超广谱β-内酰胺酶的研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)04-0343-02
β-内酰胺类药物是临床常用的治疗细菌感染的药物，不仅使用范围越来越广，而且用药剂量也越来越大。细菌基因在如此抗生素压力下的改造，导致了更高水平的耐药。产生β-内酰胺酶(BLA)是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制 [1] 。
根据Ambler的分子结构分类和Bush的功能分类方法，可将BLA分成1～4组(或A、B、C、D类)。临床上现有的BLA主要有四型:(1)超广谱β-内酰胺酶(extended-specˉtrumβ-lactamases，ESBL);(2)对BLA敏感性下降的BLA;(3)质粒介导的AmpcBLA;(4)水解碳青霉烯的BLA。其中最主要的是Ⅱ型中的ESBL [2] 。
1 定义
, 百拇医药
超广谱β-内酰胺酶(ESBL)又称氧亚氨β-内酰胺酶，是指细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素(oxyimino-β-lactams)，如头孢他啶、头孢噻肟，以及氨曲南等β-内酰胺酶，由于ESBL能水解青霉素类、头孢菌素及单环类抗生素，作用底物广泛而称之 [3] 。有人将ESBL还理解为以下几条:主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生;在体外试验中可使三代头孢和氨曲南的抑菌环缩小，但并不一定在耐药范围;加入克拉维酸可使其抑菌环扩大;临床对β-内酰胺类药物(包括青霉素类和头孢类)耐药，但对碳青霉烯类药物敏感;由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺基因(TEM-1，TEM-2，SHV-1)突变而来。
2 ESBL的分类
迄今为止在全球范围内至少已经发现149种 [4] 。TEM型ESBL有71种;SHV型ESBL有近28种;其他类型ESBL包括CTX-M、PER、IEB、GES、SPO、OXY等。根据各种酶的等电点及耐药基因的组成可把ESBL分三类:TEM系列，其等电点<7.0;SHV系列，其等电点>7.0;非TEM系列及SHV系列，其等电点不确定，所有ESBL编码的基因都在质粒上，DNA大小不等。大部分ESBL属于Ambler的A类，位于Bush等功能分类方案2be群，少数属于Ambler的D类，位于Bush的2d群。
, 百拇医药
3 耐药机制
细菌对抗生素的耐药机制可分为以下几点:细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位;灭活酶或钝化酶的产生，如β-内酰胺酶使抗生素的作用下降;与抗生素结合靶位(亲和力)的改变，使抗生素的作用下降;其他，如主动外排系统等。对于ESBL的近年来发现，其多种耐药性的产生与其质粒编码的ESBL有直接关系。随着第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类抗生素的广泛使用，产ESBL菌增加很快。世界上许多国家和地区都有ESBL菌流行的报道，国内也有许多地区产ESBL菌的报道 [5，6] 。因此国内外专家一致认为广谱头孢菌素类尤其是第三代头孢菌素的广泛使用产生的选择性压力是导致产生ESBL革兰阴性杆菌增加的主要原因。由于ESBL是质粒编码的，能通过接合、转化和转导形式，使耐药基因在菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌(可在同种菌间进行或不同菌种间进行)，且产生ESBL菌耐药谱广，表现为多重耐药。一旦流行暴发，极难控制。即使感染控制后，携带ESBL基因的耐药质粒仍可存在很长时间。成为再次暴发感染的危险因素。临床上使用抗生素应严格遵守药敏结果，防止高度敏感菌株在抗生素的选择下成高度耐药菌株，给临床治疗带来困难 [7] 。
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4 检测
由于ESBL种类多样性，赋予不同底物的耐药水平不尽相同，因而使一部分产ESBL菌株在常规体外敏感性试验时，表现出对氧米诺头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素部分或全部敏感或中介，造成漏检。通常ESBL的检测分很多方法:如单纸片法、双纸片协同法、圆环估计法、小片扩散法、琼脂稀释法抑制剂增强扩散法、E-test法、自动化仪器法(VITEK-AMS)。一般来说，ESBL检测主要分筛选法和确诊2个层次。美国国家临床试验室标准化委员会(NCCLS)在1999年药敏试验操作标准第9版信息补充规定中，对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌ESBL初筛和表型确证试验作了推荐 [8] 。经VITEK系统初筛，再经双纸片协同试验，E-test和纸片确诊试验。NCCLS规定从任何一种第三代头孢中查出ESBL，管体外试验敏感还是耐药，对头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南超广谱青霉素及结构相关的β-内酰胺类药物，都认为是耐药的。因此它们对此类感染的治疗效果不好，但可选碳青霉烯类、头孢菌素和酶抑制剂的β-内酰胺复合物等 [9] 。按照NCCLS1999年颁布的检测方法是测大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌中产ESBL的最好方法，包括纸片法和琼脂(肉汤)稀释法。根据头孢他啶和头孢噻肟加入克拉维酸后，抑菌环或最低抑菌浓度的改变判定ESBL。纸片法操作简单、经济，更适合作为实验室常规检测，但稀释法结果准确可靠。现有商品化用于浓度梯度法的E-test试剂条，结合了纸片法和稀释法的优点，但价格昂贵。
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另外，可用分子生物学技术检测和分析编码BLA的基因和突变位点，如聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCR)、PCR-限制性内切酶试验、PCR-点杂交、PCR-DNA探针或序列分析等。现代基因分型技术对了解某个地区或国家的哪一种BLA的基因型或亚型为主，进而制定相应的预防措施和治疗方案有很大帮助。还可用脉冲凝胶电泳(PFGE)、等电聚焦(IEF)等测定 [10] 。
5 治疗原则
ESBL的治疗首先选碳青酶烯类抗生素，如泰能。不管体外试验是否敏感，均应避免使用青霉素类、一～三代头孢菌素和氨曲南。其次为复合三代头孢菌素类，如舒普深，但剂量必须加大。还可用头酶素类，如头孢西丁、头孢替坦等，但治疗成功率最多只有70%。最后可用环丙沙星、阿米卡星等非β-内酰胺类抗生素。但阿米卡星和环丙沙星近年来耐药率上升很快，不建议使用，最好根据药敏结果进行选择。为了降低院内感染的发生率，应合理应用抗生素，要有严格的用药指征，根据细菌培养、药敏试验结果来选择或纠正原有抗生素治疗方案。能用窄谱抗生素控制的感染尽量不用广谱抗生素，以减少耐药菌株和二重感染的发生。
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6 小结
1983年，Knothe等首先在德国发现了对第三代头孢菌素(如头孢噻肟)耐药的肺炎克雷伯菌和沙雷氏菌。经分析发现这些细菌中能携带水解头孢菌素的新β-内酰胺酶，即ESBL。之后世界各地不断有新的ESBL被发现，对感染性疾病的治疗造成越来越大的威胁。1989年，在韩国发现了第一株质粒Ampc酶 [11] 。如今β-内酰胺酶面临的严峻挑战是ESBL [12] 。因此，如何准确、快速的分离出菌株及进行BLA的分型(包括亚型)，仍是临床实验室人员需要进一步研究的问题。
参考文献
1 邵海枫.Ampc酶的研究进展.临床检验杂志，2002，20(特刊):61-62.
2 倪语星.革兰阴性菌β-内酰胺酶的耐药性问题.中华检验医学杂志，2001，24(4):201-203.
, http://www.100md.com
3 廖晚珍.哪些菌需检测超广谱β-内酰胺酶，有何意义?江西医学检验，2001，19(1):50.
4 陈民钧，细菌对β-内酰胺药的耐药性及检测方法.中华检验医学杂志，2001，7，24(4):197-200.
5 王露霞，徐德兴，刘刃，等.革兰氏阴性菌超广谱酶诱导酶及药敏检测结果.中华医院感染学杂志，1998，8:52.
6 崔岩，沈定霞，周贵民.产超广谱β-内酰胺酶产酸克雷伯菌的医院感染流行分析.中华检验医学杂志，2002，25(5):277-279.
7 刘丁，周舟.Etest法检测大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌ESBL.中华医院感染学杂志，2000，10(2):94-96.
8 NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Ninthinformational supplement.NCCLS document M100-S9[S]，ncˉcls，Wayne，Pennsylvania，1999，19:36-75.
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9 林庆安，罗文侗，修清玉，等.上海部分地区肠杆菌科细菌超广谱β-内酰胺酶情况及药敏监测.中华结核和呼吸杂志，2000，23:420.
10 董红霞，徐英春，谢秀丽.肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的检测与药敏分析.医学检验进修杂志，2001，8(2):31-32.
11 Pitout JDD，Sanders CC，Sanders WEJR.Antimicrobial resistance with focus onβ-lactan resistance in gram negative bailli.Am Jmed，1997，103(7):51-59.
12 蒋燕春，王坚强.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒β-内酰胺酶的筛选.上海医学检验杂志，2001，16(1):10.
作者单位:150036黑龙江省中医研究院检验科
(编辑张 展), http://www.100md.com
β-内酰胺类药物是临床常用的治疗细菌感染的药物，不仅使用范围越来越广，而且用药剂量也越来越大。细菌基因在如此抗生素压力下的改造，导致了更高水平的耐药。产生β-内酰胺酶(BLA)是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制 [1] 。
根据Ambler的分子结构分类和Bush的功能分类方法，可将BLA分成1～4组(或A、B、C、D类)。临床上现有的BLA主要有四型:(1)超广谱β-内酰胺酶(extended-specˉtrumβ-lactamases，ESBL);(2)对BLA敏感性下降的BLA;(3)质粒介导的AmpcBLA;(4)水解碳青霉烯的BLA。其中最主要的是Ⅱ型中的ESBL [2] 。
1 定义
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超广谱β-内酰胺酶(ESBL)又称氧亚氨β-内酰胺酶，是指细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素(oxyimino-β-lactams)，如头孢他啶、头孢噻肟，以及氨曲南等β-内酰胺酶，由于ESBL能水解青霉素类、头孢菌素及单环类抗生素，作用底物广泛而称之 [3] 。有人将ESBL还理解为以下几条:主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生;在体外试验中可使三代头孢和氨曲南的抑菌环缩小，但并不一定在耐药范围;加入克拉维酸可使其抑菌环扩大;临床对β-内酰胺类药物(包括青霉素类和头孢类)耐药，但对碳青霉烯类药物敏感;由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺基因(TEM-1，TEM-2，SHV-1)突变而来。
2 ESBL的分类
迄今为止在全球范围内至少已经发现149种 [4] 。TEM型ESBL有71种;SHV型ESBL有近28种;其他类型ESBL包括CTX-M、PER、IEB、GES、SPO、OXY等。根据各种酶的等电点及耐药基因的组成可把ESBL分三类:TEM系列，其等电点<7.0;SHV系列，其等电点>7.0;非TEM系列及SHV系列，其等电点不确定，所有ESBL编码的基因都在质粒上，DNA大小不等。大部分ESBL属于Ambler的A类，位于Bush等功能分类方案2be群，少数属于Ambler的D类，位于Bush的2d群。
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3 耐药机制
细菌对抗生素的耐药机制可分为以下几点:细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位;灭活酶或钝化酶的产生，如β-内酰胺酶使抗生素的作用下降;与抗生素结合靶位(亲和力)的改变，使抗生素的作用下降;其他，如主动外排系统等。对于ESBL的近年来发现，其多种耐药性的产生与其质粒编码的ESBL有直接关系。随着第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类抗生素的广泛使用，产ESBL菌增加很快。世界上许多国家和地区都有ESBL菌流行的报道，国内也有许多地区产ESBL菌的报道 [5，6] 。因此国内外专家一致认为广谱头孢菌素类尤其是第三代头孢菌素的广泛使用产生的选择性压力是导致产生ESBL革兰阴性杆菌增加的主要原因。由于ESBL是质粒编码的，能通过接合、转化和转导形式，使耐药基因在菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌(可在同种菌间进行或不同菌种间进行)，且产生ESBL菌耐药谱广，表现为多重耐药。一旦流行暴发，极难控制。即使感染控制后，携带ESBL基因的耐药质粒仍可存在很长时间。成为再次暴发感染的危险因素。临床上使用抗生素应严格遵守药敏结果，防止高度敏感菌株在抗生素的选择下成高度耐药菌株，给临床治疗带来困难 [7] 。
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4 检测
由于ESBL种类多样性，赋予不同底物的耐药水平不尽相同，因而使一部分产ESBL菌株在常规体外敏感性试验时，表现出对氧米诺头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素部分或全部敏感或中介，造成漏检。通常ESBL的检测分很多方法:如单纸片法、双纸片协同法、圆环估计法、小片扩散法、琼脂稀释法抑制剂增强扩散法、E-test法、自动化仪器法(VITEK-AMS)。一般来说，ESBL检测主要分筛选法和确诊2个层次。美国国家临床试验室标准化委员会(NCCLS)在1999年药敏试验操作标准第9版信息补充规定中，对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌ESBL初筛和表型确证试验作了推荐 [8] 。经VITEK系统初筛，再经双纸片协同试验，E-test和纸片确诊试验。NCCLS规定从任何一种第三代头孢中查出ESBL，管体外试验敏感还是耐药，对头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南超广谱青霉素及结构相关的β-内酰胺类药物，都认为是耐药的。因此它们对此类感染的治疗效果不好，但可选碳青霉烯类、头孢菌素和酶抑制剂的β-内酰胺复合物等 [9] 。按照NCCLS1999年颁布的检测方法是测大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌中产ESBL的最好方法，包括纸片法和琼脂(肉汤)稀释法。根据头孢他啶和头孢噻肟加入克拉维酸后，抑菌环或最低抑菌浓度的改变判定ESBL。纸片法操作简单、经济，更适合作为实验室常规检测，但稀释法结果准确可靠。现有商品化用于浓度梯度法的E-test试剂条，结合了纸片法和稀释法的优点，但价格昂贵。
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另外，可用分子生物学技术检测和分析编码BLA的基因和突变位点，如聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCR)、PCR-限制性内切酶试验、PCR-点杂交、PCR-DNA探针或序列分析等。现代基因分型技术对了解某个地区或国家的哪一种BLA的基因型或亚型为主，进而制定相应的预防措施和治疗方案有很大帮助。还可用脉冲凝胶电泳(PFGE)、等电聚焦(IEF)等测定 [10] 。
5 治疗原则
ESBL的治疗首先选碳青酶烯类抗生素，如泰能。不管体外试验是否敏感，均应避免使用青霉素类、一～三代头孢菌素和氨曲南。其次为复合三代头孢菌素类，如舒普深，但剂量必须加大。还可用头酶素类，如头孢西丁、头孢替坦等，但治疗成功率最多只有70%。最后可用环丙沙星、阿米卡星等非β-内酰胺类抗生素。但阿米卡星和环丙沙星近年来耐药率上升很快，不建议使用，最好根据药敏结果进行选择。为了降低院内感染的发生率，应合理应用抗生素，要有严格的用药指征，根据细菌培养、药敏试验结果来选择或纠正原有抗生素治疗方案。能用窄谱抗生素控制的感染尽量不用广谱抗生素，以减少耐药菌株和二重感染的发生。
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6 小结
1983年，Knothe等首先在德国发现了对第三代头孢菌素(如头孢噻肟)耐药的肺炎克雷伯菌和沙雷氏菌。经分析发现这些细菌中能携带水解头孢菌素的新β-内酰胺酶，即ESBL。之后世界各地不断有新的ESBL被发现，对感染性疾病的治疗造成越来越大的威胁。1989年，在韩国发现了第一株质粒Ampc酶 [11] 。如今β-内酰胺酶面临的严峻挑战是ESBL [12] 。因此，如何准确、快速的分离出菌株及进行BLA的分型(包括亚型)，仍是临床实验室人员需要进一步研究的问题。
参考文献
1 邵海枫.Ampc酶的研究进展.临床检验杂志，2002，20(特刊):61-62.
2 倪语星.革兰阴性菌β-内酰胺酶的耐药性问题.中华检验医学杂志，2001，24(4):201-203.
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3 廖晚珍.哪些菌需检测超广谱β-内酰胺酶，有何意义?江西医学检验，2001，19(1):50.
4 陈民钧，细菌对β-内酰胺药的耐药性及检测方法.中华检验医学杂志，2001，7，24(4):197-200.
5 王露霞，徐德兴，刘刃，等.革兰氏阴性菌超广谱酶诱导酶及药敏检测结果.中华医院感染学杂志，1998，8:52.
6 崔岩，沈定霞，周贵民.产超广谱β-内酰胺酶产酸克雷伯菌的医院感染流行分析.中华检验医学杂志，2002，25(5):277-279.
7 刘丁，周舟.Etest法检测大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌ESBL.中华医院感染学杂志，2000，10(2):94-96.
8 NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Ninthinformational supplement.NCCLS document M100-S9[S]，ncˉcls，Wayne，Pennsylvania，1999，19:36-75.
, http://www.100md.com
9 林庆安，罗文侗，修清玉，等.上海部分地区肠杆菌科细菌超广谱β-内酰胺酶情况及药敏监测.中华结核和呼吸杂志，2000，23:420.
10 董红霞，徐英春，谢秀丽.肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶的检测与药敏分析.医学检验进修杂志，2001，8(2):31-32.
11 Pitout JDD，Sanders CC，Sanders WEJR.Antimicrobial resistance with focus onβ-lactan resistance in gram negative bailli.Am Jmed，1997，103(7):51-59.
12 蒋燕春，王坚强.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒β-内酰胺酶的筛选.上海医学检验杂志，2001，16(1):10.
作者单位:150036黑龙江省中医研究院检验科
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