以牛胶原为基料制备胶原膜并构建人工真皮的研究
【摘要】 目的 在牛胶原膜中植入幼儿包皮成纤维细胞，构建人工真皮替代物，以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用，为研制大面积创面覆盖物———复合皮奠定基础。方法 (1)酶消化法培养幼儿成纤维细胞;(2)制备胶原膜，接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化;(3)细胞计数;(4)H.E染色;(5)扫描电镜观测胶原凝胶的表面是否有成纤维细胞附着;(6)透射电镜观察胶原膜内部成纤维细胞形态及结构特点;(7)三联染色观察人工真皮中胶原纤维、弹力纤维及网状纤维的分布。结果 (1)利用胶原膜构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工真皮收缩现象。(2)细胞计数法所得生长曲线表明植入人工胶原膜中的细胞具有典型的细胞增殖现象。(3)H.E染色可见胶原呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞分布于胶原膜内部和表面。(4)扫描电镜下可见胶原膜表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于胶原膜上。(5)透射电镜下见成纤维细胞功能活跃。(6)三联染色显示人工真皮中存在胶原纤维及成纤维细胞新合成的弹力纤维。结论 成纤维细胞在胶原膜中有着活跃的生物学特性，以胶原膜为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能。
, 百拇医药
关键词 成纤维细胞 胶原膜 皮肤组织工程
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2657-04
Study on how to make the artificial dermis
by bovine collagen membrane
Liu Jie，Wang Dewen，Zhang Yan，et al.
Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To transplant the fibroblast as the seeding cell intothe bovine collagen membrane in order to investigate the growth，differentiation，proliferation and the function between the epidermis and the dermis，siˉmultaneously to prepare for making the artificial composite skin.Methods (1)Trypsin was used as the isolation medium to get the fibroblast;(2)Prepare for collagen membrane，the change of cell configuration was observed;(3)Counting the cell number;(4)H.E staining;(5)Whether the cells attaching into the matrix was observed by Scanning electron microscope(SEM);(6)The construction features offibroblast in the dermis were observed by transmission electron microscope(TEM);(7)Triad staining was used to observe the distribution of collagen fibers，elastic fibers and argyrophilic fiber.Results (1)The character and color of the artificial dermis were similar to the normal dermis，the artificial dermis wasnot fragile，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of the dermis was not observed.(2)The growth curve showed that the cells in the collagen membrane proliferated after itwas transplanted into the trestle.(3)The collagen membrane was pale red color by H.E staining，the fibroblasts were both found on the surface or in the matrix.(4)There were fusiform cells on the surface of the matrix by SEM，and the cells tightly attach into the collagen.(5)The fibroblasts in the membrane had active biologic function by transmission electron miˉcroscopy.(6)Triad staining showed that there were collagen fibers and elastic fibers after the fibroblasts were transˉplanted into the trestle.Conclusion The cultured fibroblasts in the membrane had active biologic character，the derˉmis made by bovine collagen membrane possessed similar structure and function to the normal skin.
, 百拇医药
Key words fibroblast collagen membrane tissue engineering of skin
Ⅰ型胶原主要分布在皮肤、肌腱、血管壁等组织中，它能促进皮肤上皮细胞的增殖和分化，在胶原刺激下，成纤维细胞生长迅速，使皮肤损伤能较快地修复，因此，Ⅰ型胶原是促进创伤愈合的良好材料。
目前，商品名为Biobrane的合成网膜内层尼龙纤维网的网孔中即充满了化学交联的胶原，外层再覆盖以硅膜，并成功应用于供皮区创面和浅度烧伤创面。而Advanced Tisˉsue Sciences公司生产的Dermagraft TC 就是把新生儿成纤维细胞培养在该合成敷料的尼龙网中，临床应用表明优于或等同于异体皮。1996年已获美国食品与药物管理局(FDA)批准用于临床。但Biobrane和Dermagraft TC 为不可降解性的合成复合膜，在人体烧伤创面中只能起到暂时性创面覆盖物作用，而且由于硅膜的存在，很难改变网膜的厚度，使其临床应用受到了限制。
, 百拇医药
受到Dermagraft TC 的启示，我们在成功制备牛胶原膜支架的基础上，在其中种植幼儿成纤维细胞，构建了人工真皮，为提供一种永久性创面覆盖物和进一步构建人工复合皮奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清均购自Gibico公司，胶原膜制备按照本实验室已建立方法进行 [1] 。
1.2 幼儿皮肤成纤维细胞的培养及鉴定 取行包皮环切术的幼儿包皮，采用胰蛋白酶进行酶消化法培养，并进行传代，取其3～4代细胞制备细胞悬液，同时，制备细胞爬片，并对该细胞进行Ⅰ型胶原和波形蛋白的免疫组织化学染色，步骤如下:制备成功的细胞爬片，置于100%丙酮4℃下固定25min，PBS漂洗，消化，加入鼠抗人的Ⅰ型胶原抗体(或波形蛋白抗体)(一抗)，4℃冰箱过夜，PBS洗，加入生物素标记的羊抗鼠抗体(二抗)，37℃30min，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(三抗)，37℃30min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。
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1.3 人工真皮的制备 胶原膜切成直径为2cm大小的圆形，置于12孔板中， 60 Coγ射线消毒胶原膜，用双抗(青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L)D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的第三代成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于胶原膜上，每孔2ml，37℃，5%CO 2 条件下培养。共制备5板。
1.4 细胞生长曲线的绘制 接种后2w内，每天取3个孔中的样本，采用0.25%胶原酶消化下胶原膜上的细胞，进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。
1.5 H.E染色 培养后1、2、3周，分别采用中性福尔马林液固定，常规组织切片，H.E染色，镜下观察。
1.6 SEM观察 培养1、3天、1、2、3周，按照常规方法利用扫描电镜观察成纤维细胞在胶原膜表面的生长状况，采用仪器为HITACHI S-450型。
, 百拇医药
1.7 TEM观察 培养1、2、3周，按照常规方法利用透射电镜观察胶原膜内成纤维细胞的结构和功能特征。采用仪器为Philips EM400T。
1.8 三联染色法 第2周时，将人工真皮置于中性福尔马林固定，按参考文献 [2] 方法进行染色。
2 结果
2.1 细胞生长状况 倒置显微镜下，胶原膜样品较疏松，透光能力相对较强，在细胞较少时，可观察到表面细胞生长状况。在种植后2h，即可见到成纤维细胞附着于胶原膜上，大部分呈圆形;4h，细胞伸为伪足，贴附较紧密，此时轻轻振摇培养皿，细胞也不易脱落;24h，细胞数量未发生明显变化;72h，细胞开始增殖，细胞数量增多;此后，细胞数量继续增多，至培养后第10天，细胞基本长满表面。但在种植成纤维细胞后，培养板底部可见少量成纤维细胞附着并随培养时间延长而增殖。
, 百拇医药 2.2 细胞计数法结果 具体数据参见图1。结果显示:附着胶原膜上的细胞在刚刚种植的2天细胞数量无明显变化，约占种植细胞数量的2/3左右，但从第3天开始，细胞增殖明显，以后逐渐增加，到第10天，细胞继续增殖，第11天到第13天，细胞数量仍在增多，第14天，细胞数量与第13天无明显变化。
图1 利用胶原膜构建人工真皮的成纤维细胞生长曲线
2.3 人工真皮形态观察 H.E染色下可见:第1周时，细胞附着在胶原膜的表面，大部分连接成片，可见到成纤维细胞向基质内部生长;第2周时，在基质表面形成一连续的细胞层，且有大量细胞长入脱细胞基质内(图2);第3周时，基质表面连续细胞层依然存在，基质内部的细胞继续增多。
图2 利用胶原膜构建的人工真皮第14天， 内部和表面均可见到成纤维细胞(H.E×200)
2.4 成纤维细胞在胶原膜表面生长状况 扫描电镜下显示:第1天在膜表面可见到成纤维细胞附着，少量细胞仍然是圆形，大多数细胞已伸出小的2～3个突起。第3天成纤维细胞增多，大多数细胞呈现长梭形，紧密贴附于基质表面。随着培养时间延长，基质表面细胞逐渐增多，至第2周时，基本长满胶原膜的表面(图3)。
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图3 胶原膜构建的人工真皮第14天， 成纤维细胞长满胶原膜的表面(SEM×3000)
2.5 成纤维细胞在人工真皮中的功能 TEM结果显示:共培养后2周，人工真皮内的成纤维细胞呈梭形或多角形，功能活跃，可见到大量的高尔基复合体和粗面内质网，细胞外可见到新合成的细胞外基质和胶原原纤维(图4)。
图4 利用胶原膜构建的人工真皮，培养2周后， 可见成纤维细胞分泌新生胶原(TEM×600)
三联染色结果表明:未种植成纤维细胞的胶原膜，仅可见到红色的胶原纤维，而构建好的人工真皮，共培养后2周，在胶原膜内部，除红色的胶原纤维外，还有蓝绿色的弹性纤维存在。但未见到呈黑色的网状纤维(图5)。
图5 利用胶原膜构建的人工真皮14天，可见红色的胶原纤维和蓝绿色的弹性纤维(三联染色×200)
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3 讨论
作为皮肤细胞外基质主要组成成分之一的胶原，在体内以不溶性的巨分子结构形式存在，并和其它细胞外基质成分(如蛋白多糖、粘连蛋白等)结合在一起 [3，4] 。
尽管胶原的超螺旋结构存在一定的免疫原性，但不同种属间胶原的抗原性较弱，不引起明显的炎症反应及排斥、异物反应。因此，可作为一种天然的生物大分子广泛地应用于各种创面的覆盖 [5～7] 。
正是基于胶原的这一特性，现在已有几种利用胶原作为支架的人工皮肤产品问世，如:美国Integra life sciences公司制造的双层人工皮肤商品名为Integra TM [8] ，是由戊二醛交联的牛Ⅰ型胶原与6硫酸软骨素构成“真皮”，“表皮”为硅橡胶薄膜。应用于创面后“真皮”可逐渐自行降解，而患者自己的内皮细胞和成纤维细胞长入形成新的真皮结构，几周后用薄层网状自体皮代替硅膜。1996年已获美国FDA 批准用于临床。Integra TM 是异种来源的永久性真皮替代物。日本GUNZE公司也开发了一种双层人工真皮Pelanac TM ，由猪皮肤胶原海绵内层和硅橡胶外层组成(不含氨基多糖)，临床移植后3周揭去硅膜可见新合成的真皮样组织形成，于其上移植厚0.008英寸的自体薄层皮肤获得满意的疗效 [9] 。
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但这两种人工皮肤一个共同的缺点是均缺乏成纤维细胞，从而延长真皮重建的时间，并且表面的硅橡胶外层需除去，虽然硅橡胶增强了保持体液的功能，但增加了对机体的损伤，且需要二次植皮 [10～12] 。
目前国内有多家利用各种支架成分构建了人工真皮，但或者仅为支架成分，没有细胞成分的存在，或者采用鼠尾胶原构建支架，来源受到限制，而本实验室以胎牛皮作为原料，并采用抗原点定相切处的方法制备了人工胶原膜支架，具有免疫原性低，来源广泛，与细胞结合力较强并可在体内降解的特点，同时由于幼儿细胞免疫原性较低，我们采用幼儿成纤维细胞作为种子细胞，成功构建了人工真皮，具有较好的应用前景。
H.E染色、细胞计数和SEM均证实，幼儿成纤维细胞与胶原膜的结合良好，且细胞可持续向胶原膜内部生长，至第3周时，与正常皮肤真皮的结构非常类似，胶原内部有大量的成纤维细胞，并沿一定方向排列。
TEM和三联染色显示:植入其中的成纤维细胞功能较活跃，可合成细胞外基质，提示这是一种功能性皮肤替代物。通过结构和功能的初步观察，我们认为本实验室利用胶原膜构建的人工真皮存在以下应用潜能:可单独应用于临床皮肤缺损病人;允许在其上移植超薄自体皮，其自身产生的瘢痕比单独移植半厚自体皮减少。此外，与另外一种支架———胶原凝胶相比，胶原膜易于工业生产和贮存，而且对胶原的交联处理提高了其机械性能;形状、大小和厚度易于改变。但也存在着仅达到真皮重建，尚需移植自体皮的缺点。因此，利用该胶原膜构建人工复合皮就显得极为重要。
, http://www.100md.com
参考文献
1 刘杰，王德文，彭瑞云，等.人工胶原膜对大鼠皮肤创伤促愈作用的研究.军事医学科学院院刊，2001，25(4):280-282.
2 龚志锦，詹洲。病理组织制片和染色技术.上海:上海科学技术出版社，1994，65-66.
3 永井裕，藤本大三郎.胶原蛋白试验方法.上海:上海中医学院出版社，1988，1-10，62-85.
4 Hafemann B，Ensslen S，Erdmann C，et al.Use of a collagen/elastin membranefor the tissue engineering of dermis.Burns，1999，25:373-384.
5 朱堂友，伍津津，李文维.皮肤创面覆盖物的研究进展.国外医学·皮肤性病学分册，2000，26(1):6-9.
, 百拇医药
6 TuanT T，Song A，Chang S，et al.In vitro Fibroplasia:matrix contracˉtion，cell growth，and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels.Exp Cell Res，1996，223(1):127-134.
7 Diegelmann FR.Cell culture and biochemical aspects of normal and abˉnormal wound healing:Anover view.J Urol，1997，157(2):298-302.
8 Colige AC，Lambert CA，Nusgens BV，et al.Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro.Biochem J，1992，285(3):215-221.
, 百拇医药
9 Chan ES，Lam PK，Liew CT，et al.The use of composite biodegradable skin graft and artificial skin for burn reconstruction.Plast Reconstr Surg，2000，105(2):807-808.
10 Mak VH，Wh Cumpstone，Kennedy A H，et al.Barrier function of huˉman keratinocyte cultures grown at the air-liquid interface.J Invest Dermatol，1991，96:323-327.
11 Boyce ST，Hansborngh J F.Biologic attachment，growth，and differentiˉ ation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chonclroitin-6-sulfate substrate.Surgery，1988，103(4):421-431.
, 百拇医药
12 Raymund E HORCH，Markus Debus，Gilbert Wagner，et al.Cultured human keratinocytes on Type I collagen Membranes to Reconstitute the epidermis.Tissue engineering，2000，6(1):53-67.
基金项目：科技部科研院所技术开发专项资金项目(NCSTE-2000-JKZX-011)军事医学院创新基金(9905106)
作者单位：1 100850北京军事医学科研院放射研究所
2 100016北京中国皮革和制鞋工业研究院, 百拇医药(刘 杰 王德文 张 燕 崔雪梅 谷庆阳 赵梅兰)
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关键词 成纤维细胞 胶原膜 皮肤组织工程
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2657-04
Study on how to make the artificial dermis
by bovine collagen membrane
Liu Jie，Wang Dewen，Zhang Yan，et al.
Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To transplant the fibroblast as the seeding cell intothe bovine collagen membrane in order to investigate the growth，differentiation，proliferation and the function between the epidermis and the dermis，siˉmultaneously to prepare for making the artificial composite skin.Methods (1)Trypsin was used as the isolation medium to get the fibroblast;(2)Prepare for collagen membrane，the change of cell configuration was observed;(3)Counting the cell number;(4)H.E staining;(5)Whether the cells attaching into the matrix was observed by Scanning electron microscope(SEM);(6)The construction features offibroblast in the dermis were observed by transmission electron microscope(TEM);(7)Triad staining was used to observe the distribution of collagen fibers，elastic fibers and argyrophilic fiber.Results (1)The character and color of the artificial dermis were similar to the normal dermis，the artificial dermis wasnot fragile，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of the dermis was not observed.(2)The growth curve showed that the cells in the collagen membrane proliferated after itwas transplanted into the trestle.(3)The collagen membrane was pale red color by H.E staining，the fibroblasts were both found on the surface or in the matrix.(4)There were fusiform cells on the surface of the matrix by SEM，and the cells tightly attach into the collagen.(5)The fibroblasts in the membrane had active biologic function by transmission electron miˉcroscopy.(6)Triad staining showed that there were collagen fibers and elastic fibers after the fibroblasts were transˉplanted into the trestle.Conclusion The cultured fibroblasts in the membrane had active biologic character，the derˉmis made by bovine collagen membrane possessed similar structure and function to the normal skin.
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Key words fibroblast collagen membrane tissue engineering of skin
Ⅰ型胶原主要分布在皮肤、肌腱、血管壁等组织中，它能促进皮肤上皮细胞的增殖和分化，在胶原刺激下，成纤维细胞生长迅速，使皮肤损伤能较快地修复，因此，Ⅰ型胶原是促进创伤愈合的良好材料。
目前，商品名为Biobrane的合成网膜内层尼龙纤维网的网孔中即充满了化学交联的胶原，外层再覆盖以硅膜，并成功应用于供皮区创面和浅度烧伤创面。而Advanced Tisˉsue Sciences公司生产的Dermagraft TC 就是把新生儿成纤维细胞培养在该合成敷料的尼龙网中，临床应用表明优于或等同于异体皮。1996年已获美国食品与药物管理局(FDA)批准用于临床。但Biobrane和Dermagraft TC 为不可降解性的合成复合膜，在人体烧伤创面中只能起到暂时性创面覆盖物作用，而且由于硅膜的存在，很难改变网膜的厚度，使其临床应用受到了限制。
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受到Dermagraft TC 的启示，我们在成功制备牛胶原膜支架的基础上，在其中种植幼儿成纤维细胞，构建了人工真皮，为提供一种永久性创面覆盖物和进一步构建人工复合皮奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清均购自Gibico公司，胶原膜制备按照本实验室已建立方法进行 [1] 。
1.2 幼儿皮肤成纤维细胞的培养及鉴定 取行包皮环切术的幼儿包皮，采用胰蛋白酶进行酶消化法培养，并进行传代，取其3～4代细胞制备细胞悬液，同时，制备细胞爬片，并对该细胞进行Ⅰ型胶原和波形蛋白的免疫组织化学染色，步骤如下:制备成功的细胞爬片，置于100%丙酮4℃下固定25min，PBS漂洗，消化，加入鼠抗人的Ⅰ型胶原抗体(或波形蛋白抗体)(一抗)，4℃冰箱过夜，PBS洗，加入生物素标记的羊抗鼠抗体(二抗)，37℃30min，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(三抗)，37℃30min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。
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1.3 人工真皮的制备 胶原膜切成直径为2cm大小的圆形，置于12孔板中， 60 Coγ射线消毒胶原膜，用双抗(青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L)D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的第三代成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于胶原膜上，每孔2ml，37℃，5%CO 2 条件下培养。共制备5板。
1.4 细胞生长曲线的绘制 接种后2w内，每天取3个孔中的样本，采用0.25%胶原酶消化下胶原膜上的细胞，进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。
1.5 H.E染色 培养后1、2、3周，分别采用中性福尔马林液固定，常规组织切片，H.E染色，镜下观察。
1.6 SEM观察 培养1、3天、1、2、3周，按照常规方法利用扫描电镜观察成纤维细胞在胶原膜表面的生长状况，采用仪器为HITACHI S-450型。
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1.7 TEM观察 培养1、2、3周，按照常规方法利用透射电镜观察胶原膜内成纤维细胞的结构和功能特征。采用仪器为Philips EM400T。
1.8 三联染色法 第2周时，将人工真皮置于中性福尔马林固定，按参考文献 [2] 方法进行染色。
2 结果
2.1 细胞生长状况 倒置显微镜下，胶原膜样品较疏松，透光能力相对较强，在细胞较少时，可观察到表面细胞生长状况。在种植后2h，即可见到成纤维细胞附着于胶原膜上，大部分呈圆形;4h，细胞伸为伪足，贴附较紧密，此时轻轻振摇培养皿，细胞也不易脱落;24h，细胞数量未发生明显变化;72h，细胞开始增殖，细胞数量增多;此后，细胞数量继续增多，至培养后第10天，细胞基本长满表面。但在种植成纤维细胞后，培养板底部可见少量成纤维细胞附着并随培养时间延长而增殖。
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图1 利用胶原膜构建人工真皮的成纤维细胞生长曲线
2.3 人工真皮形态观察 H.E染色下可见:第1周时，细胞附着在胶原膜的表面，大部分连接成片，可见到成纤维细胞向基质内部生长;第2周时，在基质表面形成一连续的细胞层，且有大量细胞长入脱细胞基质内(图2);第3周时，基质表面连续细胞层依然存在，基质内部的细胞继续增多。
图2 利用胶原膜构建的人工真皮第14天， 内部和表面均可见到成纤维细胞(H.E×200)
2.4 成纤维细胞在胶原膜表面生长状况 扫描电镜下显示:第1天在膜表面可见到成纤维细胞附着，少量细胞仍然是圆形，大多数细胞已伸出小的2～3个突起。第3天成纤维细胞增多，大多数细胞呈现长梭形，紧密贴附于基质表面。随着培养时间延长，基质表面细胞逐渐增多，至第2周时，基本长满胶原膜的表面(图3)。
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图3 胶原膜构建的人工真皮第14天， 成纤维细胞长满胶原膜的表面(SEM×3000)
2.5 成纤维细胞在人工真皮中的功能 TEM结果显示:共培养后2周，人工真皮内的成纤维细胞呈梭形或多角形，功能活跃，可见到大量的高尔基复合体和粗面内质网，细胞外可见到新合成的细胞外基质和胶原原纤维(图4)。
图4 利用胶原膜构建的人工真皮，培养2周后， 可见成纤维细胞分泌新生胶原(TEM×600)
三联染色结果表明:未种植成纤维细胞的胶原膜，仅可见到红色的胶原纤维，而构建好的人工真皮，共培养后2周，在胶原膜内部，除红色的胶原纤维外，还有蓝绿色的弹性纤维存在。但未见到呈黑色的网状纤维(图5)。
图5 利用胶原膜构建的人工真皮14天，可见红色的胶原纤维和蓝绿色的弹性纤维(三联染色×200)
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3 讨论
作为皮肤细胞外基质主要组成成分之一的胶原，在体内以不溶性的巨分子结构形式存在，并和其它细胞外基质成分(如蛋白多糖、粘连蛋白等)结合在一起 [3，4] 。
尽管胶原的超螺旋结构存在一定的免疫原性，但不同种属间胶原的抗原性较弱，不引起明显的炎症反应及排斥、异物反应。因此，可作为一种天然的生物大分子广泛地应用于各种创面的覆盖 [5～7] 。
正是基于胶原的这一特性，现在已有几种利用胶原作为支架的人工皮肤产品问世，如:美国Integra life sciences公司制造的双层人工皮肤商品名为Integra TM [8] ，是由戊二醛交联的牛Ⅰ型胶原与6硫酸软骨素构成“真皮”，“表皮”为硅橡胶薄膜。应用于创面后“真皮”可逐渐自行降解，而患者自己的内皮细胞和成纤维细胞长入形成新的真皮结构，几周后用薄层网状自体皮代替硅膜。1996年已获美国FDA 批准用于临床。Integra TM 是异种来源的永久性真皮替代物。日本GUNZE公司也开发了一种双层人工真皮Pelanac TM ，由猪皮肤胶原海绵内层和硅橡胶外层组成(不含氨基多糖)，临床移植后3周揭去硅膜可见新合成的真皮样组织形成，于其上移植厚0.008英寸的自体薄层皮肤获得满意的疗效 [9] 。
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但这两种人工皮肤一个共同的缺点是均缺乏成纤维细胞，从而延长真皮重建的时间，并且表面的硅橡胶外层需除去，虽然硅橡胶增强了保持体液的功能，但增加了对机体的损伤，且需要二次植皮 [10～12] 。
目前国内有多家利用各种支架成分构建了人工真皮，但或者仅为支架成分，没有细胞成分的存在，或者采用鼠尾胶原构建支架，来源受到限制，而本实验室以胎牛皮作为原料，并采用抗原点定相切处的方法制备了人工胶原膜支架，具有免疫原性低，来源广泛，与细胞结合力较强并可在体内降解的特点，同时由于幼儿细胞免疫原性较低，我们采用幼儿成纤维细胞作为种子细胞，成功构建了人工真皮，具有较好的应用前景。
H.E染色、细胞计数和SEM均证实，幼儿成纤维细胞与胶原膜的结合良好，且细胞可持续向胶原膜内部生长，至第3周时，与正常皮肤真皮的结构非常类似，胶原内部有大量的成纤维细胞，并沿一定方向排列。
TEM和三联染色显示:植入其中的成纤维细胞功能较活跃，可合成细胞外基质，提示这是一种功能性皮肤替代物。通过结构和功能的初步观察，我们认为本实验室利用胶原膜构建的人工真皮存在以下应用潜能:可单独应用于临床皮肤缺损病人;允许在其上移植超薄自体皮，其自身产生的瘢痕比单独移植半厚自体皮减少。此外，与另外一种支架———胶原凝胶相比，胶原膜易于工业生产和贮存，而且对胶原的交联处理提高了其机械性能;形状、大小和厚度易于改变。但也存在着仅达到真皮重建，尚需移植自体皮的缺点。因此，利用该胶原膜构建人工复合皮就显得极为重要。
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参考文献
1 刘杰，王德文，彭瑞云，等.人工胶原膜对大鼠皮肤创伤促愈作用的研究.军事医学科学院院刊，2001，25(4):280-282.
2 龚志锦，詹洲。病理组织制片和染色技术.上海:上海科学技术出版社，1994，65-66.
3 永井裕，藤本大三郎.胶原蛋白试验方法.上海:上海中医学院出版社，1988，1-10，62-85.
4 Hafemann B，Ensslen S，Erdmann C，et al.Use of a collagen/elastin membranefor the tissue engineering of dermis.Burns，1999，25:373-384.
5 朱堂友，伍津津，李文维.皮肤创面覆盖物的研究进展.国外医学·皮肤性病学分册，2000，26(1):6-9.
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6 TuanT T，Song A，Chang S，et al.In vitro Fibroplasia:matrix contracˉtion，cell growth，and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels.Exp Cell Res，1996，223(1):127-134.
7 Diegelmann FR.Cell culture and biochemical aspects of normal and abˉnormal wound healing:Anover view.J Urol，1997，157(2):298-302.
8 Colige AC，Lambert CA，Nusgens BV，et al.Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro.Biochem J，1992，285(3):215-221.
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9 Chan ES，Lam PK，Liew CT，et al.The use of composite biodegradable skin graft and artificial skin for burn reconstruction.Plast Reconstr Surg，2000，105(2):807-808.
10 Mak VH，Wh Cumpstone，Kennedy A H，et al.Barrier function of huˉman keratinocyte cultures grown at the air-liquid interface.J Invest Dermatol，1991，96:323-327.
11 Boyce ST，Hansborngh J F.Biologic attachment，growth，and differentiˉ ation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chonclroitin-6-sulfate substrate.Surgery，1988，103(4):421-431.
, 百拇医药
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基金项目：科技部科研院所技术开发专项资金项目(NCSTE-2000-JKZX-011)军事医学院创新基金(9905106)
作者单位：1 100850北京军事医学科研院放射研究所
2 100016北京中国皮革和制鞋工业研究院, 百拇医药(刘 杰 王德文 张 燕 崔雪梅 谷庆阳 赵梅兰)