红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定的临床意义
http://www.100md.com
中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
【摘要】 目的 建立一种测定红细胞补体Ⅰ型受体(CR 1 )敏感且重复性良好的实验方法，研究其临床价值。方法 采用FACS Vantage流式细胞仪检测20000个红细胞，结合Cell Quest软件分析，计算阳性细胞百分比。结果 本方法具有良好的敏感性及重复性，正常健康人红细胞CR 1 阳性细胞百分比显著高于大肠癌、肝癌、胰腺癌等患者(P<0.001)，其中肝癌患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比表达显著低于其它疾病(P<0.001)，差异有显著意义。结论 本方法能准确检测出红细胞CR 1 分子的表达，红细胞CR 1 的表达及变化与恶性肿瘤的发生与发展及转归具有明显相关性;并其百分比对恶性肿瘤的辅助诊断与治疗效果评价具有价值。
关键词 恶性肿瘤 阳性细胞百分比 补体受体 低表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0320-02
, 百拇医药
The clinical significance of the percent of complement receptor
typeⅠpositive cell in erythrocyte
Wang Wei，Cao Yuemin，Zheng Shiling，et al.
Department of Surgery，People’s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang050051.
【Abstract】 Objective To establish a highly sensitive and repetitive method to analyze the expression of eryˉthrocyte complement receptor typeⅠ(CR 1 )and investigate its clinical value.Methods Using FACS Vantage flow cytometry instrument for20000erythrocyte，analyzing with Cell Quest soft and counting the percent of the CR 1 positive cell.Results This method was highly sensitive and repetitive.In control group，the percent of CR 1 positive cell was far higher than mammary cancer，carcinoma of large intestine，hepatocarcinoma and cancer of pancreas groups(P<0.001)，in which the percent of positive cell of hepatocarcinoma group was much lower than other disease(P<0.001).The difference was significant.Conclution This method can accurately test the expression of CR 1 in erythrocyte.There was significantly correlations between the expression，change of CR 1 positive cell and the occurrence，developˉment，prognosis of malignant tumor.Testing the percent of CR 1 positive cell was of great theoretical and clinical value on the accessory diagnose of malignant tumor and the therapeutic evaluation.
, 百拇医药
Key words malignant tumor percent of positive cell complement receptor lowexpression
红细胞在血液中的数量庞大，分布最广，与机体细胞及抗原物质接触最广泛，红细胞在机体天然免疫及指导非特异性免疫反应中占重要地位，其中细胞膜上的补体Ⅰ型受体CR 1 的表达一直是国内外学者的研究热点。1985年Thomesn等描述了红细胞CR 1 ELISA法，使用戊二醛固定将红细胞单层包被在微量滴定板上;1987年郭峰教授建立了红细胞免疫粘附酵母菌和肿瘤细胞的测定方法;1993年Jones [1] 使用ELISA技术测定完整红细胞膜上CR 1 的分子数量;2000年王海滨 [2] 使用细胞酶免疫分析法定量测定完整红细胞上CR 1 分子数量。我们在此基础上使用FACS Vanˉtage流式细胞仪检测20000个红细胞结合Cell Quest软件分析计算CR 1 阳性细胞百分比。为红细胞CR 1 的检测能够应用于临床检验，为临床恶性肿瘤疾病的辅助诊断以及对病情判断和治疗效果评价提供了重要参考指标。现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 血标本 取清晨空腹静脉血1ml，EDTA抗凝，采血后4h内实验。对照组血标本取自本院健康查体人群50例，实验组大肠癌患者30例，肝癌患者27例，胰腺癌患者20例， 卵巢囊20例，均为2000年12月～2002年7月河北省人民医院住院确诊患者。
1.2 仪器与试剂 FACS Vantage流式细胞仪(美国BD公司);XW-80A旋涡混合器(上海医科大学);CD35-FITC Cali BRITE Beads I micron Beads IgG 1 FITC/IgG 2a PE(均为美国BD公司产品)1%多聚甲醛(北京试剂二厂)。
1.3 测定方法 (1)取清晨空腹外周静脉血1ml;(2)取流式专用试管2支，1支加CD35-FITC单克隆抗体，另一管加阴性对照IgG 1 FITC/IgG 2a 各10μl，充分混匀3s，置4℃冰箱中反应15min，加1%多聚甲醛0.5ml，24h内上机检测;(3)FACS Vantage流式细胞仪，激发光波为488nm，启动Cell Quest软件，用I micron Beads调荧光检测变异系数(CV)<2%，用Cali BRITE Beads按程序调整流式细胞仪光电倍增管电压及灵敏度阈值。使仪器处于最佳工作状态，FSC和SSC选择对数方式，使用对照管调整阴性群体位于FL 1 VS LF 2 点图，每份标本收集红细胞20000个，计算阳性细胞的百分率。测定后在Macintosh7300型计算机用Cell Quest软件分析数据，HP/600型打印机打印结果。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 实验数据使用SPSS软件分析，各组用student检验。
2 结果
2.1 本试验检测重复性、灵敏度及阴性对照 关于荧光的灵敏度和分辨率采用鸡血红细胞和均一大小的微球来检测，每次应用前调整FSC，SSC道数的平均值及变异系数(CV)，使仪器处于最佳工作状态和同一标准。高灵敏表现在每个细胞只要有100个荧光分子(异硫氰酸荧光素)就可以检测出来，两个细胞间有2%差别，流式细胞仪就可以区别开来。每份标本都同时做同型阴性对照，以确定象限位置来计算阳性细胞百分率。
2.2 临床价值 (1)正常人红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值分布特点:50例健康人其表达分布存在一定差异，测 定值大于1.00%为高表达;测定值介于1.00%～0.50%之间为中表达;测定值小于0.50%为低表达。其它各组患者亦是如此分析(见表1)。(2)正常人与恶性肿瘤患者红细胞CR 1 测定值的表达存在一定差异，从表1中看出大肠癌、肝癌、胰腺癌患者其红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值明显低于正常对照组及卵巢囊肿组患者(P<0.001);其中从肝癌组患者下降最为严重，明显低于大肠癌及胰腺癌组患者(P<0.001)。对于肝癌、大肠癌、胰腺癌等患者的检测发现其红细胞CR 1 阳性细胞百分比值的下降程度随疾病的进展而逐渐降低，与疾病的严重程度明显相关。对临床病情判断具有一定参考价值。
, 百拇医药
表1 各组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比分布
注:a=0.05 正常对照组与卵巢囊肿组比较P>0.05;正常对照组与大肠癌组、肝癌组、胰腺癌组比较 P<0.001;肝癌组与大肠癌组、胰腺癌组比较 P<0.001
3 讨论
我们建立的红细胞CR 1 阳性细胞百分比的测定方法，灵敏度及重复性较好，适合在临床推广使用。本操作简单，不需洗涤红细胞，用完整的红细胞，而不将红细胞粘附在微量滴定板孔上，可保证红细胞膜上所有的抗原分子充分暴露，从而达到与CD35-FITC单克隆抗体充分反应之目的，这是本试验方法准确且重复性良好的重要因素之一。1例患者检测20000个红细胞也是保证本试验方法准确度的另一重要因素。
红细胞CR 1 具有广泛的生物学功能 [3，4] ，其主要功能有四方面。一是CR 1 通过与C3b或C4b结合抑制经典或旁路途径C3转化酶的形成;二是可以作为调理素受体增强吞噬细胞摄取包被C3b或C4b颗粒或微生物;三是可与带有C3b的免疫复合物结合并将免疫复合物送到肝脾网状内皮系统吞噬销毁，防止免疫复合物在组织中沉积;四是对机体具有免疫调节作用。虽然CR 1 在红细胞膜上的数量仅相当于白细胞膜上CR 1 分子的1/50～1/100，但其成簇分布且单位容积血液中红细胞的数目大于白细胞三个数量级，其与循环免疫复合物、抗原物质及其它机体细胞接触的机会是白细胞的500～1000倍 [2] 。因此红细胞膜上CR 1 阳性细胞百分比值的表达情况与机体正常生理功能维持及临床病理变化都具有重要意义。
, 百拇医药
从表1中可以看到正常对照组与卵巢囊肿组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值基本一致，差异无显著性(P>0.05)，大肠癌组、肝癌组及胰腺癌组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比显著低于正常对照组及卵巢囊肿组患者，差 异有非常显著性(P<0.001);且肝癌组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比明显低于大肠癌组和胰腺癌组患者，差异有非常显著性(P<0.001)。据相关文献报道乳腺癌患者外周血中红细胞CR 1 阳性细胞百分比明显低于正常人及乳腺小叶增生患者，其差异非常明显 [5] 。因此对一些与免疫因素有关的恶性肿瘤患者进行红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定具有重要临床价值。本测定方法简单，灵敏度及重复性良好，适合于临床进行常规检查，为恶性肿瘤患者的辅助诊断及临床治疗效果评价提供新的参考指标，希望医学界同仁进行更深入的研究，以取得更完善的结论。
参考文献
, 百拇医药
1 Jones DRE.Detection of red cell sensitiation by antibody and compleˉmentment:current practice and future perspectives.Comp Haematol Int，1993，3:201-207.
2 王海滨，张景萍，王辉，等.红细胞CR 1 分子的定量测定及其临床意义.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20:381-384.
3 Rodgaard A，Thomsen BS，Bendixen G，et al.Increased expression of complement receptor typeⅠ(CR 1 .CD35)on human peripheral blood T lymphocytes after polyclonal activation in vitro.Immunol Res，1995，14(1):69-76.
, 百拇医药
4 Montefiori DC，Graham BS，Zhou JY，et al.Binding of human immunodˉeficiency virus type1to the C3b/C4b receptor CR 1 (CD35)and red blood cell in the presence of enrelopespecific antibodies and compleˉment.National institutes of health AIDS vaccine clinical trials networks.J Infect Dis，1994，170(2):429-432.
5 王伟，曹月敏.红细胞补体Ⅰ型受体在乳腺癌患者中的表达.中华医学研究杂志，2002，10:885-886.
作者单位:050051石家庄河北省人民医院普外科(科研中心)
(收稿日期:2003-01-15)
(编辑李年令), 百拇医药
关键词 恶性肿瘤 阳性细胞百分比 补体受体 低表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0320-02
, 百拇医药
The clinical significance of the percent of complement receptor
typeⅠpositive cell in erythrocyte
Wang Wei，Cao Yuemin，Zheng Shiling，et al.
Department of Surgery，People’s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang050051.
【Abstract】 Objective To establish a highly sensitive and repetitive method to analyze the expression of eryˉthrocyte complement receptor typeⅠ(CR 1 )and investigate its clinical value.Methods Using FACS Vantage flow cytometry instrument for20000erythrocyte，analyzing with Cell Quest soft and counting the percent of the CR 1 positive cell.Results This method was highly sensitive and repetitive.In control group，the percent of CR 1 positive cell was far higher than mammary cancer，carcinoma of large intestine，hepatocarcinoma and cancer of pancreas groups(P<0.001)，in which the percent of positive cell of hepatocarcinoma group was much lower than other disease(P<0.001).The difference was significant.Conclution This method can accurately test the expression of CR 1 in erythrocyte.There was significantly correlations between the expression，change of CR 1 positive cell and the occurrence，developˉment，prognosis of malignant tumor.Testing the percent of CR 1 positive cell was of great theoretical and clinical value on the accessory diagnose of malignant tumor and the therapeutic evaluation.
, 百拇医药
Key words malignant tumor percent of positive cell complement receptor lowexpression
红细胞在血液中的数量庞大，分布最广，与机体细胞及抗原物质接触最广泛，红细胞在机体天然免疫及指导非特异性免疫反应中占重要地位，其中细胞膜上的补体Ⅰ型受体CR 1 的表达一直是国内外学者的研究热点。1985年Thomesn等描述了红细胞CR 1 ELISA法，使用戊二醛固定将红细胞单层包被在微量滴定板上;1987年郭峰教授建立了红细胞免疫粘附酵母菌和肿瘤细胞的测定方法;1993年Jones [1] 使用ELISA技术测定完整红细胞膜上CR 1 的分子数量;2000年王海滨 [2] 使用细胞酶免疫分析法定量测定完整红细胞上CR 1 分子数量。我们在此基础上使用FACS Vanˉtage流式细胞仪检测20000个红细胞结合Cell Quest软件分析计算CR 1 阳性细胞百分比。为红细胞CR 1 的检测能够应用于临床检验，为临床恶性肿瘤疾病的辅助诊断以及对病情判断和治疗效果评价提供了重要参考指标。现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 血标本 取清晨空腹静脉血1ml，EDTA抗凝，采血后4h内实验。对照组血标本取自本院健康查体人群50例，实验组大肠癌患者30例，肝癌患者27例，胰腺癌患者20例， 卵巢囊20例，均为2000年12月～2002年7月河北省人民医院住院确诊患者。
1.2 仪器与试剂 FACS Vantage流式细胞仪(美国BD公司);XW-80A旋涡混合器(上海医科大学);CD35-FITC Cali BRITE Beads I micron Beads IgG 1 FITC/IgG 2a PE(均为美国BD公司产品)1%多聚甲醛(北京试剂二厂)。
1.3 测定方法 (1)取清晨空腹外周静脉血1ml;(2)取流式专用试管2支，1支加CD35-FITC单克隆抗体，另一管加阴性对照IgG 1 FITC/IgG 2a 各10μl，充分混匀3s，置4℃冰箱中反应15min，加1%多聚甲醛0.5ml，24h内上机检测;(3)FACS Vantage流式细胞仪，激发光波为488nm，启动Cell Quest软件，用I micron Beads调荧光检测变异系数(CV)<2%，用Cali BRITE Beads按程序调整流式细胞仪光电倍增管电压及灵敏度阈值。使仪器处于最佳工作状态，FSC和SSC选择对数方式，使用对照管调整阴性群体位于FL 1 VS LF 2 点图，每份标本收集红细胞20000个，计算阳性细胞的百分率。测定后在Macintosh7300型计算机用Cell Quest软件分析数据，HP/600型打印机打印结果。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 实验数据使用SPSS软件分析，各组用student检验。
2 结果
2.1 本试验检测重复性、灵敏度及阴性对照 关于荧光的灵敏度和分辨率采用鸡血红细胞和均一大小的微球来检测，每次应用前调整FSC，SSC道数的平均值及变异系数(CV)，使仪器处于最佳工作状态和同一标准。高灵敏表现在每个细胞只要有100个荧光分子(异硫氰酸荧光素)就可以检测出来，两个细胞间有2%差别，流式细胞仪就可以区别开来。每份标本都同时做同型阴性对照，以确定象限位置来计算阳性细胞百分率。
2.2 临床价值 (1)正常人红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值分布特点:50例健康人其表达分布存在一定差异，测 定值大于1.00%为高表达;测定值介于1.00%～0.50%之间为中表达;测定值小于0.50%为低表达。其它各组患者亦是如此分析(见表1)。(2)正常人与恶性肿瘤患者红细胞CR 1 测定值的表达存在一定差异，从表1中看出大肠癌、肝癌、胰腺癌患者其红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值明显低于正常对照组及卵巢囊肿组患者(P<0.001);其中从肝癌组患者下降最为严重，明显低于大肠癌及胰腺癌组患者(P<0.001)。对于肝癌、大肠癌、胰腺癌等患者的检测发现其红细胞CR 1 阳性细胞百分比值的下降程度随疾病的进展而逐渐降低，与疾病的严重程度明显相关。对临床病情判断具有一定参考价值。
, 百拇医药
表1 各组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比分布
注:a=0.05 正常对照组与卵巢囊肿组比较P>0.05;正常对照组与大肠癌组、肝癌组、胰腺癌组比较 P<0.001;肝癌组与大肠癌组、胰腺癌组比较 P<0.001
3 讨论
我们建立的红细胞CR 1 阳性细胞百分比的测定方法，灵敏度及重复性较好，适合在临床推广使用。本操作简单，不需洗涤红细胞，用完整的红细胞，而不将红细胞粘附在微量滴定板孔上，可保证红细胞膜上所有的抗原分子充分暴露，从而达到与CD35-FITC单克隆抗体充分反应之目的，这是本试验方法准确且重复性良好的重要因素之一。1例患者检测20000个红细胞也是保证本试验方法准确度的另一重要因素。
红细胞CR 1 具有广泛的生物学功能 [3，4] ，其主要功能有四方面。一是CR 1 通过与C3b或C4b结合抑制经典或旁路途径C3转化酶的形成;二是可以作为调理素受体增强吞噬细胞摄取包被C3b或C4b颗粒或微生物;三是可与带有C3b的免疫复合物结合并将免疫复合物送到肝脾网状内皮系统吞噬销毁，防止免疫复合物在组织中沉积;四是对机体具有免疫调节作用。虽然CR 1 在红细胞膜上的数量仅相当于白细胞膜上CR 1 分子的1/50～1/100，但其成簇分布且单位容积血液中红细胞的数目大于白细胞三个数量级，其与循环免疫复合物、抗原物质及其它机体细胞接触的机会是白细胞的500～1000倍 [2] 。因此红细胞膜上CR 1 阳性细胞百分比值的表达情况与机体正常生理功能维持及临床病理变化都具有重要意义。
, 百拇医药
从表1中可以看到正常对照组与卵巢囊肿组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定值基本一致，差异无显著性(P>0.05)，大肠癌组、肝癌组及胰腺癌组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比显著低于正常对照组及卵巢囊肿组患者，差 异有非常显著性(P<0.001);且肝癌组患者红细胞CR 1 阳性细胞百分比明显低于大肠癌组和胰腺癌组患者，差异有非常显著性(P<0.001)。据相关文献报道乳腺癌患者外周血中红细胞CR 1 阳性细胞百分比明显低于正常人及乳腺小叶增生患者，其差异非常明显 [5] 。因此对一些与免疫因素有关的恶性肿瘤患者进行红细胞CR 1 阳性细胞百分比测定具有重要临床价值。本测定方法简单，灵敏度及重复性良好，适合于临床进行常规检查，为恶性肿瘤患者的辅助诊断及临床治疗效果评价提供新的参考指标，希望医学界同仁进行更深入的研究，以取得更完善的结论。
参考文献
, 百拇医药
1 Jones DRE.Detection of red cell sensitiation by antibody and compleˉmentment:current practice and future perspectives.Comp Haematol Int，1993，3:201-207.
2 王海滨，张景萍，王辉，等.红细胞CR 1 分子的定量测定及其临床意义.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20:381-384.
3 Rodgaard A，Thomsen BS，Bendixen G，et al.Increased expression of complement receptor typeⅠ(CR 1 .CD35)on human peripheral blood T lymphocytes after polyclonal activation in vitro.Immunol Res，1995，14(1):69-76.
, 百拇医药
4 Montefiori DC，Graham BS，Zhou JY，et al.Binding of human immunodˉeficiency virus type1to the C3b/C4b receptor CR 1 (CD35)and red blood cell in the presence of enrelopespecific antibodies and compleˉment.National institutes of health AIDS vaccine clinical trials networks.J Infect Dis，1994，170(2):429-432.
5 王伟，曹月敏.红细胞补体Ⅰ型受体在乳腺癌患者中的表达.中华医学研究杂志，2002，10:885-886.
作者单位:050051石家庄河北省人民医院普外科(科研中心)
(收稿日期:2003-01-15)
(编辑李年令), 百拇医药