乳腺癌细胞凋亡相关基因的表达及其临床意义研究
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中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
【摘要】 目的 探讨乳腺癌细胞凋亡相关基因P53、bcl-2、c-myc在乳腺癌组织中的表达及乳腺癌临床生物学行为和预后的相关性，以及三种基因表达的相关性。方法 采用免疫组化S-P法检测乳腺癌组织中的P53、bcl-2、c-myc蛋白的表达，进行临床分析。结果 58例乳腺癌P53阳性表达34.5%(20/58)，bcl-2表达72.4%(42/58)，c-myc表达44.8%(26/58);P53表达与腋淋巴结转移，远处转移呈正相关，与生存期呈负相关(P<0.05)，P53与年龄、肿物大小、病理类型、临床分期无关(P>0.05);bcl-2表达与生存期呈正相关(P<0.05)，与其它临床生物学行为无关(P>0.05);c-myc与腋淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，与远处转移和预后等临床生物学行为无关(P>0.05)。bcl-2与P53和c-myc表达均呈负相关，而P53与c-myc表达呈正相关，二者同时表达阳性预后差，bcl-2表达阳性，而P53和c-myc表达阴性者预后佳。结论 细胞凋亡相关基因与乳腺癌的腋淋巴结转移，远处转移及预后密切相关，联合检测能更准确地判断预后。
, 百拇医药
关键词 乳腺癌 细胞凋亡基因 预后
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0295-03
The expression of apoptosis correlative gene and clinical
significance in breast cancer cell
Li Xiaoli，Li li，Song ying
The Third Clinical Hospital of Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between apoptosis correlative gene P53，bcl-2and c-myc expression and the clinical biological action and prognosis of breast cancer，and to study the correlation among three gene expression products.Methods To detect the protein expression of P53，bcl-2and c-mycin breast canˉcer and to assay these clinical material.Results The positive rate of P53，bcl-2and c-myc expression were34.5%(20/58)，72.4%(42/58)and44.8%(26/58)respectively in58patients with breast cancer.The expression of P53was positive correlation with lymph node involvement and distant metastasis and negative relation to survival(P<0.05).Meanwhile there were no significant correlationbetween the P53expression and age，the size of tumor，pathoˉlogical type and clinical grade(P>0.05).The bcl-2expression was positive relation with axillary lymph nodes inˉvolvement(P<0.05)，and no relation to other clinical biologicalactions(P>0.05).A positive correlation existed in c-myc expression and axillary lymph nodes involvement(P<0.05).The bcl-2expression was negative relation to the expression of P53and c-myc，while there were positive correlation between P53and c-myc.Conclusion There was significant correlation between the expression of apoptosis correlative gene and axillary lymph node metastasis，disˉtant metastasis and prognosis in breast cancer.The associated detection of P53，bcl-2and c-myc can be a useful marker for accurately predicting prognosis.
, 百拇医药
Key words breast cancer apoptosis gene prognosis
乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤，而且发病率有逐年上升趋势，但其病因还未完全阐明，对肿瘤相关基因的研究早已表明乳腺癌的发生发展与多种基因改变有关。尽管乳腺癌中频繁发生染色体及DNA的异常，但由细胞凋亡基因调控的死亡形式凋亡也是乳腺癌形成的一个重要机制，在乳腺癌的进展过程中产生DNA损伤的细胞可以通过凋亡而被除去 [1] 。本研究通过联合检测乳腺癌凋亡相关基因P53、bcl-2、c-myc蛋白的表达，探讨其与乳腺癌临床生物学行为及预后的关系及其三者之间表达的相关性。
1 材料和方法
1.1 临床资料 全组58例选自1995年1月～1996年7月我院收治的乳腺癌术后病人的存档蜡块，且临床病理资料完整;年龄30～72岁，中位年龄48岁，腋淋巴结转移的38例，无转移的20例;发生远处转移的21例，无远处转移的37例;生存>5年的39例，生存<5年的19例;其中单纯癌39例，浸润性导管癌7例，髓样癌7例，硬癌4例，粘液腺癌1例;术后分期Ⅰ期5例，Ⅱ期33例、Ⅲ期20例。
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1.2 试验方法 采用免疫组化S-P法。一抗为鼠抗人bcl-2、鼠抗人P53、鼠抗人c-myc即用型。常规石蜡切片厚4μm，石蜡切片脱蜡至水，3%H 2 O 2 室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，微波炉95℃，15min，自然冷却20min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10min，倾去血清，滴加一抗工作液4℃过夜，PBS冲洗5min×3次，滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育30min，PBS冲洗，5min×3次，自来水充分冲洗，复染，封片。DAB显色，均设阳性和阴性对照。
1.3 结果判定 阳性反应为细胞浆内或细胞核内出现棕黄色颗粒。bcl-2阳性物质位于胞浆，P53阳性物质位于细胞核，c-myc阳性物质位于胞核或少许胞浆，根据阳性物质着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级;无阳性细胞或阳性细胞<10%或背景同空白对照者为(-)，每张切片仅有<25%的细胞明显阳性为(+)，25%～50%细胞明显呈阳性为(++)，>50%细胞呈阳性为(+++)。
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1.4 统计学分析 采用X 2 检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc蛋白表达情况 本研究P53、bcl-2及c-myc阳性表达率分别为34.5%(20/58)，72.4%(42/58)和44.8%(26/58)。
2.2 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc蛋白表达相关性 本 研究bcl-2与P53蛋白表达之间差异有显著性(P<0.05)，呈负相关;P53与c-myc蛋白表达之间无差异性(P>0.05)，呈正相关;bcl-2与c-myc蛋白表达之间差异有显著性(P<0.05)，呈负相关。
2.3 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc表达与临床生物学行为及预后的关系 本研究P53蛋白表达与腋淋巴结转移，远处转移呈正相关(P<0.05)，与预后呈负相关(P<0.05)，与年龄、肿物大小、病理分型、临床分期无关(P>0.05);bcl-2表达与预后呈正相关(P<0.05)，bcl-2表达越高，生存期越长。bcl-2与腋淋巴结转移、远处转移、年龄、肿物大小、病理类型、临床分期无关(P>0.05);c-myc与腋淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。而与其它临床生物学行为及预后均无关(P>0.05)。见表1。
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表1 P53、bcl-2、c-myc阳性表达与乳腺癌临床病理和预后的关系 例(略)
注: P<0.05
3 讨论
乳腺癌的发生和发展是一个复杂，多步骤的演进过程，细胞凋亡是恶性肿瘤普遍的自发现象。众多学者研究认为细胞凋亡不但参与了乳腺癌的发生和发展，而且对乳腺癌的治疗及预后均有显著影响。
P53基因是一种抑癌基因，自Cramford等于1982年首次报道P53基因与人乳腺肿瘤有关以来，对P53基因与乳腺癌的关系进行了详细的研究。认为P53表达与乳腺癌的病理分级，术后早期死亡，淋巴结转移，复发及术后无瘤生存期及总生存期均有显著相关性 [2] 。本研究P53阳性表达率34.5%，比文献报道略低，可能与本组病人表达bcl-2高有关，二者表达呈负相关，且P53表达与腋淋巴结转移，远处转移及生存期显著相关(P<0.05)，与年龄、肿物大小、病理类型、临床分期无关(P>0.05)，与报道相符 [3] 。P53表达与c-myc表达呈正相关，二者同时表达阳性患者预后差，生存期均<5年。说明P53可做为判定预后的独立指标，如联合c-myc检查判断预后更可靠，但病例数不多，故还有待于进一步观察。
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bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，该基因通过抑制细胞凋亡，延长细胞生存而参与肿瘤发生，通过研究证实bcl-2参与了乳腺良性病变，乳腺癌发生发展调控 [4] 。bcl-2与乳腺癌的组织学分级呈负相关，与腋淋巴结转移、复发无关，与生存期相关性报道说法不一，有学者提出bcl-2蛋白的表达抑制细胞凋亡发生，表达率高者预后好，与预后呈正相关，也有认为bcl-2表达与预后无关 [2，3] 。本研究证实bcl-2在乳腺癌组织的表达率为72.4%，与报道相似 [4] 。而且bcl-2表达不但与年龄，肿物大小、病理类型、临床分期无关，且与腋淋巴结转移，远处转移均无关(P>0.05)，但证实与预后关系密切，生存>5年组bcl-2表达阳性82.1%，明显高于生存<5年组表达52.6%(P<0.05)。而且证实bcl-2与P53表达呈负相关，与c-myc表达也呈负相关，bcl-2表达阳性而P53、c-myc表达阴性的5例，生存均>5年预后佳。由此可见bcl-2蛋白的表达可做为评估乳腺癌生物学特性及估计患者预后的指标。
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c-myc基因是发现较早的原癌基因之一，编码为一个类丝氨酸或苏氨酸的磷酸化蛋白质，在细胞周期中c-mycmRNA及蛋白质水平基因不变。研究表明c-myc蛋白的 过表达与乳腺组织恶性转化有密切关系，而且参与调控细胞凋亡，参与乳腺癌的发生。c-myc的表达与肿瘤的等级、有丝分裂指数及转移预后的关系比较复杂。目前尚无详细报道 [5] 。本研究c-myc在乳腺癌的阳性表达为44.8%，略低于文献报道，可能与本组多数表达bcl-2有关，因为本研究证明bcl-2表达与c-myc表达呈负相关，而P53与c-myc表达呈正相关。且c-myc与腋淋巴结转移明显相关P<0.05，但与远处转移和预后以及年龄，肿物大小、病理类型、临床分期均无关P>0.05。可能与本组例数不多或实验误差有关。但也提示共同检测P53、bcl-2及c-myc表达能更准确估计乳腺癌的转移和预后情况。
总之，通过对乳腺癌三种凋亡相关基因的研究，进一步明确了其在乳腺癌发生发展及预后中的作用。有关凋亡基因与化疗疗效的相关性还有待进一步研究，以便应用于临床，正确指导临床治疗。
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参考文献
1 Haldar S，Negrini M，Monne M，et al.Down-regulation of bcl-2by P53in breast cancer cells.Cancer Res，1994，54:2095-2097.
2 杨红鹰，孙耘田，刘复生，等.bcl-2基因表达与乳腺组织学类型、分级及其预后的关系.中华肿瘤杂志，2000，22(6):490-492.
3 范宇，傅西林，王颖，等.细胞凋亡及其相关基因与乳腺癌预后关系的研究.中国肿瘤临床，2000，27(7):524-528.
4 卢义生，李峰，吴秋良，等.bcl-2、P53、Cathepsin D、PSA表达与乳腺癌预后的关系.癌症，2000，19(5):442-445.
5 高莉，詹洲，倪焕荣，等.乳腺癌中凋亡与细胞增殖及Rb、bcl-2、c-myc蛋白表达的关系.临床与实验病理学杂志，1999，15(2):95-98.
基金项目:黑龙江省“九·五”攻关课题(编号:G99L19-6-1)
作者单位:150040哈尔滨医科大学第三临床医学院
(收稿日期:2002-11-16)
(编辑小川), 百拇医药(李晓莉)
, 百拇医药
关键词 乳腺癌 细胞凋亡基因 预后
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0295-03
The expression of apoptosis correlative gene and clinical
significance in breast cancer cell
Li Xiaoli，Li li，Song ying
The Third Clinical Hospital of Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between apoptosis correlative gene P53，bcl-2and c-myc expression and the clinical biological action and prognosis of breast cancer，and to study the correlation among three gene expression products.Methods To detect the protein expression of P53，bcl-2and c-mycin breast canˉcer and to assay these clinical material.Results The positive rate of P53，bcl-2and c-myc expression were34.5%(20/58)，72.4%(42/58)and44.8%(26/58)respectively in58patients with breast cancer.The expression of P53was positive correlation with lymph node involvement and distant metastasis and negative relation to survival(P<0.05).Meanwhile there were no significant correlationbetween the P53expression and age，the size of tumor，pathoˉlogical type and clinical grade(P>0.05).The bcl-2expression was positive relation with axillary lymph nodes inˉvolvement(P<0.05)，and no relation to other clinical biologicalactions(P>0.05).A positive correlation existed in c-myc expression and axillary lymph nodes involvement(P<0.05).The bcl-2expression was negative relation to the expression of P53and c-myc，while there were positive correlation between P53and c-myc.Conclusion There was significant correlation between the expression of apoptosis correlative gene and axillary lymph node metastasis，disˉtant metastasis and prognosis in breast cancer.The associated detection of P53，bcl-2and c-myc can be a useful marker for accurately predicting prognosis.
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Key words breast cancer apoptosis gene prognosis
乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤，而且发病率有逐年上升趋势，但其病因还未完全阐明，对肿瘤相关基因的研究早已表明乳腺癌的发生发展与多种基因改变有关。尽管乳腺癌中频繁发生染色体及DNA的异常，但由细胞凋亡基因调控的死亡形式凋亡也是乳腺癌形成的一个重要机制，在乳腺癌的进展过程中产生DNA损伤的细胞可以通过凋亡而被除去 [1] 。本研究通过联合检测乳腺癌凋亡相关基因P53、bcl-2、c-myc蛋白的表达，探讨其与乳腺癌临床生物学行为及预后的关系及其三者之间表达的相关性。
1 材料和方法
1.1 临床资料 全组58例选自1995年1月～1996年7月我院收治的乳腺癌术后病人的存档蜡块，且临床病理资料完整;年龄30～72岁，中位年龄48岁，腋淋巴结转移的38例，无转移的20例;发生远处转移的21例，无远处转移的37例;生存>5年的39例，生存<5年的19例;其中单纯癌39例，浸润性导管癌7例，髓样癌7例，硬癌4例，粘液腺癌1例;术后分期Ⅰ期5例，Ⅱ期33例、Ⅲ期20例。
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1.2 试验方法 采用免疫组化S-P法。一抗为鼠抗人bcl-2、鼠抗人P53、鼠抗人c-myc即用型。常规石蜡切片厚4μm，石蜡切片脱蜡至水，3%H 2 O 2 室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，微波炉95℃，15min，自然冷却20min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10min，倾去血清，滴加一抗工作液4℃过夜，PBS冲洗5min×3次，滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育30min，PBS冲洗，5min×3次，自来水充分冲洗，复染，封片。DAB显色，均设阳性和阴性对照。
1.3 结果判定 阳性反应为细胞浆内或细胞核内出现棕黄色颗粒。bcl-2阳性物质位于胞浆，P53阳性物质位于细胞核，c-myc阳性物质位于胞核或少许胞浆，根据阳性物质着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级;无阳性细胞或阳性细胞<10%或背景同空白对照者为(-)，每张切片仅有<25%的细胞明显阳性为(+)，25%～50%细胞明显呈阳性为(++)，>50%细胞呈阳性为(+++)。
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1.4 统计学分析 采用X 2 检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc蛋白表达情况 本研究P53、bcl-2及c-myc阳性表达率分别为34.5%(20/58)，72.4%(42/58)和44.8%(26/58)。
2.2 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc蛋白表达相关性 本 研究bcl-2与P53蛋白表达之间差异有显著性(P<0.05)，呈负相关;P53与c-myc蛋白表达之间无差异性(P>0.05)，呈正相关;bcl-2与c-myc蛋白表达之间差异有显著性(P<0.05)，呈负相关。
2.3 乳腺癌组织P53、bcl-2、c-myc表达与临床生物学行为及预后的关系 本研究P53蛋白表达与腋淋巴结转移，远处转移呈正相关(P<0.05)，与预后呈负相关(P<0.05)，与年龄、肿物大小、病理分型、临床分期无关(P>0.05);bcl-2表达与预后呈正相关(P<0.05)，bcl-2表达越高，生存期越长。bcl-2与腋淋巴结转移、远处转移、年龄、肿物大小、病理类型、临床分期无关(P>0.05);c-myc与腋淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。而与其它临床生物学行为及预后均无关(P>0.05)。见表1。
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表1 P53、bcl-2、c-myc阳性表达与乳腺癌临床病理和预后的关系 例(略)
注: P<0.05
3 讨论
乳腺癌的发生和发展是一个复杂，多步骤的演进过程，细胞凋亡是恶性肿瘤普遍的自发现象。众多学者研究认为细胞凋亡不但参与了乳腺癌的发生和发展，而且对乳腺癌的治疗及预后均有显著影响。
P53基因是一种抑癌基因，自Cramford等于1982年首次报道P53基因与人乳腺肿瘤有关以来，对P53基因与乳腺癌的关系进行了详细的研究。认为P53表达与乳腺癌的病理分级，术后早期死亡，淋巴结转移，复发及术后无瘤生存期及总生存期均有显著相关性 [2] 。本研究P53阳性表达率34.5%，比文献报道略低，可能与本组病人表达bcl-2高有关，二者表达呈负相关，且P53表达与腋淋巴结转移，远处转移及生存期显著相关(P<0.05)，与年龄、肿物大小、病理类型、临床分期无关(P>0.05)，与报道相符 [3] 。P53表达与c-myc表达呈正相关，二者同时表达阳性患者预后差，生存期均<5年。说明P53可做为判定预后的独立指标，如联合c-myc检查判断预后更可靠，但病例数不多，故还有待于进一步观察。
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bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，该基因通过抑制细胞凋亡，延长细胞生存而参与肿瘤发生，通过研究证实bcl-2参与了乳腺良性病变，乳腺癌发生发展调控 [4] 。bcl-2与乳腺癌的组织学分级呈负相关，与腋淋巴结转移、复发无关，与生存期相关性报道说法不一，有学者提出bcl-2蛋白的表达抑制细胞凋亡发生，表达率高者预后好，与预后呈正相关，也有认为bcl-2表达与预后无关 [2，3] 。本研究证实bcl-2在乳腺癌组织的表达率为72.4%，与报道相似 [4] 。而且bcl-2表达不但与年龄，肿物大小、病理类型、临床分期无关，且与腋淋巴结转移，远处转移均无关(P>0.05)，但证实与预后关系密切，生存>5年组bcl-2表达阳性82.1%，明显高于生存<5年组表达52.6%(P<0.05)。而且证实bcl-2与P53表达呈负相关，与c-myc表达也呈负相关，bcl-2表达阳性而P53、c-myc表达阴性的5例，生存均>5年预后佳。由此可见bcl-2蛋白的表达可做为评估乳腺癌生物学特性及估计患者预后的指标。
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c-myc基因是发现较早的原癌基因之一，编码为一个类丝氨酸或苏氨酸的磷酸化蛋白质，在细胞周期中c-mycmRNA及蛋白质水平基因不变。研究表明c-myc蛋白的 过表达与乳腺组织恶性转化有密切关系，而且参与调控细胞凋亡，参与乳腺癌的发生。c-myc的表达与肿瘤的等级、有丝分裂指数及转移预后的关系比较复杂。目前尚无详细报道 [5] 。本研究c-myc在乳腺癌的阳性表达为44.8%，略低于文献报道，可能与本组多数表达bcl-2有关，因为本研究证明bcl-2表达与c-myc表达呈负相关，而P53与c-myc表达呈正相关。且c-myc与腋淋巴结转移明显相关P<0.05，但与远处转移和预后以及年龄，肿物大小、病理类型、临床分期均无关P>0.05。可能与本组例数不多或实验误差有关。但也提示共同检测P53、bcl-2及c-myc表达能更准确估计乳腺癌的转移和预后情况。
总之，通过对乳腺癌三种凋亡相关基因的研究，进一步明确了其在乳腺癌发生发展及预后中的作用。有关凋亡基因与化疗疗效的相关性还有待进一步研究，以便应用于临床，正确指导临床治疗。
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参考文献
1 Haldar S，Negrini M，Monne M，et al.Down-regulation of bcl-2by P53in breast cancer cells.Cancer Res，1994，54:2095-2097.
2 杨红鹰，孙耘田，刘复生，等.bcl-2基因表达与乳腺组织学类型、分级及其预后的关系.中华肿瘤杂志，2000，22(6):490-492.
3 范宇，傅西林，王颖，等.细胞凋亡及其相关基因与乳腺癌预后关系的研究.中国肿瘤临床，2000，27(7):524-528.
4 卢义生，李峰，吴秋良，等.bcl-2、P53、Cathepsin D、PSA表达与乳腺癌预后的关系.癌症，2000，19(5):442-445.
5 高莉，詹洲，倪焕荣，等.乳腺癌中凋亡与细胞增殖及Rb、bcl-2、c-myc蛋白表达的关系.临床与实验病理学杂志，1999，15(2):95-98.
基金项目:黑龙江省“九·五”攻关课题(编号:G99L19-6-1)
作者单位:150040哈尔滨医科大学第三临床医学院
(收稿日期:2002-11-16)
(编辑小川), 百拇医药(李晓莉)