0.675，(P<0.01)。
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表3 小鼠外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA表达 (ˉx±s) 注:q检验，与NS组比较 ▲ P<0.01，与EAM组比较 ˇ P<0.01
3 讨论
目前认为PM的发病与T细胞的异常活化有关。异常活化的T细胞与MHCⅡ类抗原结合，在肌纤维原位克隆扩 增后，分泌穿孔素，攻击靶肌纤维的C带，最终导致肌纤维的坏死 [6] 。最近的研究表明，T细胞的激活需要两个刺激信号:T细胞受体(TCR)与MHC复合物结合作为第一信号是T细胞激活的先决条件，决定免疫反应的特异性。第二信号为协同刺激分子与其受体相互作用所提供，主要通过CD28/CTLA-4、B7相互结合与APC作用实现 [7] ，促使T细胞激活、分化为效应细胞。
B7-1/B7-2表达于APC细胞，如活化的B细胞、树突状细胞及单核细胞表面，主要作为配体行使功能 [8] 。研究表明B7-1和B7-2在CD4辅助T细胞分化为效应细胞的过程中起着不同作用。B7-1主要促使Th 0 细胞向Th 1 细胞转化，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等细胞因子，介导细胞免疫;而B7-2主要促使Th 0 细胞向Th 2 细胞转化，分泌IL-4、IL-10，介导体液免疫。本研究观察到在EAM中B7-1和B7-2均明显增加，提示体液免疫和细胞免疫均参与了EAM的发生，与既往的临床及实验观察吻合 [1，2] 。B7-2分子可能与免疫反应的起始相关，B7-1则涉及免疫反应的持续和扩大。
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细胞因子按其对炎性反应的作用分为两类，一类为促炎性细胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。IL-2和IFN-γ是由Th 1 类细胞分泌的因子，IL-2可诱导CD8 + T细胞活化、克隆扩增及促进IFN-γ分泌，后者又能增强MHCⅠ、Ⅱ类抗原和粘附分子表达，TNF-α则进一步增强上述过程 [9] 。IL-12是由APC分泌的，可促进T细胞增生并分泌IFN-γ和TNF-α[9] 。另一类为抗炎性细胞因子如IL-10。IL-10可抑制CD4 + T细胞增生，分泌Th 1 细胞因子及巨噬细胞表达MHCⅡ类抗原和B7分子 [10，11] 。本研究发现IFN-γ、TNF-α、IL-12可明显增强肌炎组淋巴细胞B7蛋白的表达和mRNA转录，而IL-10则抑制B7基因的表达，提示在B7介导的多发性肌炎中，细胞因子可能通过调节B7基因的表达来影响T细胞活化，最终影响PM的转归。
, 百拇医药
参考文献
1 Waclawik AJ，Fadic R，Lotz BP，et al.CD8and CD4T cell-mediatedpolymyositis complicating the HTLV-1Associated myelopathy.Quantiˉ tative evaluation of corticosteroid treatment.Acta Neurol Scand，1996，94:115-119.
2 Matsubara S，Shima T，Takamori M，et al.Experimental allergic myositis in SJL/J mice immunized with rabbit myosin B fraction:Immunohistoˉchemical analysisand transfer.Acta Neuropathol(Berl)，1993，85:138-144.
, 百拇医药
3 Yang GC，Hellstrom KE，Mizuno MT，et al.In vitro priming of tumor-reactivecytolytic T lymphocytes by combing IL-10with B7-CD28costimulation.J Immunol，1995，155:3897-3903.
4 侯熙德，蔡昭，沈鸣九.实验性自身免疫性肌炎动物模型的研究.中华神经精神科杂志，1992，25:270.
5 杨欢，李静，肖波，等.粘附分子在实验性变态反应性神经炎淋巴细胞上的表达.中华神经科杂志，1998，31:33.
6 Dalakas MC.Molecular immunology and genetics of inflammatory muscle disease.Arch Neurol，1998，55:1509-1512.
, http://www.100md.com
7 Sandhys LD，Anands L，Barber WH，et al.A standardized approach to PCR-based emiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples.Lymphokine Cytokine Res，1993，12:59-67.
8 Peach RJJ，Bajorath J，Naemura G，et al.Both extracellular immunolˉglobuline-like domains of CD80contain residues critical for binding T cell surface receptors CTLA-4and CD28.J Bio Chem，1995，270:21181.
9 Behrens L，Kerschensteiner M，Misgeld T，et al.Human muscle cells exˉpress a functional costimulatory molecule distinct from B7.1(CD80)and B7.2(CD86)in vitro and in inflammatory lesions.J Immunol，1998，161:5943-5951.
, 百拇医药
10 Nikcevich KM，Gordon KB，Tan LT，et al.IFN-γ-activated primary murine astrocytes express B7costimulatory molecules and prime naive antigen-specific T cells.J Immunol，1997，158:514.
11 Alleva DG，Kaser SB，Beller DI.Intrinsic defects in macrophage IL-12production associated with immune dysfunction in the MRL/++and NZB/W Fl lupus-prone mice and leishmania major-susceptible BALB/c strain.J Immunol，1998，161:6878-6884.
(收稿日期:2003-11-13)
作者单位:1518029广东省深圳市红十字会医院神经内科
2410008湖南医科大学附属湘雅医院神经内科
3410013湖南医科大学附属第三医院神经内科
(编辑秋 实), 百拇医药(陶唯宜)
关键词 细胞因子 B7分子 EAM RT-PCR 流式细胞计
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)01-0001-03
, 百拇医药
The effects of cytokines on the B7expression of lymphocyte in
experimentalautoimmune myositis
Tao Weiyi，Xiao Bo，Peng Yong，et al.
Department of Neurology，Red Cross Hospital，Shengzhen518029.
【Abstract】 Objective To study the effects of IFN-γ，TNF-α，IL-10and IL-12on the B7mRNA and protein expression of lymphocyte in experimental autoimmune myositis(EAM).Methods FACS and RT-PCR techˉniques were used to assay the expression of B7in EAM lymphocytes and effects of cytokines.Results IFN-γ，TNF-αandIL-12increased the expression of B7，but IL-10inhibited all the expressions.Conclusion IFN-γ，TNF-α，IL-10and IL-12effected the B7expression in EAM lymphocytes.
, 百拇医药
Key words cytokine B7 EAM RT-PCR flow cytometry
实验性自身免疫性肌炎(EAM)是一种人工诱导类似人类多发性肌炎(PM)的动物模型，其病理改变与PM基本一致，即肌纤维的坏死和炎性细胞浸润。已有的研究表明PM发病与T细胞的异常活化有关 [1，2] 。T细胞的活化需要第一信号和第二信号参与，第二信号又称协同刺激信号，主要由T细胞上表达的CD28/CTLA-4与抗原递呈细胞(APC)表面的配体B7相互作用所提供 [3] 。本实验着重观察B7在EAM中的表达以及IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α对其影响，试从T细胞活化的角度探讨PM的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料 PE标记的抗B7-1、B7-2单克隆抗体购自美国Pharmingen公司，IL-10、IL-12、rIFN-γ、rTNF-α、RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自美国Promega公司，B7-1、B7-2、β-actin引物由中科院上海细胞生物研究所合成，弗氏完全佐剂(CFA)及其它免疫试剂购自北京邦定生物公司。
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1.2 方法
1.2.1 动物模型和分组 健康雄性昆明小鼠40只(6～8周，25～30g)由湖南医科大学实验动物中心提供。随机分为肌炎组10只(EAM)，对照组10只(0.9%NS)。取兔肌肉 ˇ 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:39870909)匀浆0.1ml加等量CFA混匀制成0.2ml抗原乳剂注入EAM组小鼠颈部肌肉和皮下组织，1周后重复诱导1次;对照组用生理盐水取代兔肌肉匀浆加等量CFA混匀注射。发病动物症状体征分级标准见文献 [4] 。两组动物分别于免疫后22天或濒死前，用3%异戊巴比妥钠0.2ml注入小鼠腹腔，麻醉后用无菌注射器于心脏采血，肝素抗凝，同时取脾脏备检。另取大腿肌肉置于10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片做HE染色，行光镜检查。
1.2.2 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2蛋白表达 外周血淋巴细胞分离方法见文献 [5]。脾脏经200目钢网过筛，用Ficoll液分离淋巴细胞，Hank’s液洗2次，重悬于含10%小牛血清的1640培养液中备用。淋巴细胞分为细胞因子处理组和未处理组，分别置于96孔细胞培养板中，在37℃、5%CO 2 中孵育72h。内加5μg/ml ConA诱导，培养基中含45%DMEM、10%FCS、10mM HEPES、50μg/ml青霉素/链霉素;处理组在上述培养基分别加入100U/ml rIFN-γ、250U/ml rTNF-α、10μg/ml IL-10、20μg/ml IL-12刺激，在培养后24、48、72h取细胞因子处理组和未处理组淋巴细胞1×10 7 个，分别加B7-1和B7-2单抗1μg，置4℃孵育30min，4000rpm×5min，取沉淀加PBS洗2次，4000rpm×5min，沉淀加0.5ml PBS及20μl戊二醛固定液，流式细胞计检测淋巴细胞上B7-1和B7-2蛋白的表达。
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1.2.3 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA表达水平
1.2.3.1 cDNA合成和PCR扩增 取细胞因子处理组和未处理组培养的淋巴细胞1×10 7 个，采用异硫氰酸胍法提取RNA。取样品RNA0.2μg，加Oligo(dT)引物1μl(100ng/μl)，5×反转录缓冲液4μl，95℃5min，冷却后加入Rnasin20U、2.5mM dNTP4μl、AMV转录酶5U，总反应体积20μl，42℃反应60min，然后94℃3min灭活AMV酶，置-20℃冰箱保存。取cDNA反应液10μl，置0.5ml Eppendorf管中，分别加入2.5mM dNTP4μl，Taq酶1U，10×PCR缓冲液5μl，β-actin上、 下游引物各1μl(10pmol/μl)，B7-1或B7-2上下游引物各2μl(10pmol/μl)，引物序列见表1，加去离子双蒸水至终体积50μl，再用50μl石蜡油覆盖，95℃变性5min，反应条件为95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸5min。
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表1 B7-1、B7-2、β-actin引物序列
1.2.3.2 PCR产物的分析 20μl PCR扩增产物在含有0.5μg/μl溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，时间1h，电压5V/cm。电泳后凝胶在Eagle EyeⅡ型图像处理系统上计算出B7-1、B7-2、β-actin密度，用β-actin密度作为参照，求出B7-1、B7-2基因表达的相对值。
1.3 数据处理 结果以均数±标准差表示(ˉx±s)，用t检验进行统计学处理，并进行相关分析。
2 结果
2.1 发病情况和组织病理学改变 NS组无动物发病，EAM组在免疫后的第14～18天先后发病，22天左右达高 峰。EAM组小鼠发病率为80%，且以中重度为主，体重明显减轻。光镜HE染色显示，发病的小鼠肌肉有大量炎性细胞浸润伴肌纤维的坏死。
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2.2 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2蛋白的表达 如表2所示，NS组B7-1、B7-2有少量表达，EAM组B7-1、B7-2表达明显增加(P<0.01);rIFN-γ、rTNF-α、IL-12处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2表达进一步增加，而IL-10处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2表达则明显受到抑制(P<0.01)。
表2 小鼠外周血和脾淋巴细胞中协同刺激分子蛋白的表达 (ˉx±s) 注:q检验，与NS组比较 ▲ P<0.01，与EAM组比较 ˇ P<0.01， ˇˇ P<0.05
2.3 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA的表达 如表3所示，NS组B7-1、B7-2mRNA表达量较少，EAM组B7-1、B7-2mRNA显著增多，差异具有显著性(P<0.01);rIFN-γ、rTNF-α、IL-12处理组与未处理组相比，B7-1、B7-2mRNA表达进一步增加，而IL-10处理组与未处 理组相比，B7-1、B7-2mRNA表达则明显抑制，其差异具有显著性(P<0.01)。直线相关分析显示，B7-1、B7-2mRNA表达强度与蛋白表达强度相平行，其相关系数分别为r=0.773，0.675，(P<0.01)。
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表3 小鼠外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA表达 (ˉx±s) 注:q检验，与NS组比较 ▲ P<0.01，与EAM组比较 ˇ P<0.01
3 讨论
目前认为PM的发病与T细胞的异常活化有关。异常活化的T细胞与MHCⅡ类抗原结合，在肌纤维原位克隆扩 增后，分泌穿孔素，攻击靶肌纤维的C带，最终导致肌纤维的坏死 [6] 。最近的研究表明，T细胞的激活需要两个刺激信号:T细胞受体(TCR)与MHC复合物结合作为第一信号是T细胞激活的先决条件，决定免疫反应的特异性。第二信号为协同刺激分子与其受体相互作用所提供，主要通过CD28/CTLA-4、B7相互结合与APC作用实现 [7] ，促使T细胞激活、分化为效应细胞。
B7-1/B7-2表达于APC细胞，如活化的B细胞、树突状细胞及单核细胞表面，主要作为配体行使功能 [8] 。研究表明B7-1和B7-2在CD4辅助T细胞分化为效应细胞的过程中起着不同作用。B7-1主要促使Th 0 细胞向Th 1 细胞转化，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等细胞因子，介导细胞免疫;而B7-2主要促使Th 0 细胞向Th 2 细胞转化，分泌IL-4、IL-10，介导体液免疫。本研究观察到在EAM中B7-1和B7-2均明显增加，提示体液免疫和细胞免疫均参与了EAM的发生，与既往的临床及实验观察吻合 [1，2] 。B7-2分子可能与免疫反应的起始相关，B7-1则涉及免疫反应的持续和扩大。
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细胞因子按其对炎性反应的作用分为两类，一类为促炎性细胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。IL-2和IFN-γ是由Th 1 类细胞分泌的因子，IL-2可诱导CD8 + T细胞活化、克隆扩增及促进IFN-γ分泌，后者又能增强MHCⅠ、Ⅱ类抗原和粘附分子表达，TNF-α则进一步增强上述过程 [9] 。IL-12是由APC分泌的，可促进T细胞增生并分泌IFN-γ和TNF-α[9] 。另一类为抗炎性细胞因子如IL-10。IL-10可抑制CD4 + T细胞增生，分泌Th 1 细胞因子及巨噬细胞表达MHCⅡ类抗原和B7分子 [10，11] 。本研究发现IFN-γ、TNF-α、IL-12可明显增强肌炎组淋巴细胞B7蛋白的表达和mRNA转录，而IL-10则抑制B7基因的表达，提示在B7介导的多发性肌炎中，细胞因子可能通过调节B7基因的表达来影响T细胞活化，最终影响PM的转归。
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参考文献
1 Waclawik AJ，Fadic R，Lotz BP，et al.CD8and CD4T cell-mediatedpolymyositis complicating the HTLV-1Associated myelopathy.Quantiˉ tative evaluation of corticosteroid treatment.Acta Neurol Scand，1996，94:115-119.
2 Matsubara S，Shima T，Takamori M，et al.Experimental allergic myositis in SJL/J mice immunized with rabbit myosin B fraction:Immunohistoˉchemical analysisand transfer.Acta Neuropathol(Berl)，1993，85:138-144.
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3 Yang GC，Hellstrom KE，Mizuno MT，et al.In vitro priming of tumor-reactivecytolytic T lymphocytes by combing IL-10with B7-CD28costimulation.J Immunol，1995，155:3897-3903.
4 侯熙德，蔡昭，沈鸣九.实验性自身免疫性肌炎动物模型的研究.中华神经精神科杂志，1992，25:270.
5 杨欢，李静，肖波，等.粘附分子在实验性变态反应性神经炎淋巴细胞上的表达.中华神经科杂志，1998，31:33.
6 Dalakas MC.Molecular immunology and genetics of inflammatory muscle disease.Arch Neurol，1998，55:1509-1512.
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7 Sandhys LD，Anands L，Barber WH，et al.A standardized approach to PCR-based emiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples.Lymphokine Cytokine Res，1993，12:59-67.
8 Peach RJJ，Bajorath J，Naemura G，et al.Both extracellular immunolˉglobuline-like domains of CD80contain residues critical for binding T cell surface receptors CTLA-4and CD28.J Bio Chem，1995，270:21181.
9 Behrens L，Kerschensteiner M，Misgeld T，et al.Human muscle cells exˉpress a functional costimulatory molecule distinct from B7.1(CD80)and B7.2(CD86)in vitro and in inflammatory lesions.J Immunol，1998，161:5943-5951.
, 百拇医药
10 Nikcevich KM，Gordon KB，Tan LT，et al.IFN-γ-activated primary murine astrocytes express B7costimulatory molecules and prime naive antigen-specific T cells.J Immunol，1997，158:514.
11 Alleva DG，Kaser SB，Beller DI.Intrinsic defects in macrophage IL-12production associated with immune dysfunction in the MRL/++and NZB/W Fl lupus-prone mice and leishmania major-susceptible BALB/c strain.J Immunol，1998，161:6878-6884.
(收稿日期:2003-11-13)
作者单位:1518029广东省深圳市红十字会医院神经内科
2410008湖南医科大学附属湘雅医院神经内科
3410013湖南医科大学附属第三医院神经内科
(编辑秋 实), 百拇医药(陶唯宜)