支气管哮喘患者外周血Th1、Th2细胞凋亡及Fas与活化Caspase-3表达研究
【摘要】 目的 研究Fas及Caspase-3在Th1/Th2细胞凋亡中的作用。方法 分离哮喘缓解期患者外周血CD4 + 细胞，检测其活化Caspase-3及不同表型细胞Fas表达。结果 体外培养正常对照与支气管哮喘患者外周血CD4 + 细胞24h Th1细胞Fas表达分别为(20.69±3.69)%与(25.17±4.61)%(P<0.05);Th2细胞Fas表达分别为(18.42±2.99)%与(15.30±2.16)%(P<0.05);两组活化Caspase-3分别为(11.18±3.09)mg/ml与(10.76±2.60)ng/ml(P>0.05);Th1细胞凋亡率、Th2细胞凋亡率与Fas表达的相关系数分别为0.763(P=0.000)与0.691(P=0.001)。结论 哮喘Th1/Th2细胞凋亡主要由Fas、Caspase介导。
关键词 哮喘 T辅助细胞 含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶 Fas
, 百拇医药
【文献标识码】 A【文章编号】 1606-8106(2004)03-0227-03
细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，参与调节机体炎症反应。Fas介导的细胞凋亡是肿瘤细胞、淋巴细胞等凋亡的重要途径，而Caspase-3是多种凋亡途径的最终作用点 [1，2] 。本研究拟通过检测CD4 + 的Fas表达与活化Caspase-3水平，并分析其与不同亚群CD4 + 细胞凋亡的相关性，以了解细胞凋亡及其机制在支气管哮喘发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验对象 所有支气管哮喘均应符合中华医学会呼吸病分会哮喘诊断标准。共选择支气管哮喘患者10例，均为支气管哮喘稳定期患者。同时选择10例健康人作对照。所有受试者试验前1个月内未使用免疫调节剂及细胞毒药物。
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1.2 仪器 流式细胞仪为法国Coulter公司产品;酶标仪芬兰Lab System产品。
1.3 试剂 FITC标记抗CCR3抗体、PE标记CCR5抗体均购自R&D公司(美国);Cy5标记Fas抗体购自Bioscience(美基金项目:四川省中医管理局、成都市卫生局资助课题(编号:2000-69)国);抗CD8单克隆抗体购自公司;Caspase-3ELISA试剂盒购自晶美公司;淋巴细胞分离液购自上海生化公司。
1.4 方法 (1)淋巴细胞分离。所有受试对象均于早晨空腹无菌取肘静脉血40ml，枸橼酸钠(130mmol/L，pH7.4)抗凝，5%FCS/Hank’s液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面，室温离心1000g，20min，收集上层淋巴细胞。以培养基调成2ml细胞悬液。(2)T淋巴细胞分离。将细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞。将未贴壁细胞加入已用Hank’s处理的长100mm，直径3mm的尼龙毛柱中，60min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞。1000rpm离心10min，调成细胞悬液。(3)CD4 + 细胞分离。在无菌平皿中加入抗CD8单抗6μg，以pH9.5的PBS6ml稀释后旋转平皿使溶液均匀覆盖平皿底部。室温水平放置40min后，洗4次，用含1%的FCS的PBS液封闭，制成抗体包被平皿。将T细胞悬液(5×10 6 /5ml)加入平皿内，置4℃水平放置70min，吸取未粘附细胞。(4)上述分离细胞以含5%小牛血清的PRMI1640培养基重悬，按5×10 5 /ml接种于6孔培养板。37℃，5%CO 2 培养24h。(5)收集培养细胞，PBS洗一次，每10 5 细胞加入1μl人IgG，室温孵育15min。(6)加入25μl FITC标记抗CCR3抗体、25μl PE标记CCR5及5μl Cy3标记Fas抗体，4℃孵育30min。(7)PBS洗细胞一次。重悬于400μl PBS中，流式细胞仪检测CCR5与Fas双阳性，CCR3与Fas双阳性细胞。(8)Caspase-3测定。用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定活化Caspase-3。每孔加入2μl生物素标记的ZVKD-fmk inhibitor，室温孵育1h后将细胞吸入EP管，1000g离心5min，PBS洗一次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置4℃冰箱保存。按试剂盒说明进行ELISA检测活化Caspase-3。
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2 结果
2.1 不同亚群T淋巴细胞凋亡 支气管哮喘患者分离CD4 + 细胞培养24h后，CCR5阳性细胞凋亡比例明显高于正常对照，而CCR3阳性细胞凋亡则低于正常对照(见表1)。
表1 不同亚群CD4 + 细胞凋亡
注: 与对照组相比，P<0.05，0.01
2.2 不同亚群T淋巴细胞Fas表达 支气管哮喘患者分离CD4 + 细胞培养24h后，CCR5阳性细胞Fas表达明显高于正常对照，而CCR3阳性细胞则低于正常对照(见表2)。
表2 不同亚群T淋巴细胞Fas表达
注: 与对照组相比，P<0.05，0.01
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2.3 CD4 + 细胞Caspase-3表达 见表3。
支气管哮喘与正常对照体外培养CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3水平无差异(P>0.05)。
表3CD4 + 细胞Caspase-3表达
2.4 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与活化Capase-3水平及Fas表达的相关性 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与其Fas表达相关，而与活化Capase-3水平相关系数较低，但凋亡细胞总和与活化Capase-3水平呈显著正相关(见表4)。
3 讨论
细胞凋亡是细胞程序性死亡过程，是一个主动的，高度有序的，多基因调控，多种酶参与的过程 [3] 。近年的研究已发现了很多与细胞凋亡相关的信号转导途径，对其中的激酶、磷酸酯酶、转录因子等有了进一步的了解。同时发现许多细胞可通过膜受体与特异性配体(如细胞因子)，将存活或凋亡信号从胞外传递到胞内，在通过特特定的信号传导途径调控细胞凋亡的进程。研究较多的胞外配体是FasL、TNF、APO-3L及APO-2L诱导的凋亡途径。细胞膜上有一类被称为死亡受体的膜受体，包括Fas、TNFR1、DR3、DR4等。胞外配体与这些受体结合后，发生低聚合作用，其膜内侧部分与特异性接头蛋白结合，激活特定的蛋白酶，导致凋亡发生。近年亦发现线粒体可不依赖膜受体介导而激活的凋亡途径 [4] 。
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表4 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与活化Capase-3水平及Fas表达的相关性
在凋亡程序启动和执行过程中，有一类蛋白酶家族—含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶(Cystein-contain，asˉpartat-specific proteases，Caspase)发挥至关重要作用。这些蛋白酶在正常状态以无活性的酶原(proenzymes)形式存在，凋亡信号刺激其特异性天冬氨酸残基处被剪切而激活 [5] 。上游的Caspase可顺序激活下游Caspase，形成Caspase级联反应，将凋亡信号传递至凋亡底物。细胞外和细胞内凋亡信号均均需通过Capase-3激活Caspase-6、7，进而活化多种酶直接导致DNA降解、细胞皱缩等特征性的凋亡表现。NF-κB诱导的一系列细胞存活基因，如IAP等，亦通过调控Capase-3而抑制细胞凋亡 [6] 。因此，Capase-3是细胞凋亡信号传导过程中的中心环节，检测活化的Capase-3水平可反映细胞凋亡过程 [7] 。我们的研究发现，支气管哮喘患者CD4 + 体外培养24h后其CCR5阳性细胞Fas表达增加，而CCR3阳性细胞表达 降低。提示Fas介导的凋亡途径参与了支气管哮喘Th1/Th2失衡。相关分析显示，细胞Fas表达水平与CCR5及CCR3阳性细胞凋亡呈显著正相关。进一步证实Fas介导细胞凋亡是外周血Th1/Th2失衡的重要原因。测定体外培养CD4 + 细胞活化Capase-3发现，支气管哮喘组与正常对照组并无差异。直线相关分析亦显示其与CCR5、CCR3阳性细胞凋亡的相关性并不强。这主要与支气管哮喘组CCR5和CCR3阳性细胞凋亡的异质性所致。对CCR3与CCR5阳性细胞凋亡总和与Capase-3相关分析显示两者具有较高的相关性，提示CD4 + 细胞凋亡过程中Capase-3活化增加。
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尽管Th2型细胞因子对支气管哮喘患者T淋巴细胞及CD4 + 细胞表达Fas具有抑制作用 [8] ，但尚不清楚对Th1和Th2细胞是否具有同样作用。我们的研究表明，CCR3阳性细胞凋亡较对照组减少，其Fas表达亦降低，可能与支气管哮喘中Th2细胞因子特异性抑制Th2细胞Fas表达有关。综上所述，Fas介导的细胞凋亡参与了支气管哮喘时Th1/Th2失衡。但Th1/Th2细胞Fas表达差异的原因值得进一步研究。
参考文献
1 Condorelli G，Roncarati R，Ross J Jr，et al.Heart-targeted overexpresˉsion of caspase3in mice increases infarct size and depresses cardiac function.ProcNatl Acad Sci U S A，2001，98:9977-9982.
, http://www.100md.com
2 Gupta S，Chiplunkar S，Gupta A，et al.Increased spontaneous，tumor necrosis factor receptor-and CD95(Fas)-mediated apoptosis in cord blood T-ccll subscts from Turncr’s syndromc.Gcncs Immun，2003，4:239-243.
3 Katoch B，Sebastian S，Sahdev S，et al.Programmed cell death and its clinical implications.Indian J Exp Biol，2002，40:513-524.
4 Chen GG，Chak EC，Chun YS，et al.Glioma apoptosis induced by macrophages involves both death receptor-dependent and independent pathways.J Lab Clin Med，2003，141:190-199.
, http://www.100md.com
5 Cid C，Alvarez-Cermeno JC，Regidor I，et al.Caspase inhibitors protect against neuronal apoptosis induced by cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients.J Neuroimmunol，2003，136:119-124.
6 Fujikawa K，Shiraki K，Sugimoto K，et al.Reduced expression of ICE/caspasel and CPP32/caspase3in human hepatocellular carcinoma.Antiˉcancer Res，2000，20:1927-1932.
7 Gougeon ML，Kroemer G.Charming to death:caspase-dependent or-independent?Cell Death Differ，2003，10:390-392.
, 百拇医药
8 Spinozzi F，Agea E，Fizzotti M，et al.Role of T-helper type2cytokines in down-modulation of fas mRNA and receptor on the surface of actiˉvated CD4 + T cells:molecular basis for the persistence of the allergic immune response.FASEB J，1998，12:1747-1753.
作者单位:610041四川大学华西医院
610016四川省成都市第一人民医院
610041四川大学华西口腔医院
(编辑李 木), http://www.100md.com
关键词 哮喘 T辅助细胞 含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶 Fas
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【文献标识码】 A【文章编号】 1606-8106(2004)03-0227-03
细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，参与调节机体炎症反应。Fas介导的细胞凋亡是肿瘤细胞、淋巴细胞等凋亡的重要途径，而Caspase-3是多种凋亡途径的最终作用点 [1，2] 。本研究拟通过检测CD4 + 的Fas表达与活化Caspase-3水平，并分析其与不同亚群CD4 + 细胞凋亡的相关性，以了解细胞凋亡及其机制在支气管哮喘发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验对象 所有支气管哮喘均应符合中华医学会呼吸病分会哮喘诊断标准。共选择支气管哮喘患者10例，均为支气管哮喘稳定期患者。同时选择10例健康人作对照。所有受试者试验前1个月内未使用免疫调节剂及细胞毒药物。
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1.2 仪器 流式细胞仪为法国Coulter公司产品;酶标仪芬兰Lab System产品。
1.3 试剂 FITC标记抗CCR3抗体、PE标记CCR5抗体均购自R&D公司(美国);Cy5标记Fas抗体购自Bioscience(美基金项目:四川省中医管理局、成都市卫生局资助课题(编号:2000-69)国);抗CD8单克隆抗体购自公司;Caspase-3ELISA试剂盒购自晶美公司;淋巴细胞分离液购自上海生化公司。
1.4 方法 (1)淋巴细胞分离。所有受试对象均于早晨空腹无菌取肘静脉血40ml，枸橼酸钠(130mmol/L，pH7.4)抗凝，5%FCS/Hank’s液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面，室温离心1000g，20min，收集上层淋巴细胞。以培养基调成2ml细胞悬液。(2)T淋巴细胞分离。将细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞。将未贴壁细胞加入已用Hank’s处理的长100mm，直径3mm的尼龙毛柱中，60min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞。1000rpm离心10min，调成细胞悬液。(3)CD4 + 细胞分离。在无菌平皿中加入抗CD8单抗6μg，以pH9.5的PBS6ml稀释后旋转平皿使溶液均匀覆盖平皿底部。室温水平放置40min后，洗4次，用含1%的FCS的PBS液封闭，制成抗体包被平皿。将T细胞悬液(5×10 6 /5ml)加入平皿内，置4℃水平放置70min，吸取未粘附细胞。(4)上述分离细胞以含5%小牛血清的PRMI1640培养基重悬，按5×10 5 /ml接种于6孔培养板。37℃，5%CO 2 培养24h。(5)收集培养细胞，PBS洗一次，每10 5 细胞加入1μl人IgG，室温孵育15min。(6)加入25μl FITC标记抗CCR3抗体、25μl PE标记CCR5及5μl Cy3标记Fas抗体，4℃孵育30min。(7)PBS洗细胞一次。重悬于400μl PBS中，流式细胞仪检测CCR5与Fas双阳性，CCR3与Fas双阳性细胞。(8)Caspase-3测定。用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定活化Caspase-3。每孔加入2μl生物素标记的ZVKD-fmk inhibitor，室温孵育1h后将细胞吸入EP管，1000g离心5min，PBS洗一次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置4℃冰箱保存。按试剂盒说明进行ELISA检测活化Caspase-3。
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2 结果
2.1 不同亚群T淋巴细胞凋亡 支气管哮喘患者分离CD4 + 细胞培养24h后，CCR5阳性细胞凋亡比例明显高于正常对照，而CCR3阳性细胞凋亡则低于正常对照(见表1)。
表1 不同亚群CD4 + 细胞凋亡
注: 与对照组相比，P<0.05，0.01
2.2 不同亚群T淋巴细胞Fas表达 支气管哮喘患者分离CD4 + 细胞培养24h后，CCR5阳性细胞Fas表达明显高于正常对照，而CCR3阳性细胞则低于正常对照(见表2)。
表2 不同亚群T淋巴细胞Fas表达
注: 与对照组相比，P<0.05，0.01
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2.3 CD4 + 细胞Caspase-3表达 见表3。
支气管哮喘与正常对照体外培养CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3水平无差异(P>0.05)。
表3CD4 + 细胞Caspase-3表达
2.4 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与活化Capase-3水平及Fas表达的相关性 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与其Fas表达相关，而与活化Capase-3水平相关系数较低，但凋亡细胞总和与活化Capase-3水平呈显著正相关(见表4)。
3 讨论
细胞凋亡是细胞程序性死亡过程，是一个主动的，高度有序的，多基因调控，多种酶参与的过程 [3] 。近年的研究已发现了很多与细胞凋亡相关的信号转导途径，对其中的激酶、磷酸酯酶、转录因子等有了进一步的了解。同时发现许多细胞可通过膜受体与特异性配体(如细胞因子)，将存活或凋亡信号从胞外传递到胞内，在通过特特定的信号传导途径调控细胞凋亡的进程。研究较多的胞外配体是FasL、TNF、APO-3L及APO-2L诱导的凋亡途径。细胞膜上有一类被称为死亡受体的膜受体，包括Fas、TNFR1、DR3、DR4等。胞外配体与这些受体结合后，发生低聚合作用，其膜内侧部分与特异性接头蛋白结合，激活特定的蛋白酶，导致凋亡发生。近年亦发现线粒体可不依赖膜受体介导而激活的凋亡途径 [4] 。
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表4 CCR5与CCR3阳性细胞凋亡与活化Capase-3水平及Fas表达的相关性
在凋亡程序启动和执行过程中，有一类蛋白酶家族—含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶(Cystein-contain，asˉpartat-specific proteases，Caspase)发挥至关重要作用。这些蛋白酶在正常状态以无活性的酶原(proenzymes)形式存在，凋亡信号刺激其特异性天冬氨酸残基处被剪切而激活 [5] 。上游的Caspase可顺序激活下游Caspase，形成Caspase级联反应，将凋亡信号传递至凋亡底物。细胞外和细胞内凋亡信号均均需通过Capase-3激活Caspase-6、7，进而活化多种酶直接导致DNA降解、细胞皱缩等特征性的凋亡表现。NF-κB诱导的一系列细胞存活基因，如IAP等，亦通过调控Capase-3而抑制细胞凋亡 [6] 。因此，Capase-3是细胞凋亡信号传导过程中的中心环节，检测活化的Capase-3水平可反映细胞凋亡过程 [7] 。我们的研究发现，支气管哮喘患者CD4 + 体外培养24h后其CCR5阳性细胞Fas表达增加，而CCR3阳性细胞表达 降低。提示Fas介导的凋亡途径参与了支气管哮喘Th1/Th2失衡。相关分析显示，细胞Fas表达水平与CCR5及CCR3阳性细胞凋亡呈显著正相关。进一步证实Fas介导细胞凋亡是外周血Th1/Th2失衡的重要原因。测定体外培养CD4 + 细胞活化Capase-3发现，支气管哮喘组与正常对照组并无差异。直线相关分析亦显示其与CCR5、CCR3阳性细胞凋亡的相关性并不强。这主要与支气管哮喘组CCR5和CCR3阳性细胞凋亡的异质性所致。对CCR3与CCR5阳性细胞凋亡总和与Capase-3相关分析显示两者具有较高的相关性，提示CD4 + 细胞凋亡过程中Capase-3活化增加。
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尽管Th2型细胞因子对支气管哮喘患者T淋巴细胞及CD4 + 细胞表达Fas具有抑制作用 [8] ，但尚不清楚对Th1和Th2细胞是否具有同样作用。我们的研究表明，CCR3阳性细胞凋亡较对照组减少，其Fas表达亦降低，可能与支气管哮喘中Th2细胞因子特异性抑制Th2细胞Fas表达有关。综上所述，Fas介导的细胞凋亡参与了支气管哮喘时Th1/Th2失衡。但Th1/Th2细胞Fas表达差异的原因值得进一步研究。
参考文献
1 Condorelli G，Roncarati R，Ross J Jr，et al.Heart-targeted overexpresˉsion of caspase3in mice increases infarct size and depresses cardiac function.ProcNatl Acad Sci U S A，2001，98:9977-9982.
, http://www.100md.com
2 Gupta S，Chiplunkar S，Gupta A，et al.Increased spontaneous，tumor necrosis factor receptor-and CD95(Fas)-mediated apoptosis in cord blood T-ccll subscts from Turncr’s syndromc.Gcncs Immun，2003，4:239-243.
3 Katoch B，Sebastian S，Sahdev S，et al.Programmed cell death and its clinical implications.Indian J Exp Biol，2002，40:513-524.
4 Chen GG，Chak EC，Chun YS，et al.Glioma apoptosis induced by macrophages involves both death receptor-dependent and independent pathways.J Lab Clin Med，2003，141:190-199.
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5 Cid C，Alvarez-Cermeno JC，Regidor I，et al.Caspase inhibitors protect against neuronal apoptosis induced by cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients.J Neuroimmunol，2003，136:119-124.
6 Fujikawa K，Shiraki K，Sugimoto K，et al.Reduced expression of ICE/caspasel and CPP32/caspase3in human hepatocellular carcinoma.Antiˉcancer Res，2000，20:1927-1932.
7 Gougeon ML，Kroemer G.Charming to death:caspase-dependent or-independent?Cell Death Differ，2003，10:390-392.
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8 Spinozzi F，Agea E，Fizzotti M，et al.Role of T-helper type2cytokines in down-modulation of fas mRNA and receptor on the surface of actiˉvated CD4 + T cells:molecular basis for the persistence of the allergic immune response.FASEB J，1998，12:1747-1753.
作者单位:610041四川大学华西医院
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