ELISA夹心法定量检测rhGM-CSFIL-3融合蛋白方法的建立
【摘要】 目的 建立一种快速灵敏的定量测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白的方法。方法采用ELISA双抗体夹心法。结果 当rhGM-CSF/IL-3浓度在0.49～6.25ng/ml时呈线性关系，回归系数为r=0.995，建立的方法与各种血液组份和细胞因子无交叉反应，灵敏度49pg/ml，批内变异系数为5.96%，批间变异系数为7.08%。结论 该法检测速度快，重复性好，灵敏度高，特异性好。
关键词 rhGM-CSF/IL-3 融合蛋白 ELISA法
【文献标识码】 B 【文章编号】 1726-7587(2004)04-0547-02
本文对大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3(rhGM-CSF/IL-3)融合蛋白进行了中试纯化研究，进一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3体外能促造血祖细胞的生长发育，具有较好的开发应用前景。为了进一步研究其在体内的药效以及药代动力，必须对其进行定量测定。但目前尚无一简便有效的检测方法对rhGM-CSF/IL-3进行定量检测。基于rhGM-CSF/IL-3的免疫特性，本文建立了ELISA夹心法 [1] 定量检测rhGM-CSF/IL-3。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 鼠抗剂rhGM-CSF单克隆抗体(rhGM-CSF McAb)为自制;鼠抗rhGM-CSF多克隆抗体(rhGM-CSF PcAb)、兔抗rhIL-3多克隆抗体(rhIL-3PcAb)、酶标记羊抗兔IgG(购自Amcrsham公司);LPS、HRP、BSA(购自SIGˉMA公司);G-CSF、rhGM-CSF、EPO(购自Amgen公司);IL-2(购自Cetus公司);rhGM-CSF、IFN-α(购自Schering-Plough公司)。
1.2 ELISA夹心法测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白 用250mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS pH8.0)按适当比例稀释的rhGM-CSF McAb100μl包被微孔板，20℃16h，将A液(0.1%Tween-20的PBS)洗板5次，加200μl1%BSA-PBS溶液20℃封闭6h，A液洗板，甩干，-20℃保存备用。使用时解冻，每孔加样本100μl，4℃16h;A液洗板5次，加B液(0.1%Tweem-20，0.1%BSA in50mmol/L PBS，pH7.3)适当稀释的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次，加100μl HRP-羊抗兔IgG，37℃1h;A液洗板，加100μl OPD显色液(1mg/ml邻苯二胺，0.012%H 2 O 2 ，100mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0)，30min后用2mol/L H 2 SO 4 100μl终止反应，用酶标仪检测OD 490nm 值。
1.3 矩阵法选择包被第一抗体与桥联抗体量 用棋盘测定法确定各抗体最适浓度，选择rhGM-CSFMcAb浓度为1、5、10、15μg/ml，rhIL-3PcAb稀释度为1:10、1:100、1:1000稀释时，分别测定OD 490nm 值，以其OD 490nm 值稳定时，低浓度值为最佳浓度。
2 结果
2.1 测定条件的优化 用棋盘测定法测定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3，表明hGM-CSFMcAb的最佳浓度为10μg/ml，rhIL-3PcAb的最佳稀释度为1:100。100μl可以产生足够陡的剂量反应曲线，且本底低，是最佳反应体积。测定最低检测浓度至少需要显色30min。
2.2 特异性和灵敏度 用建立的ELISA法测定血清主要组份和细胞因子的干扰性，表明LPS(100μg/ml)、BSA(10μg/ml)、G-CSF(2μg/ml)、EPO(0.1μg/ml)、IL-2(0.08μg/ml)、rhGM-CSF(2μg/ml)、IFN-α(0.5μg/ml)、rhIL-3(2μg/ml)与正常人血清rhGM-CSF/IL-3无交叉反应性。见表1。
典型rhGM-CSF/IL-3标准剂量反应曲线表明该法最低检测浓度为50pg/ml。
2.3 回收率 将已知量标准rhGM-CSF/IL-3用已经建立的方法测定，回收率为92%～108%。
2.4 批内变异与批间变异 测定了低、中、高三个浓度的批内变异，变异系数为5.96%(0.654±0.039，n=10);批间变异测定在不同日期进行，批间变异系数为7.08%(0.678±0.048，n=5)，低浓度样品变异系数稍大。
3 讨论
GM-CSF与IL-3是功能性相关的糖蛋白家族成员，对红细胞系统，嗜中性、嗜碱性、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和单核/巨噬细胞系在刺激细胞生存、增殖与分化上有交叠(overlap)作用 [2] 。GM-CSF与IL-3在体外对鼠和恒河猴刺激造血有协同作用，二者已开始用于临床，但同时使用副作用较大，美国已通过基因工程在酵母中表达出一种称为PIXY321(GM-CSF/IL-3)的融合蛋白进行临床试验，已证实应用前景可观 [3] 。rhGM-CSF/IL-3是由短链接头(Iˉinker)连接接含GM-CSF与IL-3活性成分的融合蛋白。目前，对其活性研究仍以GM-CSF敏感细胞株TF-1来进行MTT法测定，但该法操作繁琐、条件要求高、试验周期长。为能对rhGM-CSF/IL-3进行药代动力学研究，根据ELLSA方法的特异性是由从血清中免疫吸附rhGM-CSF/IL-3的rhGM-CSF McAb决定，灵敏度由多价兔血清、多价 检测试剂和酶介导反应决定的原则，建立了ELISA夹心法。
以矩阵法进行最佳抗体量选择，rhGM-CSF McAb浓度100μg/ml作为包被第一抗体最佳浓度，1:100稀释作为rhGM-CSF PcAB最佳稀释度，用最佳抗体量确定的ELISA夹心法检测5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3，结果比较理想，阴性对照背景干扰少，结果见表1。当rhGM-CSF/IL-3浓度在0.49～6.25ng/ml时呈线性关系，回归系数为r=0.995，灵敏度为49pg/ml，说明该法灵敏高。重复性测定表明在每一板内样品的批内变异系数为5.96%;在不同日期进行测定的样品的批间变异系数为7.08%，体现了该法重复性好。
以LPS(100μg/ml)等作为潜在干扰物加入血清中进行测定，这些物质对1ng/ml的rhGM-CSF/IL-3水平测定背景干扰没有显著改变，显示了本法的特异性非常高。综上所述，本试验建立的ELISA夹心法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好，可对样品浓度低至50pg/ml进行定量测定，几乎不受其它生物活性物质及血清成分的干扰，是对rhGM-CSF/IL-3进行有效检测的好方法。
表1 ELISA夹心法检测血清中rhGM-CSF/IL-3融合蛋白略
参考文献
1 周少雄.双抗体夹心ELISA测定血清促红细胞生成素.临床检验杂志，1998，16(4):211-213.
2 戴盛明.大肠杆菌中表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3(rhGM-CSF/IL-3)融合蛋白的纯化.药物 生物技术，1998，5(2):70-73.
3 Broxm eyer B，benninger L，Cooper s，et al.Effects of in vivo treatment with PIXY321(GM-CSF/IL-3fusion protein)on prolifeation kinetics of bone marrow and blood myeloid progenitor cells in patient with sarcoˉma.Exp Hematol，1995，23:335.
作者单位:524037广东省湛江中心人民医院
(收稿日期:2004-02-23)
(编辑 海涛)