PCR对牙周难分离培养可疑致病菌的分布情况检测
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中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
【摘要】 目的 探讨6种分离培养困难的牙周可疑致病菌在牙周袋内的分布情况。方法 采集50例牙周袋深度大于4mm的龈下菌斑，以16S rRNA基因为模板，采用PCR方法检测标本中齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌的分布情况。结果 齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌检出率分别为82.0%，88.0%，98.0%，90.0%和84.0%。齿垢密螺旋体和福赛类杆菌在重度牙周炎和牙周炎活跃期病例中的检出率为100%。结论 齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌与牙周炎的关系密切，为牙周可疑致病菌，在中国人牙周病患者分布非常高。齿垢密螺旋体、福赛类杆菌对牙周病的发生发展起重要作用。
关键词 牙周病 致病菌 聚合酶联反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0307-03
, http://www.100md.com
Molecular detection of6putative periodontal pathogens
in subgingival plaque of periodontitis lesions
Zhong Xiaobo，Huang Dingming，Su Wei
Department of Stomatology，Affiliated Hospital，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan461000.
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of6putative periodontal pathogens in subgingival plaque from Chinese periodontitis patients.Methods Subgingival plaque was collected by Gracy cutters from50cases diagnosed as periodontitis whose periodontal pocket depth was deeper than4mm.DNA was extracted fromthe samples and analyzed using a16s rDNA-directed PCR-based identification assay.Results The prevalence of the organisms in periodontitis subjects was94.0%for T.Dentricola，82.0%for C.ochracea，88.0%for C.sputigena，98.0%for B.Forsythus，90.0%for Crectus，84.0%for E.corrodens，respectively.Both T.denticola and B.Forsythus were found in100%subgingival plaque samples from periodontal pockets depth more than6mm and active periodontitis.Concluˉsion These results indicated that the distribution of the putative periodontal pathogens were very high in this Chinese population.Both T.Denticola and B.forsythus were associated with occurrenceand development of periodontal disease.
, 百拇医药
Key words periodontal disease periodontal pathogen PCR
牙周炎被公认为是由病原微生物感染所引起的炎症性疾病。约有10数种以革兰氏阴性厌氧杆菌为主的细菌目前被认为是牙周炎的主要可疑致病菌。对口腔标本进行细菌学检查是研究牙周炎的病因、制订治疗计划、评价治疗效果和判断预后的主要方法之一 [1，2] 。传统的微生物分离培养技术不但费力、费时，而且一些专性厌氧菌培养条件苛刻，不能从临床标本中检测出来。聚合酶联反应(PCR)具有操作简单，反应快速，敏感性高，特异性强，不依赖被检微生物的生存等优点，在牙周细菌学检查方法中得到较为普遍的应用[3～5] 。本文利用PCR方法检测中国人成年牙周炎患者牙周袋内目前难以分离培养的6种牙周可疑致病菌，了解这些细菌在国人牙周病患者中的分布状况，为进一步研究中国人牙周致病菌的情况提供依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试验对象 50例均为到本院治疗牙周疾病的门诊患者，男女各25例，年龄35～70岁(平均48.6岁)，牙周袋深度4.0～12.0mm(平均6.53mm)。纳入标准为:全身无系统性疾病，近3个月内未服用抗生素和接受牙周治疗包括洁牙等，牙周袋深度在4mm以上，患者知情同意。
1.2 标本采集 用无菌的干棉球将龈上菌斑去除，然后用无菌Gracy刮器收集龈下菌斑，将菌斑置入盛有1ml pH7.2的磷酸缓冲液的无菌Eppendorf管中，测量并记录收集标本牙的最深牙周袋数据以及临床症状，包括牙龈是否红肿、探诊是否出血、牙周袋是否溢脓等。标本在-20℃低温保存备用。
1.3 DNA提取 细菌基因组基因DNA的提取采用DNA分离试剂盒(pure gene;Gentra systems，Minneapolis，Minn)，根据说明书进行分离。该试剂盒包括细胞裂解物、RNA水解酶、蛋白沉淀剂以及DNA水合剂。
, 百拇医药
1.4 检测细菌种类及引物 本研究所使用的细菌引物均以被检细菌16S rRNA基因为模板的菌种特异引物。引物的特异性和敏感性均在多篇文献中报道 [6] 。以几乎所有细菌16S rRNA基因共有引物作为阳性对照。所有引物均由瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司合成。检测细菌种类及其引物见表1。
1.5 PCR反应条件 采用Ampli Taq Gold系统(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif)。PCR扩增反应液含2.5μl10×PCR缓冲液，2.5ml25mM MgCl 2 2.0μl dNTP混合物(dNTP浓度各为2mM)，0.1μl5U/μl Taq聚合酶，上下游引物各0.8μM，
表1 检测细菌的名称及其引物
注: PCR产物预计长度， PCR反应的退火温度
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模板DNA液2μl。每种细菌理想扩增反应条件由阳性和阴性对照组实验结果来决定。PCR扩增反应液总体积为25μl。然后在DNA热循环仪(Model2400，Applied Biosystems，Branchburg，NJ)中反应，反应条件为T.Denticola，C.Ochracea，C.Sputigena，95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环延伸7min，共30个循环。B.Forsythus，C.Recuts，E.Corrodens，95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环延伸7min，共35个循环。
1.6 琼脂糖凝胶电泳 反应液在10μl2%的琼脂糖凝胶、TAE缓冲液中电泳40min，302nm紫外光下观察记录。100bp DNA ladder作为判断反应物长度的参照。
2 结果
, http://www.100md.com 基因模板的检测，在中国人牙周病患者牙周袋中，齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌检出率分别为82.0%，88.0%，98.0%，90.0%和84.0%。
当牙周袋的深度≥6mm时(32例)，所有被检细菌都可检测出。当牙周袋深度<6mm，牙周袋内溢脓时(5例)，齿垢密螺旋体、福赛类杆菌、直肠弯曲菌都能检出，而其它3种细菌在部分患者中检出;牙龈出现红肿或牙龈探诊出血时(9例)，齿垢密螺旋体、福赛类杆菌能全部检出外，其余4种细菌在部分患者中检出。
3 讨论
牙周病是以革兰氏阴性细菌为主的多种细菌共同作用的结果。目前研究表明牙周袋内存在有大约500余种细菌 [7] ，而采用传统的方法分离培养，免疫荧光方法检测龈下菌斑细菌，易导致假阴性结果。从理论上说，只要有一个活的细菌就有检出的可能，但是牙周可疑致病菌多为厌氧菌，在采集标本和转移标本时，稍有不慎细菌就有死亡的危险;另一方面，一些牙周可疑致病菌如齿垢密螺旋体、福赛类杆 菌等在一般的平板培养基根本不生长。细菌即使生长出来，单纯从菌落形态去鉴别不同的菌种，也是非常困难的。例如青少年牙周炎的重要致病菌伴共生放线杆菌与嗜沫、嗜血杆菌非常相似，通过菌落形态无法将二者区分开。福赛类杆菌在血平板培养基上生长与巨核梭杆菌呈共生关系，也很难将二者彻底分离，采用生化鉴定根本不可能。免疫荧光法检测需要一定数量被检菌的存在，否则易产生假阴性结果。本研究检测的6种牙周可疑致病菌，培养条件要求高，常规方法很难检测，采用了敏感性高、特异性强的聚合酶联方法，以基因为模板，对这6种细菌在牙周袋内分布情况进行了分子生物学水平的检测。结果发现，在被检50例患者中，6种细菌的检出率>80%，远高于以前的报道(采用细菌培养法检测牙周病损活跃部位的细菌检出率<10%) [8] 。16S rRNA基因的PCR不仅能检出标本中的活细菌，而且能检出在DNA降解前的死细菌，因此灵敏度与其它方法相比更高。而本研究所用引物，均为多篇文献报道所用引物，其特异性被证实和认同，同时本实验结果也显示所有被检测标本以及各种细菌扩增产物，电泳只存在一个条带。可以认为本研究未出现假阳性结果。因此，采用16S rRNA基因的PCR检测方法更能反映这些细菌在牙周袋内实际定居情况。
, 百拇医药
目前认为齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌是牙周病的可疑致病菌。本研究结果表明被检测的这6种细菌在牙周袋内的检出率高于80%，提示其与牙周炎关系密切，为其是牙周病的致病菌提供了临床流行病学证据。
福赛类杆菌被认为是难治性牙周炎、复发性牙周炎以及重度牙周炎的可疑致病菌[9] 。本研究结果显示福赛类杆菌不仅在深牙周袋内，而且在牙周炎活跃期如牙龈充血红肿、探诊出血和牙周袋溢脓的病例，均被检出，提示该菌与牙周病的发生和发展存在密切的关系。因此可以认为，研究福赛类杆菌的生物学性质和致病机制，对于牙周病的预防和治疗具有重要意义。
齿垢密螺旋体被认为与急性坏死型牙龈炎有关，该微生物难以分离培养。本研究的结果提示在牙周袋深度>6mm和牙周炎活跃期的所有患者，牙周袋内均检出了齿垢密螺旋体，提示该菌与重度牙周炎以及牙周炎的发展关系密切。
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参考文献
1 P C Page.Critical issues in periodontal research.J Dent Res，1995，74(4):1118-1128.
2 P C Page.Milestones in periodontal research and the remaining critical issues.J periodontal Res，1999，34:331-339.
3 G Conrads，R Mutters，J Fischer，et al.PCR reaction and dot-blot hyˉbridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals.J Periodontal，1996，67:994-1003.
, http://www.100md.com
4 A Ashimoto，Chen C J Slots，et al.Polymerase chain reatction detection of8putative periodontal pathogensin subgingival plaque of gingivits and advanced periodontitis lesions.Oral Microbiol Immunol，1996，11:266-273.
5 A Amano，T Kishima，S Hamad，et al.Periodontal pathic bacteria in childrenwith Down Syndrome.J Periodontol，2000，71:249-255.
6 Watanabe K，T Frommel.Porphoromonas gingivalis，Actinobacillus actiˉnomycetemcomitans，and Treponema denticola detection in oral plaque samples using thepolymerase chain reaction.J Clin Periodontol，1996，23:212-219.
, 百拇医药
7 B J Paster，S K Boches，J L Galvin，et al.Bacterial diversity in human subgingival plaque.J Bacteriol，2001，83(12):3770-3883.
8 J Slots，M A Taubnan.Chapter23Microbiology of periodontal disease.Contemporary Oral Microbiology and Immunology.New York:Mosby-year Book，Inc，1992，425-443.
9 P H Brahan，B J Moncla.Rapid presumptive identification and further characterization of Bacteroides forsythus.J Clin.Microbio，1992，30(3):649-654.
作者单位:461000泸州医学院附属医院口腔内科
四川大学华西口腔医院
(收稿日期:2002-10-18)
(编辑元 红), 百拇医药(钟晓波)
关键词 牙周病 致病菌 聚合酶联反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0307-03
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Molecular detection of6putative periodontal pathogens
in subgingival plaque of periodontitis lesions
Zhong Xiaobo，Huang Dingming，Su Wei
Department of Stomatology，Affiliated Hospital，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan461000.
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of6putative periodontal pathogens in subgingival plaque from Chinese periodontitis patients.Methods Subgingival plaque was collected by Gracy cutters from50cases diagnosed as periodontitis whose periodontal pocket depth was deeper than4mm.DNA was extracted fromthe samples and analyzed using a16s rDNA-directed PCR-based identification assay.Results The prevalence of the organisms in periodontitis subjects was94.0%for T.Dentricola，82.0%for C.ochracea，88.0%for C.sputigena，98.0%for B.Forsythus，90.0%for Crectus，84.0%for E.corrodens，respectively.Both T.denticola and B.Forsythus were found in100%subgingival plaque samples from periodontal pockets depth more than6mm and active periodontitis.Concluˉsion These results indicated that the distribution of the putative periodontal pathogens were very high in this Chinese population.Both T.Denticola and B.forsythus were associated with occurrenceand development of periodontal disease.
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Key words periodontal disease periodontal pathogen PCR
牙周炎被公认为是由病原微生物感染所引起的炎症性疾病。约有10数种以革兰氏阴性厌氧杆菌为主的细菌目前被认为是牙周炎的主要可疑致病菌。对口腔标本进行细菌学检查是研究牙周炎的病因、制订治疗计划、评价治疗效果和判断预后的主要方法之一 [1，2] 。传统的微生物分离培养技术不但费力、费时，而且一些专性厌氧菌培养条件苛刻，不能从临床标本中检测出来。聚合酶联反应(PCR)具有操作简单，反应快速，敏感性高，特异性强，不依赖被检微生物的生存等优点，在牙周细菌学检查方法中得到较为普遍的应用[3～5] 。本文利用PCR方法检测中国人成年牙周炎患者牙周袋内目前难以分离培养的6种牙周可疑致病菌，了解这些细菌在国人牙周病患者中的分布状况，为进一步研究中国人牙周致病菌的情况提供依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试验对象 50例均为到本院治疗牙周疾病的门诊患者，男女各25例，年龄35～70岁(平均48.6岁)，牙周袋深度4.0～12.0mm(平均6.53mm)。纳入标准为:全身无系统性疾病，近3个月内未服用抗生素和接受牙周治疗包括洁牙等，牙周袋深度在4mm以上，患者知情同意。
1.2 标本采集 用无菌的干棉球将龈上菌斑去除，然后用无菌Gracy刮器收集龈下菌斑，将菌斑置入盛有1ml pH7.2的磷酸缓冲液的无菌Eppendorf管中，测量并记录收集标本牙的最深牙周袋数据以及临床症状，包括牙龈是否红肿、探诊是否出血、牙周袋是否溢脓等。标本在-20℃低温保存备用。
1.3 DNA提取 细菌基因组基因DNA的提取采用DNA分离试剂盒(pure gene;Gentra systems，Minneapolis，Minn)，根据说明书进行分离。该试剂盒包括细胞裂解物、RNA水解酶、蛋白沉淀剂以及DNA水合剂。
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1.4 检测细菌种类及引物 本研究所使用的细菌引物均以被检细菌16S rRNA基因为模板的菌种特异引物。引物的特异性和敏感性均在多篇文献中报道 [6] 。以几乎所有细菌16S rRNA基因共有引物作为阳性对照。所有引物均由瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司合成。检测细菌种类及其引物见表1。
1.5 PCR反应条件 采用Ampli Taq Gold系统(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif)。PCR扩增反应液含2.5μl10×PCR缓冲液，2.5ml25mM MgCl 2 2.0μl dNTP混合物(dNTP浓度各为2mM)，0.1μl5U/μl Taq聚合酶，上下游引物各0.8μM，
表1 检测细菌的名称及其引物
注: PCR产物预计长度， PCR反应的退火温度
, http://www.100md.com
模板DNA液2μl。每种细菌理想扩增反应条件由阳性和阴性对照组实验结果来决定。PCR扩增反应液总体积为25μl。然后在DNA热循环仪(Model2400，Applied Biosystems，Branchburg，NJ)中反应，反应条件为T.Denticola，C.Ochracea，C.Sputigena，95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环延伸7min，共30个循环。B.Forsythus，C.Recuts，E.Corrodens，95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环延伸7min，共35个循环。
1.6 琼脂糖凝胶电泳 反应液在10μl2%的琼脂糖凝胶、TAE缓冲液中电泳40min，302nm紫外光下观察记录。100bp DNA ladder作为判断反应物长度的参照。
2 结果
, http://www.100md.com 基因模板的检测，在中国人牙周病患者牙周袋中，齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌检出率分别为82.0%，88.0%，98.0%，90.0%和84.0%。
当牙周袋的深度≥6mm时(32例)，所有被检细菌都可检测出。当牙周袋深度<6mm，牙周袋内溢脓时(5例)，齿垢密螺旋体、福赛类杆菌、直肠弯曲菌都能检出，而其它3种细菌在部分患者中检出;牙龈出现红肿或牙龈探诊出血时(9例)，齿垢密螺旋体、福赛类杆菌能全部检出外，其余4种细菌在部分患者中检出。
3 讨论
牙周病是以革兰氏阴性细菌为主的多种细菌共同作用的结果。目前研究表明牙周袋内存在有大约500余种细菌 [7] ，而采用传统的方法分离培养，免疫荧光方法检测龈下菌斑细菌，易导致假阴性结果。从理论上说，只要有一个活的细菌就有检出的可能，但是牙周可疑致病菌多为厌氧菌，在采集标本和转移标本时，稍有不慎细菌就有死亡的危险;另一方面，一些牙周可疑致病菌如齿垢密螺旋体、福赛类杆 菌等在一般的平板培养基根本不生长。细菌即使生长出来，单纯从菌落形态去鉴别不同的菌种，也是非常困难的。例如青少年牙周炎的重要致病菌伴共生放线杆菌与嗜沫、嗜血杆菌非常相似，通过菌落形态无法将二者区分开。福赛类杆菌在血平板培养基上生长与巨核梭杆菌呈共生关系，也很难将二者彻底分离，采用生化鉴定根本不可能。免疫荧光法检测需要一定数量被检菌的存在，否则易产生假阴性结果。本研究检测的6种牙周可疑致病菌，培养条件要求高，常规方法很难检测，采用了敏感性高、特异性强的聚合酶联方法，以基因为模板，对这6种细菌在牙周袋内分布情况进行了分子生物学水平的检测。结果发现，在被检50例患者中，6种细菌的检出率>80%，远高于以前的报道(采用细菌培养法检测牙周病损活跃部位的细菌检出率<10%) [8] 。16S rRNA基因的PCR不仅能检出标本中的活细菌，而且能检出在DNA降解前的死细菌，因此灵敏度与其它方法相比更高。而本研究所用引物，均为多篇文献报道所用引物，其特异性被证实和认同，同时本实验结果也显示所有被检测标本以及各种细菌扩增产物，电泳只存在一个条带。可以认为本研究未出现假阳性结果。因此，采用16S rRNA基因的PCR检测方法更能反映这些细菌在牙周袋内实际定居情况。
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目前认为齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳噬纤维菌、生碳二氧化碳噬纤维菌、福赛类杆菌、直肠弯曲菌、侵蚀类杆菌是牙周病的可疑致病菌。本研究结果表明被检测的这6种细菌在牙周袋内的检出率高于80%，提示其与牙周炎关系密切，为其是牙周病的致病菌提供了临床流行病学证据。
福赛类杆菌被认为是难治性牙周炎、复发性牙周炎以及重度牙周炎的可疑致病菌[9] 。本研究结果显示福赛类杆菌不仅在深牙周袋内，而且在牙周炎活跃期如牙龈充血红肿、探诊出血和牙周袋溢脓的病例，均被检出，提示该菌与牙周病的发生和发展存在密切的关系。因此可以认为，研究福赛类杆菌的生物学性质和致病机制，对于牙周病的预防和治疗具有重要意义。
齿垢密螺旋体被认为与急性坏死型牙龈炎有关，该微生物难以分离培养。本研究的结果提示在牙周袋深度>6mm和牙周炎活跃期的所有患者，牙周袋内均检出了齿垢密螺旋体，提示该菌与重度牙周炎以及牙周炎的发展关系密切。
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参考文献
1 P C Page.Critical issues in periodontal research.J Dent Res，1995，74(4):1118-1128.
2 P C Page.Milestones in periodontal research and the remaining critical issues.J periodontal Res，1999，34:331-339.
3 G Conrads，R Mutters，J Fischer，et al.PCR reaction and dot-blot hyˉbridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals.J Periodontal，1996，67:994-1003.
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4 A Ashimoto，Chen C J Slots，et al.Polymerase chain reatction detection of8putative periodontal pathogensin subgingival plaque of gingivits and advanced periodontitis lesions.Oral Microbiol Immunol，1996，11:266-273.
5 A Amano，T Kishima，S Hamad，et al.Periodontal pathic bacteria in childrenwith Down Syndrome.J Periodontol，2000，71:249-255.
6 Watanabe K，T Frommel.Porphoromonas gingivalis，Actinobacillus actiˉnomycetemcomitans，and Treponema denticola detection in oral plaque samples using thepolymerase chain reaction.J Clin Periodontol，1996，23:212-219.
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7 B J Paster，S K Boches，J L Galvin，et al.Bacterial diversity in human subgingival plaque.J Bacteriol，2001，83(12):3770-3883.
8 J Slots，M A Taubnan.Chapter23Microbiology of periodontal disease.Contemporary Oral Microbiology and Immunology.New York:Mosby-year Book，Inc，1992，425-443.
9 P H Brahan，B J Moncla.Rapid presumptive identification and further characterization of Bacteroides forsythus.J Clin.Microbio，1992，30(3):649-654.
作者单位:461000泸州医学院附属医院口腔内科
四川大学华西口腔医院
(收稿日期:2002-10-18)
(编辑元 红), 百拇医药(钟晓波)