通过与MBP融合提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达
【摘要】 目的 探讨提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达的途径。方法 通过融合大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(mbp)基因到抗人纤维蛋白单链抗体(seFvIIn)和抗结肠癌相关抗原单链抗体(ScFvSC11)的5′端，或者同时融合人抗体κ轻链恒定区(HuCκ)基因到单链抗体的3′端，构建成表达载体，在大肠杆菌中表达，观察融合蛋白的可溶性表达水平。结果 与MBP融合表达可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，表达量占全菌蛋白的20%左右;同时融合表达HuCκ，融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量占全菌蛋白的30%左右。结论 与MBP及HuCκ融合表达可以明显提高含单链抗体的融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量。
关键词 单链抗体 麦芽糖结合蛋白 可溶性表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0590-03
Improved soluble expression of single-chain Fv fragments
, http://www.100md.com
when fused downstream of the escherichia coli maltose-binding protein
Kang Tiejun，Tian Cha，Yu Weiyuan
Hebei Center for Disease Control，Baoding071000.
【Abstract】 Objective To study the method that improve the level of soluble
expression of single-chain Fv fragments(scFv)in Escherichia Coli.Methods By fusing the E.coli maltose-binding protein(mbp)gene5′to a scFv specific against
, 百拇医药
human cross-linked fibrin or at the same time fusing the a humanκlight chain constant(HuCκ)gene3′to scFv，constructing the vector of expression and expressing in E.coli.Results The fusion protein with MBP is20%～30%of total protein inE.coli cytoplasm.Conclusion By expressing scFv as tripartite fusions(mbp-scFv-HuCκ)enhanced levels of soluble cytoplasmic expression.
Key words single-chain antibody fragment maltose-binding protein soluble expression
, 百拇医药
单链抗体是利用DNA重组技术将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一15个氨基酸左右的短肽连接后融合表达出来的抗体片段。它具备天然抗体的抗原特异性和亲和性，它没有Fc段，故不能与细胞的Fc受体结合，因此更有利于作为药物导向载体;同时由于它的分子量较小(约30kDa，抗体约为150kDa)，易于通过血管壁和实体瘤，有利于肿瘤治疗;另外它可以在大肠杆菌中获得高表达，易于大量制备。这些优势使得单链抗体在疾病的诊断和治疗等方面的研究和应用越来越多。但是单链抗体在大肠杆菌内高表达时往往形成不具生物活性的包涵体，而可溶性表达量很少。为了恢复包涵体的活性，需经复杂的变性和复性过程，结果也往往很难令人满意，所以如何获得可溶性的高表达引起了人们的兴趣。
通过与亲水性的辅助蛋白融合表达可以提高目的蛋白可溶性表达水平。常用的辅助蛋白有谷胱甘肽-s-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx)等。MBP被认为是更好的辅助蛋白 [1] 。有报道在MBP与单链抗体的融合蛋白下游再融合表达人抗体κ轻链恒定区，可以促进单链抗体的二聚化以增强其亲和力，另外还便于纯化和鉴定 [2] 。
, 百拇医药
本研究构建了MBP和两种单链抗体融合表达的载体，其中MBP分为带信号肽和不带信号肽两类。另外，还尝试了将人抗体κ轻链恒定区(HuCκ)融合于单链抗体的下游，形成MBP-ScFv-HuCκ融合蛋白。两种单链抗体分别是 二次抗人纤维蛋白单链抗体(scFvIIn)和含抗结肠癌相关抗原单链抗体(ScFvSC11)，两者单独在大肠杆菌中表达时均形成包涵体，而且前者对大肠杆菌有毒性，诱导表达时可使大肠杆菌裂解。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒 大肠杆菌XL1-blue，本室保存。质粒pMal-c2X和pMal-p2X为New England Biolabs公司产品，表达载体，tac启动子，氨苄青霉素抗性，含麦芽糖结合蛋白基因(malE)，c2X不带信号肽序列，p2X带信号肽序列;质粒pET15b-IIn-UK，本室保存，含抗人纤维蛋白单链抗体基因(scFvIIn):质粒pAG4622，本室保存，含人抗体κ轻链恒定区序列(HuCκ);质粒pASK84-SC11，本室保存，含抗结肠癌相关抗原单链抗体基因(scFvSC11)。
, 百拇医药
1.2 工具酶、常用生化试剂 限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Takara公司;IPTG氨苄青霉素购自上海生工生物工程有限公司。柱式质粒纯化试剂盒和柱式胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司。
1.3 引物
1.3.1 PCR扩增ScFvIIn基因所需引物 pIN1:5′-TGCTCˉTAGAGGTGGCGGAGGCTCTGGTGGCGGAGGCTCTGGTGGTGGC GGATCCATGGCCCAGGTGAAGCT-3′;pIN2:5′-GCACTˉGCAGTCAGGTACCGCGTTTGATTTCCAGCTTGGT-3′。
1.3.2 PCR扩增HuCκ基因所需引物 pCκ1:5′-CGGGGTACCACTGTGGCTGCACCATCTGT-3′;pCκ2:5′-GCACTGCAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′。
, 百拇医药
1.3.3 PCR扩增ScFcSC11基因所需引物 pSCA1:5′-GATCCATGGAAGTTAAACTGCAGCAGTC-3′;pSCA2:5′-CGGGGTACCAGCCCGTTTTATTTCCAGG-3′。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
1.4 周质组份的制备 离心收菌1000g，4℃，10min。重悬细菌于1/6培养体积的高渗液(30mMTris.C1pH8.0，20%suˉcrose，1mmol/L EDTA)，冰水浴10min，其间震荡混匀3次。离心10000g，4℃，10min，小心地取尽上清，然后重悬沉淀于1/10体积5mmol/L MgSO 4 ，冰水浴10min，其间震荡混匀3次。离心10000g，4℃，10min，取上清，即为周质组份。
1.5 可溶组份和不溶组份的制备 离心收菌1000g，4℃，10min，重悬于1/10培养体积的TE中，超声裂菌。14000g，4℃，10min取上清为可溶组(包括胞内可溶和周质可溶组份);超声重悬沉淀于1/10体积的TE中，即为不溶组份。
, 百拇医药
2 结果
2.1 MBP和ScFvIIn融合表达载体的构建 以pET15b-IIn-UK为模板，pIN1和pIN2为引物，用pfu DNA聚合酶将ScFvIIn基因扩出，其上游带一15个氨基酸的Linker(GGGGS) 3 序列(Linker前为Xba I位点，Linker后为Nco I位点，用于替换其他的单链抗体)，下游带Kpn I位点(融合HuCκ时使用)和Pst I位点。
pMal-c2x和pMal-p2x中Ma1E后的多克隆位点中有XbaI位点和Pst I位点，将两质粒分别与上述PCR扩增产物ScFvIIn一起用XbaI和Pst I双酶切后纯化，然后用T4DNA Ligase进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-IIn和pMal-p2x-IIn(图略)。
2.2 MBP与ScFvIIn和HuCκ融合表达载体的构建 以质粒pAG4622为模板，pCκ1和pCκ2为引物，用pfu DNA聚合酶扩增出HuCκ基因，其5′端为Kpn I位点，3′端为Pst I位点。经上述双酶切后纯化。
, 百拇医药
以pET15b-IIn-UK为模板，pIN1和pIN2为引物，用pfuDNA聚合酶扩增出ScFvIIn基因，经Xba I和Kpn I双酶切后纯化。
质粒pMal-c2x或pMal-p2x经XbaI和PstI双酶切后纯化，然后用T4DNA Ligase将三片段进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-IIn-HuCκ和pMal-p2x-IIn-HuCκ(图1)。用Sac I酶切后出现一1143bp的带，与预期相符。
图1 重组pMal-c2x-Ⅱn-HuCκ表达质粒结构示意图略
2.3 MBP与SC11-ScFv和HuCκ融合表达载体的构建 以质粒pASK84-SC11为模板，pSCA1和pSCA2为引物，用 pfu DNA聚合酶将SC11-ScFv扩出，其5′端为Nco I位点，3′端为KpnI位点。经双酶切后纯化。
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质粒pMal-c2x-IIn-HuCκ和pMal-p2x-IIn-HuCκ经NcoI和KpnI双酶切后提取大片段，然后用T4DNA Ligase将之与上述SC11-ScFv进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-SC11-HuCκ和pMal-p2x-SC11-HuCκ。
经Pst I酶切出现一1000bp左右的带，与预期的相符。
2.4 表达 分别将质粒pMal-c2x-IIn、pMal-p2x-IIn、pMal-c2x-IIn-HuCκ、pMal-p2x-IIn-HuCκ、pMal-c2x-SC11-HuCκ和pMal-p2x-SC11-HuCκ转化大肠杆菌XL1blue，涂布含200μg/ml氨苄青霉素的LB平板。各挑单克隆，接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃培养至OD600约为0.8，加IPTG至终浓度为0.3mM进行诱导表达，30℃培养3h。然后收菌，制备全菌裂解液、上清、周质及包涵体等组份，进行SDS-PAGE。
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结果显示:ScFvIIn与不带信号肽的MBP融合表达可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，融合蛋白的分子量约为68kD，表达量占全菌蛋白的20%左右(图2h)，只形成极少量的包涵体(图2j);而与带信号肽的MBP融合表达在68kD处没有表达产物，而在周质中43kD处有一较浓的新表达带(图2i)，可能是融合蛋白的降解产物;融合表达HuCκ的结果显示，不带信号肽的在胞浆内获得可溶性高表达的MBP-IIn(图3e)，分子量约为80kD，表达量占全菌蛋白的30%左右;带信号肽的没有在周质内见到分泌表达的目的蛋白，而在43kD处有一较浓的新表达带(图3d)，可能是融合蛋白的降解产物。
ScFvSC11-HuCκ与不带信号肽的MBP融合表达时，可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，融合蛋白的分子量约为80kD，表达量占全菌蛋白的30%左右(图3i)，只形成极少量的包涵体(图3j);而与带信号肽的MBP融合表达在80kD处没有表达产物，而在周质中43kD处有一较浓的新表达带(图3h)，可能是融合蛋白的降解产物。
, 百拇医药
另外，宿主菌均生长良好，没有出现生长抑制。
图2 质粒pMAL-p2X-Ⅱn和pMAL-p2X-Ⅱn表达产物的SDS-PAGE(略)
图3 质粒pMAL-c2X-Ⅱn-HuCκ和pMAL-p2X-Ⅱn-HuCκ表达产物的SDS-PAGE(略)
3 讨论
大多数单链抗体在大肠杆菌内都是以包涵体形式表达。一般认为，影响包涵体形成的因素主要是外源蛋白本身的性质即氨基酸序列 [3] 。但大肠杆菌等外部因素亦极为重要。包涵体形成的分子机制大多认为是新生的多肽链存在着两条相互竞争的折叠和聚合途径 [4] 。具体的原因包括大肠杆菌胞质内的还原环境影响了二硫键的形成 [5] ;大肠杆菌内的分子伴侣、折叠酶等辅助因子与其天然宿主细胞不同 [6] ;外源蛋白的表达速率过快等 [5] 。
, 百拇医药
通过与亲水性的辅助蛋白融合表达是提高目的蛋白可溶性表达水平的常用方法。MBP是被广泛应用的通过融合表达使外源蛋白可溶性表达的辅助蛋白。融合表达促进折叠的原因可能是当融合的辅助蛋白在核糖体上合成后或刚 从核糖体上释放时迅速并有效地折叠成其天然结构，并促进下游的正在折叠的单元(目的蛋白)通过异构反应获得正确的结构。MBP的折叠需要DnaK-DnaJ和GroEL-GroES两个分子伴侣系统的帮助，这可以使这些分子伴侣聚集到目的蛋白的附近帮助其正确折叠 [7] 。
我们将单链抗体与MBP融合表达得到了较好的结果。不仅在胞浆内得到了可溶性的高表达，而且消除了单链抗体对大肠杆菌的生长抑制。但同时也发现，与不带信号肽MBP不同，带信号肽MBP与单链抗体的融合蛋白在SDS-PAGE时，周质内没有预期的表达带，而在低分子量处有较明显的带，可能是由于融合蛋白分子量较大，在传输到周质后或在传输过程中被周质内的蛋白酶降解。同时我们还发现，融合表达HuCκ，不仅可以促进单链抗体的二聚化，还可以在一定程度上促进可溶性的表达。
, 百拇医药
参考文献
1 Kapust RB，Waugh DS.Escherichia coli maltose-binding protein is unˉcommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.Protein Sci，1999，8(8):1668-1674.
2 Hayhurst A.Improved expression characteristics of single-chain Fv Fragments when fused sownstream of the Escherichia coli maltose-binding protein or upatresm of a single immunoglobulin-constant doˉmain.Protein Expr Purif，2000，18:1-10.
, http://www.100md.com
3 Mitraki A，King J.Protein Folding intermediates and inclusion body forˉmation.Bio/Technology，1989，7(7):690-697.
4 Lilie H，Schwarz E，Rudolph R.Advances in refording of proteins proˉducedin E.coli.Curr Opin Biotechnol，1998，9(5):497-501.
5 Guise AD，West SM，Chaudhuri JB.Protein folding in vivo and renaturaˉtion
of recombinant proteins from inclusion bodies.Mol Biotechnol，1996，6(1):53-64.
, 百拇医药
6 Feldman DE，Frydman J.Protein folding in vivo:the importance of molecular chaperones.Curr Opin in Struct Biol，2000，10(1):26-33.
7 BaneyxF.Recombinant protein expression in Escherichia coli.Curr Opin Biotechnol，1999，10(5):411-421.
作者单位:1 071000河北保定河北省疾病控制中心
2 100071北京军事医学科学院生物工程研究所
(收稿日期:2003-04-08)
(编辑 元红), 百拇医药(康铁军)
关键词 单链抗体 麦芽糖结合蛋白 可溶性表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0590-03
Improved soluble expression of single-chain Fv fragments
, http://www.100md.com
when fused downstream of the escherichia coli maltose-binding protein
Kang Tiejun，Tian Cha，Yu Weiyuan
Hebei Center for Disease Control，Baoding071000.
【Abstract】 Objective To study the method that improve the level of soluble
expression of single-chain Fv fragments(scFv)in Escherichia Coli.Methods By fusing the E.coli maltose-binding protein(mbp)gene5′to a scFv specific against
, 百拇医药
human cross-linked fibrin or at the same time fusing the a humanκlight chain constant(HuCκ)gene3′to scFv，constructing the vector of expression and expressing in E.coli.Results The fusion protein with MBP is20%～30%of total protein inE.coli cytoplasm.Conclusion By expressing scFv as tripartite fusions(mbp-scFv-HuCκ)enhanced levels of soluble cytoplasmic expression.
Key words single-chain antibody fragment maltose-binding protein soluble expression
, 百拇医药
单链抗体是利用DNA重组技术将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一15个氨基酸左右的短肽连接后融合表达出来的抗体片段。它具备天然抗体的抗原特异性和亲和性，它没有Fc段，故不能与细胞的Fc受体结合，因此更有利于作为药物导向载体;同时由于它的分子量较小(约30kDa，抗体约为150kDa)，易于通过血管壁和实体瘤，有利于肿瘤治疗;另外它可以在大肠杆菌中获得高表达，易于大量制备。这些优势使得单链抗体在疾病的诊断和治疗等方面的研究和应用越来越多。但是单链抗体在大肠杆菌内高表达时往往形成不具生物活性的包涵体，而可溶性表达量很少。为了恢复包涵体的活性，需经复杂的变性和复性过程，结果也往往很难令人满意，所以如何获得可溶性的高表达引起了人们的兴趣。
通过与亲水性的辅助蛋白融合表达可以提高目的蛋白可溶性表达水平。常用的辅助蛋白有谷胱甘肽-s-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx)等。MBP被认为是更好的辅助蛋白 [1] 。有报道在MBP与单链抗体的融合蛋白下游再融合表达人抗体κ轻链恒定区，可以促进单链抗体的二聚化以增强其亲和力，另外还便于纯化和鉴定 [2] 。
, 百拇医药
本研究构建了MBP和两种单链抗体融合表达的载体，其中MBP分为带信号肽和不带信号肽两类。另外，还尝试了将人抗体κ轻链恒定区(HuCκ)融合于单链抗体的下游，形成MBP-ScFv-HuCκ融合蛋白。两种单链抗体分别是 二次抗人纤维蛋白单链抗体(scFvIIn)和含抗结肠癌相关抗原单链抗体(ScFvSC11)，两者单独在大肠杆菌中表达时均形成包涵体，而且前者对大肠杆菌有毒性，诱导表达时可使大肠杆菌裂解。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒 大肠杆菌XL1-blue，本室保存。质粒pMal-c2X和pMal-p2X为New England Biolabs公司产品，表达载体，tac启动子，氨苄青霉素抗性，含麦芽糖结合蛋白基因(malE)，c2X不带信号肽序列，p2X带信号肽序列;质粒pET15b-IIn-UK，本室保存，含抗人纤维蛋白单链抗体基因(scFvIIn):质粒pAG4622，本室保存，含人抗体κ轻链恒定区序列(HuCκ);质粒pASK84-SC11，本室保存，含抗结肠癌相关抗原单链抗体基因(scFvSC11)。
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1.2 工具酶、常用生化试剂 限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Takara公司;IPTG氨苄青霉素购自上海生工生物工程有限公司。柱式质粒纯化试剂盒和柱式胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司。
1.3 引物
1.3.1 PCR扩增ScFvIIn基因所需引物 pIN1:5′-TGCTCˉTAGAGGTGGCGGAGGCTCTGGTGGCGGAGGCTCTGGTGGTGGC GGATCCATGGCCCAGGTGAAGCT-3′;pIN2:5′-GCACTˉGCAGTCAGGTACCGCGTTTGATTTCCAGCTTGGT-3′。
1.3.2 PCR扩增HuCκ基因所需引物 pCκ1:5′-CGGGGTACCACTGTGGCTGCACCATCTGT-3′;pCκ2:5′-GCACTGCAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′。
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1.3.3 PCR扩增ScFcSC11基因所需引物 pSCA1:5′-GATCCATGGAAGTTAAACTGCAGCAGTC-3′;pSCA2:5′-CGGGGTACCAGCCCGTTTTATTTCCAGG-3′。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
1.4 周质组份的制备 离心收菌1000g，4℃，10min。重悬细菌于1/6培养体积的高渗液(30mMTris.C1pH8.0，20%suˉcrose，1mmol/L EDTA)，冰水浴10min，其间震荡混匀3次。离心10000g，4℃，10min，小心地取尽上清，然后重悬沉淀于1/10体积5mmol/L MgSO 4 ，冰水浴10min，其间震荡混匀3次。离心10000g，4℃，10min，取上清，即为周质组份。
1.5 可溶组份和不溶组份的制备 离心收菌1000g，4℃，10min，重悬于1/10培养体积的TE中，超声裂菌。14000g，4℃，10min取上清为可溶组(包括胞内可溶和周质可溶组份);超声重悬沉淀于1/10体积的TE中，即为不溶组份。
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2 结果
2.1 MBP和ScFvIIn融合表达载体的构建 以pET15b-IIn-UK为模板，pIN1和pIN2为引物，用pfu DNA聚合酶将ScFvIIn基因扩出，其上游带一15个氨基酸的Linker(GGGGS) 3 序列(Linker前为Xba I位点，Linker后为Nco I位点，用于替换其他的单链抗体)，下游带Kpn I位点(融合HuCκ时使用)和Pst I位点。
pMal-c2x和pMal-p2x中Ma1E后的多克隆位点中有XbaI位点和Pst I位点，将两质粒分别与上述PCR扩增产物ScFvIIn一起用XbaI和Pst I双酶切后纯化，然后用T4DNA Ligase进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-IIn和pMal-p2x-IIn(图略)。
2.2 MBP与ScFvIIn和HuCκ融合表达载体的构建 以质粒pAG4622为模板，pCκ1和pCκ2为引物，用pfu DNA聚合酶扩增出HuCκ基因，其5′端为Kpn I位点，3′端为Pst I位点。经上述双酶切后纯化。
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以pET15b-IIn-UK为模板，pIN1和pIN2为引物，用pfuDNA聚合酶扩增出ScFvIIn基因，经Xba I和Kpn I双酶切后纯化。
质粒pMal-c2x或pMal-p2x经XbaI和PstI双酶切后纯化，然后用T4DNA Ligase将三片段进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-IIn-HuCκ和pMal-p2x-IIn-HuCκ(图1)。用Sac I酶切后出现一1143bp的带，与预期相符。
图1 重组pMal-c2x-Ⅱn-HuCκ表达质粒结构示意图略
2.3 MBP与SC11-ScFv和HuCκ融合表达载体的构建 以质粒pASK84-SC11为模板，pSCA1和pSCA2为引物，用 pfu DNA聚合酶将SC11-ScFv扩出，其5′端为Nco I位点，3′端为KpnI位点。经双酶切后纯化。
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质粒pMal-c2x-IIn-HuCκ和pMal-p2x-IIn-HuCκ经NcoI和KpnI双酶切后提取大片段，然后用T4DNA Ligase将之与上述SC11-ScFv进行连接，连接产物转化宿主菌DH5α。得到表达载体pMal-c2x-SC11-HuCκ和pMal-p2x-SC11-HuCκ。
经Pst I酶切出现一1000bp左右的带，与预期的相符。
2.4 表达 分别将质粒pMal-c2x-IIn、pMal-p2x-IIn、pMal-c2x-IIn-HuCκ、pMal-p2x-IIn-HuCκ、pMal-c2x-SC11-HuCκ和pMal-p2x-SC11-HuCκ转化大肠杆菌XL1blue，涂布含200μg/ml氨苄青霉素的LB平板。各挑单克隆，接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃培养至OD600约为0.8，加IPTG至终浓度为0.3mM进行诱导表达，30℃培养3h。然后收菌，制备全菌裂解液、上清、周质及包涵体等组份，进行SDS-PAGE。
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结果显示:ScFvIIn与不带信号肽的MBP融合表达可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，融合蛋白的分子量约为68kD，表达量占全菌蛋白的20%左右(图2h)，只形成极少量的包涵体(图2j);而与带信号肽的MBP融合表达在68kD处没有表达产物，而在周质中43kD处有一较浓的新表达带(图2i)，可能是融合蛋白的降解产物;融合表达HuCκ的结果显示，不带信号肽的在胞浆内获得可溶性高表达的MBP-IIn(图3e)，分子量约为80kD，表达量占全菌蛋白的30%左右;带信号肽的没有在周质内见到分泌表达的目的蛋白，而在43kD处有一较浓的新表达带(图3d)，可能是融合蛋白的降解产物。
ScFvSC11-HuCκ与不带信号肽的MBP融合表达时，可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，融合蛋白的分子量约为80kD，表达量占全菌蛋白的30%左右(图3i)，只形成极少量的包涵体(图3j);而与带信号肽的MBP融合表达在80kD处没有表达产物，而在周质中43kD处有一较浓的新表达带(图3h)，可能是融合蛋白的降解产物。
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另外，宿主菌均生长良好，没有出现生长抑制。
图2 质粒pMAL-p2X-Ⅱn和pMAL-p2X-Ⅱn表达产物的SDS-PAGE(略)
图3 质粒pMAL-c2X-Ⅱn-HuCκ和pMAL-p2X-Ⅱn-HuCκ表达产物的SDS-PAGE(略)
3 讨论
大多数单链抗体在大肠杆菌内都是以包涵体形式表达。一般认为，影响包涵体形成的因素主要是外源蛋白本身的性质即氨基酸序列 [3] 。但大肠杆菌等外部因素亦极为重要。包涵体形成的分子机制大多认为是新生的多肽链存在着两条相互竞争的折叠和聚合途径 [4] 。具体的原因包括大肠杆菌胞质内的还原环境影响了二硫键的形成 [5] ;大肠杆菌内的分子伴侣、折叠酶等辅助因子与其天然宿主细胞不同 [6] ;外源蛋白的表达速率过快等 [5] 。
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通过与亲水性的辅助蛋白融合表达是提高目的蛋白可溶性表达水平的常用方法。MBP是被广泛应用的通过融合表达使外源蛋白可溶性表达的辅助蛋白。融合表达促进折叠的原因可能是当融合的辅助蛋白在核糖体上合成后或刚 从核糖体上释放时迅速并有效地折叠成其天然结构，并促进下游的正在折叠的单元(目的蛋白)通过异构反应获得正确的结构。MBP的折叠需要DnaK-DnaJ和GroEL-GroES两个分子伴侣系统的帮助，这可以使这些分子伴侣聚集到目的蛋白的附近帮助其正确折叠 [7] 。
我们将单链抗体与MBP融合表达得到了较好的结果。不仅在胞浆内得到了可溶性的高表达，而且消除了单链抗体对大肠杆菌的生长抑制。但同时也发现，与不带信号肽MBP不同，带信号肽MBP与单链抗体的融合蛋白在SDS-PAGE时，周质内没有预期的表达带，而在低分子量处有较明显的带，可能是由于融合蛋白分子量较大，在传输到周质后或在传输过程中被周质内的蛋白酶降解。同时我们还发现，融合表达HuCκ，不仅可以促进单链抗体的二聚化，还可以在一定程度上促进可溶性的表达。
, 百拇医药
参考文献
1 Kapust RB，Waugh DS.Escherichia coli maltose-binding protein is unˉcommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.Protein Sci，1999，8(8):1668-1674.
2 Hayhurst A.Improved expression characteristics of single-chain Fv Fragments when fused sownstream of the Escherichia coli maltose-binding protein or upatresm of a single immunoglobulin-constant doˉmain.Protein Expr Purif，2000，18:1-10.
, http://www.100md.com
3 Mitraki A，King J.Protein Folding intermediates and inclusion body forˉmation.Bio/Technology，1989，7(7):690-697.
4 Lilie H，Schwarz E，Rudolph R.Advances in refording of proteins proˉducedin E.coli.Curr Opin Biotechnol，1998，9(5):497-501.
5 Guise AD，West SM，Chaudhuri JB.Protein folding in vivo and renaturaˉtion
of recombinant proteins from inclusion bodies.Mol Biotechnol，1996，6(1):53-64.
, 百拇医药
6 Feldman DE，Frydman J.Protein folding in vivo:the importance of molecular chaperones.Curr Opin in Struct Biol，2000，10(1):26-33.
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作者单位:1 071000河北保定河北省疾病控制中心
2 100071北京军事医学科学院生物工程研究所
(收稿日期:2003-04-08)
(编辑 元红), 百拇医药(康铁军)