金纳多对局灶性大脑皮层神经细胞缺血再灌流后Bax、Bcl-2的影响
【摘要】 目的 探讨金纳多对缺血后再灌流神经元的保护作用及作用机制。方法 用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠模型，于术后第1天，第2天，第3天分别以0.05ml/kg，0.1ml/kg，0.2ml/kg剂量腹腔注射金纳多针剂每天1次。观察金纳多对脑缺血程度，梗塞体积，Bax、Bcl-2蛋白合成的影响。结果 金纳多能减轻脑缺血程度，减少梗塞体积，提高半暗带内Bcl-2的合成并减低Bax的合成，各组剂量间差异无显著性。结论 金纳多对保护神经细胞免受缺血性损害有一定效果。其作用可能与Bax、Bcl-2含量改变有关。
关键词 金纳多 脑缺血 再灌流 Bax Bcl-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)04-0297-02
Effect of JinNaDuo on the expression of Bax，Bcl-2in cortex of rat
, 百拇医药
brain following local cerebral ischemia reperfusion
Qiu Xuecai，Gu Ling，Tang Taikun，et al.
Dpet of Nearalogy of Kun-Ming Yan-an Hospital，Yun Nan Provice650051.
【Abstract】 Objective To evaluate the effect and functional mecheism of JinNaDuo to protect neuron of cereˉbra following acute ischemia.Methods After the model ischemia/reperfusion was established in male SD rat，the efˉfect of JinNaDuo on the expression of Bax，Bcl-2following local ischamia was studied by immunohistochemical ABC method using specific antiserum of Bax，Bcl-2，The relativelevel of Bax，Bcl-2was decided by computer image analysis system.Results Cerebral ischemia/reperfusion results in upregulation of expression of Bax and downregulaˉtion of Bcl-2in neuron of cerebral cortex.Conclusion JinNaDuo can protect neurons of cerebral cortox with actute ischemia，and it may be related to the expression of Bax，Bcl-2that JinNaDuo protects neurons with actute ischemia.
, 百拇医药
Key words JinNaDuo cerebral ischemia refusion Bax Bcl-2
金纳多属于细胞保护剂的一种，该制剂系银杏叶提取物，它进入我国国内市场的时间并不长。本文谨此探讨金纳多对缺血后再灌流大脑皮层神经细胞的保护作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 将SD大鼠(由云南省实验动物质量合格证明的昆明医学院实验动物中心提供)20只，雌雄各半，随机分成2组，每组10只，对10只动物作局灶性缺血对照组，10只动物作局灶性缺血后用金纳多治疗。
1.2 大鼠大脑局灶性缺血再灌流模型的制备 [1] 用戊巴比妥钠对成年SD大鼠(体重250～320g)进行腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，纵向切开正中颈部皮肤及皮下组织，暴露左颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。在ECA近CCA2mm处剪下一小切口，将一端椭圆略膨胀，长约6cm，直径0.2mm的鱼线插入ECA后转入ICA，徐徐推进至略感阻力，提示鱼线盲端已达大脑中动脉。
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1.3 金纳多干预 用金纳多针于缺血后6h按0.1ml/kg腹腔注射1次，第2天、第3天各再注射1次。
1.4 取材、切片，测量梗塞区，免疫组化染色 [2] 将每例动物的大脑标本用4%多聚甲醛固定后入20%蔗糖PBS，待组织块下沉后制作成20μm厚的冰冻切片。间隔取每例大脑皮质的5张切片，用Bax、Bcl-2免疫血清(购自美国Santa Cruz公司，由北京中山生物技术公司分装)按常规ABC法染片，DAB棕色反应显色。镜下观察该两因子在半暗带的皮层神经元(100/切面)，用MIAS-200型图象分析系统测定各区Bax、Bcl-2的相对含量(根据设定:平均灰度值与物质含量呈反向关系，即灰度值越高，含量越少)。结果用方差分析进行统计学处理。对照实验组用PBS代替一抗，余同，结果阴性。
2 结果
正常大脑皮层神经元，可见Bax、Bcl-2的免疫阳性细胞，胞浆染色。金纳多对脑梗塞体积减少及Bax、Bcl-2表达的影响结果见表1。
, 百拇医药
表1 金纳多对梗塞体积减少(%)、Bax、Bcl-2 平均灰度的影响 (X±s) 注: ˇ 与对照组比较，差异有显著性。
表1显示，金纳多针组的梗塞体积百分数较缺血对照组明显减小，表明金纳多可减少因局灶性缺血形成的脑梗塞灶。此外，神经元内Bcl-2、Bax的平均灰度值分别较对照组者有明显降低和升高，表明金纳多处理后半暗带神经元内Bcl-2的含量有明显增高，而Bax的含量则明显减少(P<0.01)。
3 讨论
Bcl-2家族包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-1、Bcl-X和促进凋亡的Bax、Bak、Bcl-xs、Bik等，两类因子的比例决定了细胞是否发生凋亡。Shinoura等的研究 [3] 表明:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-X等有明确的抗凋亡作用，可用于缺血性卒中的治疗。
, 百拇医药 本实验结果显示Bax、Bcl-2的变化如下:Bax的平均灰度明显升高，表明其合成明显降低，而Bcl-2的平均灰度明显降低，则表明其合成明显增加。有关文献报道 [4] :Bax、Bcl-2是影响细胞凋亡的两个对立因素，Bax有促进细胞凋亡作用，Bcl-2有抑制细胞凋亡的作用。故本例中出现Bax减少，Bcl-2增加，表明金纳多能减少大脑皮层神经细胞凋亡，减轻脑梗塞的严重程度。
金纳多是从天然珍贵植物银杏的叶片提取的物质，它能够使局灶性大脑缺血后再灌注的继发性损伤减轻，并能改善线粒体的功能，减轻血管通透性，稳定细胞膜，消除水和钠的增加等不利因素 [5] ，它的剂量与作用效果呈正相关改变。Tietjen等报道，在对脑血管疾病患者用银杏提取物处理后，其脑血流灌注总量增加8%以上 [6] 。目前已公认的对局灶性脑缺血的救治方法主要是力求及早改善大脑的缺血状态，重点是防止半暗带细胞进一步凋亡，故我们推测，金纳多对脑缺血的保护作用可能在于有利于阻止半暗带细胞的继发性损害，而金纳多对脑缺血再灌流神经元及胶质细胞的保护作用机制可能与金纳多改善血循环的功能有关。
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我们可以从上述实验结果初步得出金纳多针直接减少 局灶性脑缺血梗塞体积的有力证据，可进一步为金纳多治疗脑缺血性损害提供相关依据。大鼠大脑局灶性缺血再灌流损伤时，神经细胞凋亡及其调控基因表达的变化已有相关报道 [7] ，局灶性脑缺血致人脑皮质细胞凋亡及Bax、Bcl-2发生不同程度的变化也已为诸多实验所证实 [8] 。本组研究中，金纳多处理后半暗带神经元内Bcl-2的含量有明显增加，而Bax的含量则明显减少。笔者推断:金纳多对保护神经细胞免受缺血性损害有一定效果，其作用可能与Bax、Bcl-2含量改变有关。
参考文献
1 柏顺明，冯忠堂，王廷华，等.大鼠大脑中动脉供血区脑梗塞的实用动物模型.昆明医学院学报，2001，22(4B):99-101.
2 顾玲，高玉培，唐太昆，等.Trk C在成年猫脊髓和背根节的分布.昆明医学院学报，2000，21(1):34.
, http://www.100md.com
3 Shinoura N，Satou R，Yoshida Y，et al.Adenovirus-mediated transfer of bcl-X(1).protects neuronal cells from bax-induced apoptosis.Exp Cell Res，2000，254(2):221-231.
4 张文明，朱维钦，林建华.细胞凋亡与周围神经损伤后运动神经元死亡.中华创伤杂志，2000，16(1):51.
5 IETJEN CS，HURN p d，ULATOWSKI JA，et al.Treatment modalities for hypertersive patients with intracranial pathology L:options and risks.Critical Care Medicine，1996，24:311-322.
6 冯小平.银杏叶提取物改善心肌缺血/再灌注损伤及微循环障碍的作用.中国微循环杂志，1997，2(1):25.
7 储照虎，吴家冥，刘富东，等.大鼠局灶性脑缺血再灌流损伤时神经细胞凋亡及其调控基因的表达.临床神经病学杂志，2000，13(3):134-136.
8 徐评议，林建文，梁秀龄.神经细胞凋亡的分子调控.国外医学·内科学分册，1997，24(10):419-420.
(收稿日期:2003-01-23)
作者单位:650051云南省昆明市延安医院神经科
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(邱学才 顾 玲 唐太昆 杨云芳)
关键词 金纳多 脑缺血 再灌流 Bax Bcl-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)04-0297-02
Effect of JinNaDuo on the expression of Bax，Bcl-2in cortex of rat
, 百拇医药
brain following local cerebral ischemia reperfusion
Qiu Xuecai，Gu Ling，Tang Taikun，et al.
Dpet of Nearalogy of Kun-Ming Yan-an Hospital，Yun Nan Provice650051.
【Abstract】 Objective To evaluate the effect and functional mecheism of JinNaDuo to protect neuron of cereˉbra following acute ischemia.Methods After the model ischemia/reperfusion was established in male SD rat，the efˉfect of JinNaDuo on the expression of Bax，Bcl-2following local ischamia was studied by immunohistochemical ABC method using specific antiserum of Bax，Bcl-2，The relativelevel of Bax，Bcl-2was decided by computer image analysis system.Results Cerebral ischemia/reperfusion results in upregulation of expression of Bax and downregulaˉtion of Bcl-2in neuron of cerebral cortex.Conclusion JinNaDuo can protect neurons of cerebral cortox with actute ischemia，and it may be related to the expression of Bax，Bcl-2that JinNaDuo protects neurons with actute ischemia.
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Key words JinNaDuo cerebral ischemia refusion Bax Bcl-2
金纳多属于细胞保护剂的一种，该制剂系银杏叶提取物，它进入我国国内市场的时间并不长。本文谨此探讨金纳多对缺血后再灌流大脑皮层神经细胞的保护作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 将SD大鼠(由云南省实验动物质量合格证明的昆明医学院实验动物中心提供)20只，雌雄各半，随机分成2组，每组10只，对10只动物作局灶性缺血对照组，10只动物作局灶性缺血后用金纳多治疗。
1.2 大鼠大脑局灶性缺血再灌流模型的制备 [1] 用戊巴比妥钠对成年SD大鼠(体重250～320g)进行腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，纵向切开正中颈部皮肤及皮下组织，暴露左颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。在ECA近CCA2mm处剪下一小切口，将一端椭圆略膨胀，长约6cm，直径0.2mm的鱼线插入ECA后转入ICA，徐徐推进至略感阻力，提示鱼线盲端已达大脑中动脉。
, http://www.100md.com
1.3 金纳多干预 用金纳多针于缺血后6h按0.1ml/kg腹腔注射1次，第2天、第3天各再注射1次。
1.4 取材、切片，测量梗塞区，免疫组化染色 [2] 将每例动物的大脑标本用4%多聚甲醛固定后入20%蔗糖PBS，待组织块下沉后制作成20μm厚的冰冻切片。间隔取每例大脑皮质的5张切片，用Bax、Bcl-2免疫血清(购自美国Santa Cruz公司，由北京中山生物技术公司分装)按常规ABC法染片，DAB棕色反应显色。镜下观察该两因子在半暗带的皮层神经元(100/切面)，用MIAS-200型图象分析系统测定各区Bax、Bcl-2的相对含量(根据设定:平均灰度值与物质含量呈反向关系，即灰度值越高，含量越少)。结果用方差分析进行统计学处理。对照实验组用PBS代替一抗，余同，结果阴性。
2 结果
正常大脑皮层神经元，可见Bax、Bcl-2的免疫阳性细胞，胞浆染色。金纳多对脑梗塞体积减少及Bax、Bcl-2表达的影响结果见表1。
, 百拇医药
表1 金纳多对梗塞体积减少(%)、Bax、Bcl-2 平均灰度的影响 (X±s) 注: ˇ 与对照组比较，差异有显著性。
表1显示，金纳多针组的梗塞体积百分数较缺血对照组明显减小，表明金纳多可减少因局灶性缺血形成的脑梗塞灶。此外，神经元内Bcl-2、Bax的平均灰度值分别较对照组者有明显降低和升高，表明金纳多处理后半暗带神经元内Bcl-2的含量有明显增高，而Bax的含量则明显减少(P<0.01)。
3 讨论
Bcl-2家族包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-1、Bcl-X和促进凋亡的Bax、Bak、Bcl-xs、Bik等，两类因子的比例决定了细胞是否发生凋亡。Shinoura等的研究 [3] 表明:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-X等有明确的抗凋亡作用，可用于缺血性卒中的治疗。
, 百拇医药 本实验结果显示Bax、Bcl-2的变化如下:Bax的平均灰度明显升高，表明其合成明显降低，而Bcl-2的平均灰度明显降低，则表明其合成明显增加。有关文献报道 [4] :Bax、Bcl-2是影响细胞凋亡的两个对立因素，Bax有促进细胞凋亡作用，Bcl-2有抑制细胞凋亡的作用。故本例中出现Bax减少，Bcl-2增加，表明金纳多能减少大脑皮层神经细胞凋亡，减轻脑梗塞的严重程度。
金纳多是从天然珍贵植物银杏的叶片提取的物质，它能够使局灶性大脑缺血后再灌注的继发性损伤减轻，并能改善线粒体的功能，减轻血管通透性，稳定细胞膜，消除水和钠的增加等不利因素 [5] ，它的剂量与作用效果呈正相关改变。Tietjen等报道，在对脑血管疾病患者用银杏提取物处理后，其脑血流灌注总量增加8%以上 [6] 。目前已公认的对局灶性脑缺血的救治方法主要是力求及早改善大脑的缺血状态，重点是防止半暗带细胞进一步凋亡，故我们推测，金纳多对脑缺血的保护作用可能在于有利于阻止半暗带细胞的继发性损害，而金纳多对脑缺血再灌流神经元及胶质细胞的保护作用机制可能与金纳多改善血循环的功能有关。
, http://www.100md.com
我们可以从上述实验结果初步得出金纳多针直接减少 局灶性脑缺血梗塞体积的有力证据，可进一步为金纳多治疗脑缺血性损害提供相关依据。大鼠大脑局灶性缺血再灌流损伤时，神经细胞凋亡及其调控基因表达的变化已有相关报道 [7] ，局灶性脑缺血致人脑皮质细胞凋亡及Bax、Bcl-2发生不同程度的变化也已为诸多实验所证实 [8] 。本组研究中，金纳多处理后半暗带神经元内Bcl-2的含量有明显增加，而Bax的含量则明显减少。笔者推断:金纳多对保护神经细胞免受缺血性损害有一定效果，其作用可能与Bax、Bcl-2含量改变有关。
参考文献
1 柏顺明，冯忠堂，王廷华，等.大鼠大脑中动脉供血区脑梗塞的实用动物模型.昆明医学院学报，2001，22(4B):99-101.
2 顾玲，高玉培，唐太昆，等.Trk C在成年猫脊髓和背根节的分布.昆明医学院学报，2000，21(1):34.
, http://www.100md.com
3 Shinoura N，Satou R，Yoshida Y，et al.Adenovirus-mediated transfer of bcl-X(1).protects neuronal cells from bax-induced apoptosis.Exp Cell Res，2000，254(2):221-231.
4 张文明，朱维钦，林建华.细胞凋亡与周围神经损伤后运动神经元死亡.中华创伤杂志，2000，16(1):51.
5 IETJEN CS，HURN p d，ULATOWSKI JA，et al.Treatment modalities for hypertersive patients with intracranial pathology L:options and risks.Critical Care Medicine，1996，24:311-322.
6 冯小平.银杏叶提取物改善心肌缺血/再灌注损伤及微循环障碍的作用.中国微循环杂志，1997，2(1):25.
7 储照虎，吴家冥，刘富东，等.大鼠局灶性脑缺血再灌流损伤时神经细胞凋亡及其调控基因的表达.临床神经病学杂志，2000，13(3):134-136.
8 徐评议，林建文，梁秀龄.神经细胞凋亡的分子调控.国外医学·内科学分册，1997，24(10):419-420.
(收稿日期:2003-01-23)
作者单位:650051云南省昆明市延安医院神经科
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(邱学才 顾 玲 唐太昆 杨云芳)