异种肝移植转基因小鼠模型的建立
【摘要】 目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59cDNA的启动子，CMV作为报告基因GFP的启动子，构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明种白小鼠受精卵。结果 产生出86只F 0 代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性，进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠，可用于进一步异种移植研究。
关键词 异种移植 显微注射法 转基因小鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0577-03
An animal model for xenotransplantation-generating of
, http://www.100md.com
transgenic mice thatexpress hCD59cDNA
Li Zhiwei，Chang Weihua，Sun Wenbing，et al.
Department of Surgery，the302th Hospital of PLA，Beijing100039.
【Abstract】 Objective Using microinjection generate transgenic mice model for xenotransplantation study.Methods hCD59cDNA was used as a targeting gene under the control of OMT(Ovine metallothionein)promoter，Green fluorescent protein(GFP)as a marker for gene expression under the control of CMV(cytomegalovirus)promotˉer.CMV-GFP-OMT-CD59fragments were microinjected into fertilized mouse ova using microinjection.Results 86transgenic Kun Ming-white mice was obtained by
, 百拇医药
microinjection.PCR analysis showed12out of86mice(newˉborn mice)were transgenic.Southern blot analysis showed that1out of86were transgenic.Conclusion hCD59cDNA has integrated into mice genomic DNA.Transgenic mice have been obtained for xenotransplantation study.
Key words xenotransplantation microinjection transgenicmice
异种器官移植是解决供体缺乏的潜在途径之一，但可激活补体引起超急性排斥反应(HAR)的发生。人补体调节蛋白(CD59、DAF、MCP)等在生理情况下抑制补体的激活，并具有同源限制性 [1] 。转人CD59、DAF、MCP等基因动物器官可抑制人补体系统的激活，从而抑制异种移植排斥反应的发生。本实验旨在通过微注射法，产生了转人CD59蛋白基因小鼠，为进一步研究异种移植提供动物模型。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料 pLXSN-CD59质粒由北京大学第三医院普通外科满国彤博士提供，pUC19-OMT、pGEM-3zf、pGEM-7zf-B-GFP质粒、实验用昆明白小鼠和C57BL/6×昆明白小鼠杂交一代母鼠及所有设备均由中国农业大学生物技术国家重点实验室提供，其它试剂购自华美生物工程公司。
1.2 实验方法
1.2.1 哺乳动物表达质粒pGOC的构建
1.2.1.1 pGEM-3zf-OMT(pZO)质粒的构建 EcoR1、BamH1双酶切pUC19-OMT质粒，凝胶冻融法回收OMT片断;EcoR1、BamH1双酶切pGEM-3zf质粒，酚/氯仿抽提、乙醇沉淀、回收pGEM-3zf线性载体;在16℃，16h条件下pGEM-3zf线性载体和OMT片断连接;连接产物转化JM107菌、小提质粒、电泳及酶切鉴定所构建质粒是否连接 正确。
, 百拇医药
1.2.1.2 pGEM-3zf-OMT-CD59(pZOC)质粒的构建 分别用BamH1酶切p3zf-OMT和pLXSN-CD59质粒，制备CD59片断和p3zf-OMT线性载体，方法大致同前，构建pGEM-3zf-OMT-CD59(pZOC)质粒。所不同的是p3zf-OMT载体连接前需脱磷酸处理，以防载体自连。
1.2.1.3 pGEM-7zf-B-GFP-OMT-CD59(pGOC)质粒的构建 同样方法构建成含检测标志GFP的哺乳动物表达质粒pGEM-7zf-B-GFP-OMT-CD59，简称pGOC。
1.2.2 hCD59转基因鼠的产生
1.2.2.1 显微注射用目的片断的制备 用SphⅠ、KpnⅠ双酶切pGOC，酶切产物经乙醇沉淀后，0.8%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶冻融法回收GFP-OMT-CD59(简称GOC)片断，并用玻璃奶纯化，溶于用超纯水配制的转基因实验专用TE，使其浓度为2μg/ml，每管20μl，-20℃储存，解冻后可直接用于显微注射。
, http://www.100md.com
1.2.2.2 显微注射及F 0 代鼠的产生 每个受精卵雄原核注入DNA注射液约1p1，分三批共注600枚受精卵，分别移入18只小鼠输卵管，共产出86只F 0 代转基因小鼠。
1.2.3 转基因鼠的检测
1.2.3.1 鼠尾基因组DNA的PCR检测 PCR引物由上海生物工程公司合成。(1)鼠尾高分子量基因组DNA的提取 [2] ;(2)根据GFP序列设计引物进行PCR检测:引物1:5′ATC AAGTGTATC ATATGC CAA GTA CGC3′;引物2:3′CTG TTG GTG ATG GAC TCG TGG GC5′。利用这对引物合成的PCR产物长度为981bp。PCR反应条件:94℃1min，65℃1.5min，73℃1min。(3)根据OMT-CD59序列设计引物进行PCR检测:引物3:5′CTC TGA TAA GGA TGT CGC ACC3′;引物:4:5′GAC AAA GTG CCT CCG CGTT3′。利用这对引物合成的PCR产物长度应为640bp。PCR扩增的反应条件:94℃1min，68℃1.5min，73℃1min。
, http://www.100md.com
1.2.3.2 鼠尾基因组DNA的Southern blot检测 (1)鼠尾基因组DNA的酶切;(2)用EcoRⅠ大量酶切鼠尾基因组DNA，酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀，重溶于TE(pH8.0)，4℃储存备用。(3)探针制备、鉴定及鼠尾基因组DNA的尼龙膜转移与固定。按Amersham公司荧光标记及检测试剂盒说明进行。
2 结果
2.1 pGEM-7zf-GFP-OMT-CD59(pGOC)质粒鉴定 酶切鉴定:通过酶切证实OMT-CD59和pGFP连接正确。其中用SphⅠ/KpnⅠ双酶切pGOC得到的3.3kb CMV-GFP-OMT-CD59片段即为显微注射用目的片段。测序鉴定:用ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit测序试剂盒，对pZOC质粒反向测序，所测CD59序列与文献 [3] 公布CD59编码链序列完全互补。
, 百拇医药
2.2 F 0 代转基因小鼠产生 每个受精卵雄原核注入DNA注射液约1pl，分两批共注射600余枚受精卵，移入18只受体鼠，产出86只F 0 代转基因小鼠，胚胎成活率14.3%。
2.3 F 0 代转基因小鼠检测
2.3.1 鼠尾基因组DNA PCR检测结果 根据GFP序列设计引物对86只F 0 代转基因小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR扩增，13只阳性。根据OMT-CD59序列设计引物扩增，12只阳性。其中，用这两种引物扩增均阳性者12只。
(1)利用引物1、2扩增部分F 0 代转基因小鼠鼠尾基因组DNA的PCR产物电泳结果，见图1。
(2)利用引物3、4扩增部分F 0 代转基因小鼠鼠尾基因组DNA的PCR产物电泳结果，见图2。
, http://www.100md.com
图1 PCR产物电泳结果略
图2 PCR产物电泳结果略
2.3.2 鼠尾基因组DNA Southern blot检测结果 选取PCR 扩增阳性的鼠尾基因组DNA用EcoRⅠ酶切、抽提、浓缩、重溶后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，1mV/cm，5h以上。EcoRⅠ酶切鼠尾基因组DNA，应当能切下大约1.3kb(OMT-hCD59cDNA)片段，用hCD59cDNA标记的探针进行杂交时，结果只有5号鼠(♀)阳性。
图3 Southern blot检测结果略
3 讨论
近年来，利用转基因动物进行异种移植排斥反应的研究异常活跃。合理建立异种转基因动物模型有助于揭示异种移植排斥反应机理，并可为下一步进行临床异种器官移植打下扎实的基础。
, http://www.100md.com
3.1 合理构建哺乳动物表达质粒 合理构建哺乳动物表达质粒，必须选择有意义的目的基因、较强的启动子和方便、易于检测的外源基因表达的报告基因。
3.1.1 目的基因的选择 异种移植最大的障碍是异种抗原激活受体补体系统引起超急性排斥反应，导致移植失败。CD59作用于补体激活的最后环节，且具有种属限制性，转人CD59蛋白基因的猪、鼠血管内皮细胞表面可表达人CD59蛋白，可抑制人补体系统的激活及膜攻击复合物的形成，从而抑制异种移植排斥反应的发生。本实验选用0.5kb hCD59cDNA作为目的基因，探索它在异种移植转基因小鼠模型中的作用。
3.1.2 启动子的选择 外源基因表达的高低与启动子的选择有关。目前用于hCD59cDNA、hDAFcDNA、hMCP等转基因动物研究的启动子有多种 [4～7] 。所有这些启动子都在转基因动物中呈现出不同程度的后动效率，但还没有使外源基因稳定遗传、高效表达的转基因鼠系、猪系建立，缺乏进一步研究的动物模型。
, 百拇医药
MT(metallothionein，金属巯基蛋白)在哺乳动物肝脏中高效表达，目前MT基因调控序列已广泛用来指导异源基因在真核细胞及转基因动物中表达 [8] ，我们选择已经改造好的这种基因的调控序列-OMT(Ovine metallothionein，绵羊金属巯基蛋白基因)作为目的基因的启动子，用来产生hCD59cDNA转基因小鼠，以期建立能在哺乳动物肝脏中高效表达、稳定表达的转基因鼠系。
3.1.3 报告基因的选择 目的基因在转基因动物基因组中整合的拷贝数少，用一般的检测方法不敏感，而且方法复杂、成本高。以往人们用CAT(Chloramphenicol-acetyltransˉferase，氯霉素-乙酰基转移酶)、β-galactosidase(LacZ，β-半乳糖苷酶)、Firefly luciferase(萤火虫荧光素酶)等作为目的基因表达的报告基因。与CAT及LacZ相比，用GFP作为动物细胞转基因的报告基因具有突出的优点，如可在活细胞上分析、可重复观察、同一细胞可在多种情况下分析，不用固定及预处理样品，荧光的产生不需其它蛋白、底物、辅助因子参与等 [9] 。本实验中我们利用GFP与人类基因组同源性小的特点，用PCR法检测时特异性高，未出现非特异性条带，重复性好，具有一定的优越性。
, 百拇医药
3.2 选择合适的转基因方法 目前所用的转基因方法有:胚胎窄核显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞法、脂质体载体法、精子载体法、电脉冲法、染色体片段显微注射法、基因枪法等。每种方法各有优缺点，人们对此的评价也褒贬不一。比较而言，外源DNA胚胎原核显微注射法尽管效率低(1%～3%转基因子代)，但它是现在在家畜中实现基因转移最为成功的措施，其效果肯定、应用较多、技术成熟。本实验选用显微注射法生产出了转基因小鼠。
3.3 转基因动物的检测 转基因动物的检测是一项细致、艰苦的工作。要想获得阳性转基因鼠，必须对F 0 代鼠进行多方面，多水平的检测。本实验中我们选择PCR、Southern blot初步检测hCD59cDNA在小鼠基因组中的整合情况，方法简单可靠。
3.4 提高转基因动物基因表达水平 转基因动物的出现，为生命科学研究提供了有力的工具，但普遍存在的低水平表达问题严重阻碍转基因动物进入应用阶段。不同实验室针对不同目的采用了不同的方法，到现在还没有任何方法能普遍解决转基因动物基因整合及表达效率低的问题。在本实验用超纯水严格配制注射缓冲TE(10mMTris.CL，pH7.0，0.2mM EDTA)，稀释已纯化好的目的片断，使其浓度为2μg/ml，证实对胚胎的毒副作用小，胚胎成活率高;目的片断注射入受精卵雄原核;选用在转基因动物中广泛应用的较强的启动子-OMT等措施，初步检测目的基因在小鼠基因组中得到整合。下一步将检测hCD59cDNA的整合部位、 拷贝数;CD59蛋白的表达部位、表达量及CD59蛋白在抑制HAR中的作用，在此基础上进一步研究HAR(AVR)和慢性排斥反应的发生机制及防治措施。
, 百拇医药
(本实验在中国农业大学生物技术国家重点实验室完成)
参考文献
1 Brooimans RA，van Wieringen PAM.Relative roles of decay-acceleratˉing factor，membrane cofactor protein，and CD59in the protection of huˉman endothelial cells against complement-mediated lysis.Eur J Imˉmunol，1992，22:3135.
2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第二版.北京:中国协和医科大学出版社，1999，610.
3 Philbrick WM，Palfree RGE.The CD59antigen is a structural homologue of murine LY-6antigens but lacks interferon inducibility.Eur J Imˉmunol，1990，20:87-92.
, http://www.100md.com
4 Cowan PJ，Christine A.High-level endothelial expression of human CD59prolongs heart function in an ex vivo model of xenograft rejection.Transplantation，1998，65(6):826-831.
5 Takefman DM，Spear GT，Saifuddin M，et al.Human CD59incorporation into porcine endogenous retrovirus particles:implications for the use of transgenic pigs for xenotransplantation.J Virol，2002，76(4):1999-2002.
6 Diamond LE，Quinn CM，MartinMJ，et al.A human CD46transgenic pig model system for the study of discordant xenotransplantation.Transplanˉtation，2001，15，71(1):132-142.
, 百拇医药
7 Niemann H，Verhoeyen E，Wonigeit K，et al.Cytomegalovirus early proˉmoter
induced expression of hCD59in porcine organs provides protection against hyperacute rejection.Transplantation，2001，72(12):1898-1906.
8 任丽萍.真核细胞内可诱导基因表达系统研究进展.国外医学·分子生物学分册，1999，21(2):76.
9 Misteli T，Spector DL.Applications of the green fluosescent protein in cell biology and biotechnology.Nature Biotechnology，1997，15(10):961-963.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:39770764)
作者单位:1 100039北京解放军第302医院肝胆外科
2 100083北京大学第三医院普通外科
(收稿日期:2003-02-21)
(编辑 小川), 百拇医药(李志伟)
关键词 异种移植 显微注射法 转基因小鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)07-0577-03
An animal model for xenotransplantation-generating of
, http://www.100md.com
transgenic mice thatexpress hCD59cDNA
Li Zhiwei，Chang Weihua，Sun Wenbing，et al.
Department of Surgery，the302th Hospital of PLA，Beijing100039.
【Abstract】 Objective Using microinjection generate transgenic mice model for xenotransplantation study.Methods hCD59cDNA was used as a targeting gene under the control of OMT(Ovine metallothionein)promoter，Green fluorescent protein(GFP)as a marker for gene expression under the control of CMV(cytomegalovirus)promotˉer.CMV-GFP-OMT-CD59fragments were microinjected into fertilized mouse ova using microinjection.Results 86transgenic Kun Ming-white mice was obtained by
, 百拇医药
microinjection.PCR analysis showed12out of86mice(newˉborn mice)were transgenic.Southern blot analysis showed that1out of86were transgenic.Conclusion hCD59cDNA has integrated into mice genomic DNA.Transgenic mice have been obtained for xenotransplantation study.
Key words xenotransplantation microinjection transgenicmice
异种器官移植是解决供体缺乏的潜在途径之一，但可激活补体引起超急性排斥反应(HAR)的发生。人补体调节蛋白(CD59、DAF、MCP)等在生理情况下抑制补体的激活，并具有同源限制性 [1] 。转人CD59、DAF、MCP等基因动物器官可抑制人补体系统的激活，从而抑制异种移植排斥反应的发生。本实验旨在通过微注射法，产生了转人CD59蛋白基因小鼠，为进一步研究异种移植提供动物模型。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料 pLXSN-CD59质粒由北京大学第三医院普通外科满国彤博士提供，pUC19-OMT、pGEM-3zf、pGEM-7zf-B-GFP质粒、实验用昆明白小鼠和C57BL/6×昆明白小鼠杂交一代母鼠及所有设备均由中国农业大学生物技术国家重点实验室提供，其它试剂购自华美生物工程公司。
1.2 实验方法
1.2.1 哺乳动物表达质粒pGOC的构建
1.2.1.1 pGEM-3zf-OMT(pZO)质粒的构建 EcoR1、BamH1双酶切pUC19-OMT质粒，凝胶冻融法回收OMT片断;EcoR1、BamH1双酶切pGEM-3zf质粒，酚/氯仿抽提、乙醇沉淀、回收pGEM-3zf线性载体;在16℃，16h条件下pGEM-3zf线性载体和OMT片断连接;连接产物转化JM107菌、小提质粒、电泳及酶切鉴定所构建质粒是否连接 正确。
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1.2.1.2 pGEM-3zf-OMT-CD59(pZOC)质粒的构建 分别用BamH1酶切p3zf-OMT和pLXSN-CD59质粒，制备CD59片断和p3zf-OMT线性载体，方法大致同前，构建pGEM-3zf-OMT-CD59(pZOC)质粒。所不同的是p3zf-OMT载体连接前需脱磷酸处理，以防载体自连。
1.2.1.3 pGEM-7zf-B-GFP-OMT-CD59(pGOC)质粒的构建 同样方法构建成含检测标志GFP的哺乳动物表达质粒pGEM-7zf-B-GFP-OMT-CD59，简称pGOC。
1.2.2 hCD59转基因鼠的产生
1.2.2.1 显微注射用目的片断的制备 用SphⅠ、KpnⅠ双酶切pGOC，酶切产物经乙醇沉淀后，0.8%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶冻融法回收GFP-OMT-CD59(简称GOC)片断，并用玻璃奶纯化，溶于用超纯水配制的转基因实验专用TE，使其浓度为2μg/ml，每管20μl，-20℃储存，解冻后可直接用于显微注射。
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1.2.2.2 显微注射及F 0 代鼠的产生 每个受精卵雄原核注入DNA注射液约1p1，分三批共注600枚受精卵，分别移入18只小鼠输卵管，共产出86只F 0 代转基因小鼠。
1.2.3 转基因鼠的检测
1.2.3.1 鼠尾基因组DNA的PCR检测 PCR引物由上海生物工程公司合成。(1)鼠尾高分子量基因组DNA的提取 [2] ;(2)根据GFP序列设计引物进行PCR检测:引物1:5′ATC AAGTGTATC ATATGC CAA GTA CGC3′;引物2:3′CTG TTG GTG ATG GAC TCG TGG GC5′。利用这对引物合成的PCR产物长度为981bp。PCR反应条件:94℃1min，65℃1.5min，73℃1min。(3)根据OMT-CD59序列设计引物进行PCR检测:引物3:5′CTC TGA TAA GGA TGT CGC ACC3′;引物:4:5′GAC AAA GTG CCT CCG CGTT3′。利用这对引物合成的PCR产物长度应为640bp。PCR扩增的反应条件:94℃1min，68℃1.5min，73℃1min。
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1.2.3.2 鼠尾基因组DNA的Southern blot检测 (1)鼠尾基因组DNA的酶切;(2)用EcoRⅠ大量酶切鼠尾基因组DNA，酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀，重溶于TE(pH8.0)，4℃储存备用。(3)探针制备、鉴定及鼠尾基因组DNA的尼龙膜转移与固定。按Amersham公司荧光标记及检测试剂盒说明进行。
2 结果
2.1 pGEM-7zf-GFP-OMT-CD59(pGOC)质粒鉴定 酶切鉴定:通过酶切证实OMT-CD59和pGFP连接正确。其中用SphⅠ/KpnⅠ双酶切pGOC得到的3.3kb CMV-GFP-OMT-CD59片段即为显微注射用目的片段。测序鉴定:用ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit测序试剂盒，对pZOC质粒反向测序，所测CD59序列与文献 [3] 公布CD59编码链序列完全互补。
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2.2 F 0 代转基因小鼠产生 每个受精卵雄原核注入DNA注射液约1pl，分两批共注射600余枚受精卵，移入18只受体鼠，产出86只F 0 代转基因小鼠，胚胎成活率14.3%。
2.3 F 0 代转基因小鼠检测
2.3.1 鼠尾基因组DNA PCR检测结果 根据GFP序列设计引物对86只F 0 代转基因小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR扩增，13只阳性。根据OMT-CD59序列设计引物扩增，12只阳性。其中，用这两种引物扩增均阳性者12只。
(1)利用引物1、2扩增部分F 0 代转基因小鼠鼠尾基因组DNA的PCR产物电泳结果，见图1。
(2)利用引物3、4扩增部分F 0 代转基因小鼠鼠尾基因组DNA的PCR产物电泳结果，见图2。
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图1 PCR产物电泳结果略
图2 PCR产物电泳结果略
2.3.2 鼠尾基因组DNA Southern blot检测结果 选取PCR 扩增阳性的鼠尾基因组DNA用EcoRⅠ酶切、抽提、浓缩、重溶后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，1mV/cm，5h以上。EcoRⅠ酶切鼠尾基因组DNA，应当能切下大约1.3kb(OMT-hCD59cDNA)片段，用hCD59cDNA标记的探针进行杂交时，结果只有5号鼠(♀)阳性。
图3 Southern blot检测结果略
3 讨论
近年来，利用转基因动物进行异种移植排斥反应的研究异常活跃。合理建立异种转基因动物模型有助于揭示异种移植排斥反应机理，并可为下一步进行临床异种器官移植打下扎实的基础。
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3.1 合理构建哺乳动物表达质粒 合理构建哺乳动物表达质粒，必须选择有意义的目的基因、较强的启动子和方便、易于检测的外源基因表达的报告基因。
3.1.1 目的基因的选择 异种移植最大的障碍是异种抗原激活受体补体系统引起超急性排斥反应，导致移植失败。CD59作用于补体激活的最后环节，且具有种属限制性，转人CD59蛋白基因的猪、鼠血管内皮细胞表面可表达人CD59蛋白，可抑制人补体系统的激活及膜攻击复合物的形成，从而抑制异种移植排斥反应的发生。本实验选用0.5kb hCD59cDNA作为目的基因，探索它在异种移植转基因小鼠模型中的作用。
3.1.2 启动子的选择 外源基因表达的高低与启动子的选择有关。目前用于hCD59cDNA、hDAFcDNA、hMCP等转基因动物研究的启动子有多种 [4～7] 。所有这些启动子都在转基因动物中呈现出不同程度的后动效率，但还没有使外源基因稳定遗传、高效表达的转基因鼠系、猪系建立，缺乏进一步研究的动物模型。
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MT(metallothionein，金属巯基蛋白)在哺乳动物肝脏中高效表达，目前MT基因调控序列已广泛用来指导异源基因在真核细胞及转基因动物中表达 [8] ，我们选择已经改造好的这种基因的调控序列-OMT(Ovine metallothionein，绵羊金属巯基蛋白基因)作为目的基因的启动子，用来产生hCD59cDNA转基因小鼠，以期建立能在哺乳动物肝脏中高效表达、稳定表达的转基因鼠系。
3.1.3 报告基因的选择 目的基因在转基因动物基因组中整合的拷贝数少，用一般的检测方法不敏感，而且方法复杂、成本高。以往人们用CAT(Chloramphenicol-acetyltransˉferase，氯霉素-乙酰基转移酶)、β-galactosidase(LacZ，β-半乳糖苷酶)、Firefly luciferase(萤火虫荧光素酶)等作为目的基因表达的报告基因。与CAT及LacZ相比，用GFP作为动物细胞转基因的报告基因具有突出的优点，如可在活细胞上分析、可重复观察、同一细胞可在多种情况下分析，不用固定及预处理样品，荧光的产生不需其它蛋白、底物、辅助因子参与等 [9] 。本实验中我们利用GFP与人类基因组同源性小的特点，用PCR法检测时特异性高，未出现非特异性条带，重复性好，具有一定的优越性。
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3.2 选择合适的转基因方法 目前所用的转基因方法有:胚胎窄核显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞法、脂质体载体法、精子载体法、电脉冲法、染色体片段显微注射法、基因枪法等。每种方法各有优缺点，人们对此的评价也褒贬不一。比较而言，外源DNA胚胎原核显微注射法尽管效率低(1%～3%转基因子代)，但它是现在在家畜中实现基因转移最为成功的措施，其效果肯定、应用较多、技术成熟。本实验选用显微注射法生产出了转基因小鼠。
3.3 转基因动物的检测 转基因动物的检测是一项细致、艰苦的工作。要想获得阳性转基因鼠，必须对F 0 代鼠进行多方面，多水平的检测。本实验中我们选择PCR、Southern blot初步检测hCD59cDNA在小鼠基因组中的整合情况，方法简单可靠。
3.4 提高转基因动物基因表达水平 转基因动物的出现，为生命科学研究提供了有力的工具，但普遍存在的低水平表达问题严重阻碍转基因动物进入应用阶段。不同实验室针对不同目的采用了不同的方法，到现在还没有任何方法能普遍解决转基因动物基因整合及表达效率低的问题。在本实验用超纯水严格配制注射缓冲TE(10mMTris.CL，pH7.0，0.2mM EDTA)，稀释已纯化好的目的片断，使其浓度为2μg/ml，证实对胚胎的毒副作用小，胚胎成活率高;目的片断注射入受精卵雄原核;选用在转基因动物中广泛应用的较强的启动子-OMT等措施，初步检测目的基因在小鼠基因组中得到整合。下一步将检测hCD59cDNA的整合部位、 拷贝数;CD59蛋白的表达部位、表达量及CD59蛋白在抑制HAR中的作用，在此基础上进一步研究HAR(AVR)和慢性排斥反应的发生机制及防治措施。
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(本实验在中国农业大学生物技术国家重点实验室完成)
参考文献
1 Brooimans RA，van Wieringen PAM.Relative roles of decay-acceleratˉing factor，membrane cofactor protein，and CD59in the protection of huˉman endothelial cells against complement-mediated lysis.Eur J Imˉmunol，1992，22:3135.
2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第二版.北京:中国协和医科大学出版社，1999，610.
3 Philbrick WM，Palfree RGE.The CD59antigen is a structural homologue of murine LY-6antigens but lacks interferon inducibility.Eur J Imˉmunol，1990，20:87-92.
, http://www.100md.com
4 Cowan PJ，Christine A.High-level endothelial expression of human CD59prolongs heart function in an ex vivo model of xenograft rejection.Transplantation，1998，65(6):826-831.
5 Takefman DM，Spear GT，Saifuddin M，et al.Human CD59incorporation into porcine endogenous retrovirus particles:implications for the use of transgenic pigs for xenotransplantation.J Virol，2002，76(4):1999-2002.
6 Diamond LE，Quinn CM，MartinMJ，et al.A human CD46transgenic pig model system for the study of discordant xenotransplantation.Transplanˉtation，2001，15，71(1):132-142.
, 百拇医药
7 Niemann H，Verhoeyen E，Wonigeit K，et al.Cytomegalovirus early proˉmoter
induced expression of hCD59in porcine organs provides protection against hyperacute rejection.Transplantation，2001，72(12):1898-1906.
8 任丽萍.真核细胞内可诱导基因表达系统研究进展.国外医学·分子生物学分册，1999，21(2):76.
9 Misteli T，Spector DL.Applications of the green fluosescent protein in cell biology and biotechnology.Nature Biotechnology，1997，15(10):961-963.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:39770764)
作者单位:1 100039北京解放军第302医院肝胆外科
2 100083北京大学第三医院普通外科
(收稿日期:2003-02-21)
(编辑 小川), 百拇医药(李志伟)