人肝癌细胞株Survivin基因产物的表达及意义
【摘要】 目的 了解人肝癌细胞株SMMC-7721中survivin基因的表达情况，为进一步研究肝癌的发生与进展提供帮助。方法 利用Western blot法检测survivin蛋白在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达。结果 Western blot显示survivin蛋白在人肝癌细胞株SMMC-7721中存在着表达。结论 Survivin基因的表达在不同的肝癌中都起到了抑制凋亡促进增殖的作用。
关键词 肝癌 survivin 细胞株
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1853-02
The expression of survivin gene product in a human
hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721)
, 百拇医药
Wang Fang，L Shen，Cui Zhiming，et al.
Department of surgery，The First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective To investigate the expression of survivin gene in ahuman hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721)and provide some evidencesfor further research.Methods Expression of survivin protein was evaluated by western blot analysis.Results Survivin protein expression was detected in the human hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721).Conclusion The expression of survivin gene which in different human hepatoˉcellular carcinoma was proved thatit inhibited can fallen and prompted proliferation of cells. Key words hepatocarcinoma survivin cell strain
, 百拇医药
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展机制尚未完全阐明，但细胞凋亡的抑制在肝癌发生、发展中的作用不可否定。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptoˉsis protein，IAP)家族成员之一，几乎表达于所有人类常见肿瘤组织中，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达 [1] 。目前国内外对肝癌与survivin的研究报道较少，本实验对人肝癌细胞株SMMC-7721中survivin蛋白表达的情况进行了检测，从而了解人肝癌中有无survivin表达，并为进一步开展二者相关研究提供依据及帮助。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 传代人肝癌细胞株SMMC-7721购自中科院细胞库。细胞接种于含10%灭活小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，置于5%CO 2 孵箱内培养。取对数生长期细胞用于实验。
, http://www.100md.com
1.2 蛋白提取 将预冷至4℃的细胞裂解液，加入到经PBS漂洗的培养细胞中，冰上作用20min，12000g离心3min，上清液分装保存于-80℃。
1.3 SDS-PAGE电泳和免疫印迹 采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以200μg/孔上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，切部分凝胶直接以考马斯亮蓝染色，其余部分通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至NC膜(硝酸纤维素膜)上，NC膜在含5%脱脂奶粉的TTBS中37℃封闭90min，加入兔抗人survivin多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，稀释度为1∶500)，4℃孵育过夜，TTBS漂洗(10min×3次)，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购自北京中山生物技术有限公司，稀释度为1∶1000)，37℃作用40min，TTBS漂洗(10min×3次)，DAB显色后观察结果。 作者单位:1116011大连医科大学附属一院普外科2116027大连医科大学附属二院实验中心 2 结果考马斯亮蓝染色凝胶显示不同分子量的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离出来，western blot显示人肝癌细胞株SMMC-7721中有survivin蛋白的表达，DAB染色后在相对分子质量16，500处可见棕色条带(见图1)。图1 survivin蛋白的表达(western blot)
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3 讨论
细胞凋亡是机体重要的生理过程，对内环境稳定具有至关重要的作用，目前已证实p53、bcl-2家族等在细胞凋亡的调控中占有重要地位 [2] 。人类survivin基因作为IAP家族中的重要成员，位于染色体17q25，全长14.7Kb，编码由142个氨基酸组成的分子量为16.5kDa的蛋白 [3] 。Surˉvivin蛋白与其它IAP蛋白相比其独特之处在于，仅包含1个部分保守的BIR序列，而没有羧基末端的环指结构，代之以羧基末端的α螺旋缠绕区 [3] ，它在胚胎组织和绝大多数肿瘤中有显著表达，但在成人终末分化组织中不表达 [4] 。Ito等对人肝癌的研究发现survivin提高了肝癌细胞的增殖能力 [5] ，由此可见survivin不仅抑制细胞的凋亡，还可促进细胞的增殖，并有研究表明survivin参与调节细胞的有丝分裂且可能参与血管生成。Survivin表达的选择性和作用的多样性使其成为肿瘤研究中一个良好的靶点。本研究发现人肝癌细胞株SMMC-7721中存在survivin蛋白的表达。Ikeguchi M等应用免疫组化等方法也证实了在肝癌组织中存在着survivin基因的表达 [6] ，这与我们的发现有一定相同的意义，可见在不同的肝癌组织中都存在着survivin基因的表达，这些结果也提示survivin基因的表达在不同人的肝癌中都起到了抑制凋亡、促进增殖的作用。SMMC-7721是一个常被用作肝癌研究的人类肿瘤细胞株，确定其有无surˉvivin基因的表达，将对利用survivin基因进行肝癌的基础及治疗研究提供帮助。
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参考文献
1 Nam NH，Parang K.Current targets for anticancer drug discovery.Curr Drug Targets.2003，4:159-179.
2 Jiang MC，Yang-Yen HF，Lin JK，et al.Differential regulation of P53，c-Myc，Bcl-2and Bax protein expression during apoptosis induced by widely divergent stimuli in human hepatoblastoma cells.Oncogene，1996，13(3):609-616.
3 Ambrosini G，Adida C，Sirugo G，et al.Induction of apoptosis and inhiˉbition of cell proliferation by survivin gene targeting.J Biol chem，1998，273:11177-11182.
, 百拇医药
4 Ambrosini G，Adida C.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expresˉsion in cancer and lymphoma.Nat Med，1997，3(8):917-921.
5 Ito T，Shirak K，Sugimato K，et al.Survivin promotes cell proliferation inhuman hepatocellular carcinoma.Hepatology，2000，31(5):1080-1085.
6 Masahide Ikeguchi，Yasuaki Hirooka，Nobuaki Kaibara.Quantitative analysis of apoptosis-related gene expression in hepatocellular carcinoˉma.Cancer，2002，95(9):1938-1945.
作者单位：116011大连医科大学附属一院普外科
2116027大连医科大学附属二院实验中心
(编 辑 心怡), 百拇医药(王 芳 吕申 崔志明 李 冰)
关键词 肝癌 survivin 细胞株
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1853-02
The expression of survivin gene product in a human
hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721)
, 百拇医药
Wang Fang，L Shen，Cui Zhiming，et al.
Department of surgery，The First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective To investigate the expression of survivin gene in ahuman hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721)and provide some evidencesfor further research.Methods Expression of survivin protein was evaluated by western blot analysis.Results Survivin protein expression was detected in the human hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721).Conclusion The expression of survivin gene which in different human hepatoˉcellular carcinoma was proved thatit inhibited can fallen and prompted proliferation of cells. Key words hepatocarcinoma survivin cell strain
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肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展机制尚未完全阐明，但细胞凋亡的抑制在肝癌发生、发展中的作用不可否定。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptoˉsis protein，IAP)家族成员之一，几乎表达于所有人类常见肿瘤组织中，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达 [1] 。目前国内外对肝癌与survivin的研究报道较少，本实验对人肝癌细胞株SMMC-7721中survivin蛋白表达的情况进行了检测，从而了解人肝癌中有无survivin表达，并为进一步开展二者相关研究提供依据及帮助。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 传代人肝癌细胞株SMMC-7721购自中科院细胞库。细胞接种于含10%灭活小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，置于5%CO 2 孵箱内培养。取对数生长期细胞用于实验。
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1.2 蛋白提取 将预冷至4℃的细胞裂解液，加入到经PBS漂洗的培养细胞中，冰上作用20min，12000g离心3min，上清液分装保存于-80℃。
1.3 SDS-PAGE电泳和免疫印迹 采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以200μg/孔上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，切部分凝胶直接以考马斯亮蓝染色，其余部分通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至NC膜(硝酸纤维素膜)上，NC膜在含5%脱脂奶粉的TTBS中37℃封闭90min，加入兔抗人survivin多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，稀释度为1∶500)，4℃孵育过夜，TTBS漂洗(10min×3次)，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购自北京中山生物技术有限公司，稀释度为1∶1000)，37℃作用40min，TTBS漂洗(10min×3次)，DAB显色后观察结果。 作者单位:1116011大连医科大学附属一院普外科2116027大连医科大学附属二院实验中心 2 结果考马斯亮蓝染色凝胶显示不同分子量的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离出来，western blot显示人肝癌细胞株SMMC-7721中有survivin蛋白的表达，DAB染色后在相对分子质量16，500处可见棕色条带(见图1)。图1 survivin蛋白的表达(western blot)
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3 讨论
细胞凋亡是机体重要的生理过程，对内环境稳定具有至关重要的作用，目前已证实p53、bcl-2家族等在细胞凋亡的调控中占有重要地位 [2] 。人类survivin基因作为IAP家族中的重要成员，位于染色体17q25，全长14.7Kb，编码由142个氨基酸组成的分子量为16.5kDa的蛋白 [3] 。Surˉvivin蛋白与其它IAP蛋白相比其独特之处在于，仅包含1个部分保守的BIR序列，而没有羧基末端的环指结构，代之以羧基末端的α螺旋缠绕区 [3] ，它在胚胎组织和绝大多数肿瘤中有显著表达，但在成人终末分化组织中不表达 [4] 。Ito等对人肝癌的研究发现survivin提高了肝癌细胞的增殖能力 [5] ，由此可见survivin不仅抑制细胞的凋亡，还可促进细胞的增殖，并有研究表明survivin参与调节细胞的有丝分裂且可能参与血管生成。Survivin表达的选择性和作用的多样性使其成为肿瘤研究中一个良好的靶点。本研究发现人肝癌细胞株SMMC-7721中存在survivin蛋白的表达。Ikeguchi M等应用免疫组化等方法也证实了在肝癌组织中存在着survivin基因的表达 [6] ，这与我们的发现有一定相同的意义，可见在不同的肝癌组织中都存在着survivin基因的表达，这些结果也提示survivin基因的表达在不同人的肝癌中都起到了抑制凋亡、促进增殖的作用。SMMC-7721是一个常被用作肝癌研究的人类肿瘤细胞株，确定其有无surˉvivin基因的表达，将对利用survivin基因进行肝癌的基础及治疗研究提供帮助。
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参考文献
1 Nam NH，Parang K.Current targets for anticancer drug discovery.Curr Drug Targets.2003，4:159-179.
2 Jiang MC，Yang-Yen HF，Lin JK，et al.Differential regulation of P53，c-Myc，Bcl-2and Bax protein expression during apoptosis induced by widely divergent stimuli in human hepatoblastoma cells.Oncogene，1996，13(3):609-616.
3 Ambrosini G，Adida C，Sirugo G，et al.Induction of apoptosis and inhiˉbition of cell proliferation by survivin gene targeting.J Biol chem，1998，273:11177-11182.
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4 Ambrosini G，Adida C.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expresˉsion in cancer and lymphoma.Nat Med，1997，3(8):917-921.
5 Ito T，Shirak K，Sugimato K，et al.Survivin promotes cell proliferation inhuman hepatocellular carcinoma.Hepatology，2000，31(5):1080-1085.
6 Masahide Ikeguchi，Yasuaki Hirooka，Nobuaki Kaibara.Quantitative analysis of apoptosis-related gene expression in hepatocellular carcinoˉma.Cancer，2002，95(9):1938-1945.
作者单位：116011大连医科大学附属一院普外科
2116027大连医科大学附属二院实验中心
(编 辑 心怡), 百拇医药(王 芳 吕申 崔志明 李 冰)