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编号:10400126
乙型肝炎患者HBV-DNA定量检测与HBV血清学标志组合的关系
http://www.100md.com 《中华中西医杂志》 2003年第13期
     【摘要】 目的 了解HBV感染的不同血清学组合的HBV-DNA阳性情况。方法 对324例患者血清同时进行ELISA方法测定HBV-M及荧光定量PCR法检测HBV-DNA。结果 HBsAg(+)组HBV-DNA阳性率为78.4%(254/324),HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率为4.8%(5/103),两者差异有显著性。HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为100%(120/120),平均含量为1.61×10E7拷贝/ml;HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为47%(76/162),平均含量为3.42×10E4拷贝/ml;HBsAg(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为69%(29/42),平均含量为6.32×10E3拷贝/ml;HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为5.2%(5/96),平均含量为4.12×10E1拷贝/ml。结论 定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。
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    关键词 乙型肝炎病毒 DNA ELISA

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)13-1944-02

    The relation of quantitative HBV-DNA to its serological markers

    Xu Ruihuan,Huang Xingguo,Song Shijun,et al.

    Shenzhen Longgang Center Hospital,Shenzhen518116.

    【Abstract】 Objective To study HBV-DNA positve rates under its different serological groups.Methods 324HBV serum are detected by ELISA and quantitative PCR technique.Results The HBV-DNA positive rate is78.4%(254/324),and4.8%(5/103)for its negative group.There were significantly differences between the two groups(P<0.05).100%positive rate of HBV-DNA is to HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)serum about averˉage1.61×10E7copies/ml,47%(76/162)to HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about3.42×10E4copies/ml,69%(29/42)to HBsAg(+)HBcAb(+)about average6.32×10E3copies/ml,5.2%(5/96)to HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about average4.12×10E1copies/ml.Conclusion Quantitative PCR can really response HBV infection and duplication and disease progress,it provides much more information for HBV diagnosis and theraˉpy.
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    Key words hepatitis B virus deoxyribonucleic acid enzyme linked immunosorbent assay

    采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎病毒HBV标志(HBV-M)简便易行,一直为许多临床科室使用。而近年来应用聚合酶链反应(PCR)技术定量的检测HBV-DNA进一步提高了检测的质量。有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析,指导临床应用。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 2002年6~9月来我院住院及门诊的423例患者,年龄13~66岁。所有标本用无菌管留取血样3ml,于3h内分离血清,并冻存于-20℃冰箱。

    1.2 主要试剂与仪器 HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用ELISA法,试剂由上海科华生物工程公司提供。
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    1.3 检测方法

    1.3.1 ELISA试验 按试剂说明书进行。

    1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA (1)样本处理:取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100μl,分别加到0.5ml离心管中,100μl DNA提取液1,振荡混匀,13000rpm离心10s,25μl DNA提取液2,振荡10s,200rpm离心10s,100℃干浴或沸水浴10s,13000rpm离心10s,保留上清备用。(2)反应体系为40μl:37.6μl PCR反应液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。(3)循环条件为:37℃5min、94℃1min、95℃5s,60℃30s42个循环。荧光信号收集在60℃。

    1.3.3 污染的控制 标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行,每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。美国Bio-Rad公司生产的Icycler荧光定量PCR仪,芬兰Labsystems生产的Multiskan MK3酶标仪。
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    1.4 统计学方法 采用SPSS软件进行χ 2 检验。

    2 结果

    2.1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。

    表1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 (略)

    2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果 324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果见表2。

    表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果

    3 讨论

    ELISA试验检测乙型肝炎病毒(HBV)已成为临床常规。乙肝5项的检测为临床提供一定的信息 [1,2] ,但对HBsAg阴性者,本实验发现有5%的HBV-DNA阳性,且拷贝数在10E4拷贝/ml左右,与某些文献报道相似 [3] 。其原因可能由于(1)HBV发生变异。其前S区变异率比S区高2倍;前C/C区变异研究较多。(2)HBsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大,用现有的试剂检测不出。(3)形成免疫复合物。有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HBsAg的检出 [4]
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    HBV-DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况 [5,6] ,本试验结果为HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA全部阳性,平均含量为1.61×10E7拷贝/ml;HBsAg(+)、HBeAb(+),HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为47%,平均含量为3.42×10E4拷贝/ml;HBˉsAg(+)、HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为69%,平均含量为6.32×10E3拷贝/ml,而HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为5.2%,平均拷贝数为4.12×10E1拷贝/ml,由此可以看出血清中HBV-DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的,对乙型肝炎的临床诊断,特别是对其疗效有较大的指导 意义 [7] 。本实验发现HBsAg(+)、HBcAb(+)的阳性率为69%比HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的阳性率(47%)高,且差别显著(P<0.05)。有两种可能解释,一是HBV复制减少或停止;一是HBsAg前C基因发生变异。根据Ferˉruccio Bonino来华报告,急性乙型肝炎时HBV标志物的变化图显示HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率明显低于HBsAg(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率。
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    本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高,操作简单,克服假阳性结果,无需PCR后处理,防污染效果好,可直接反映病毒在体内的存在情况,已为临床普遍应用。而血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应,间接反映病毒的感染状况。本试验显示两者既有相关,又不尽一致,临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。

    参考文献

    1 Vrielink H,Reesink HW.Performance of three generations of anti-hepˉatitis C virus ELISA in donors and patients.Transfusion,1997,37:845-849.

    2 吴杰.PCR法检测食品从业人员血清中的HBV-DNA与ELISA法检测结果比较.现代预防医学,1999,26(4):501-502.
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    3 王志钢,毕平安,金利民,等.乙肝患者血清HBV-DNA检出率分析.上海医学检验杂志,1999,14(6):350.

    4 田庚善.传染病学.第三版.上海:上海科学技术出版社,1998,237-260.

    5 王平忠,周永兴,白雪帆,等.乙型肝炎病毒DNA定量检测及意义.第四军医大学学报,2000,21(7):811-813.

    6 Roth WK,Weber M,Seifried.Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis C virus,hepatitis B virus and HIV-1in a blood-bank setting.Lancet,1999,353:359-363.

    7 张春平.施保利通合乙肝疫苗对乙型肝炎病毒标志物的影响.现代中西医结合杂志,2001,10(9):1844-1845.

    作者单位:1518116广东省深圳市龙岗中心医院中心实验室

    2广东省深圳市龙岗区妇幼保健院

    (编辑小 川), http://www.100md.com(许瑞环)