肿瘤热休克蛋白70—抗原肽复合物抗移植瘤的实验研究
【摘要】 目的 研究肺腺癌有效的治疗方法。方法 采用提纯小鼠肺腺癌LA795细胞热休克蛋白抗原肽复合物，对小鼠背部LA795肺腺癌移植瘤进行治疗。结果 免疫组和免疫+化疗组移植瘤重量明显减少，小鼠生存期明显延长。结论 热休克蛋白70抗原肽复合物有强大的抗肿瘤免疫原性，保护实验动物免受肿瘤细胞的攻击，抑制肿瘤细胞的生长，延长动物生存期。
关键词 热休克蛋白70 抗原肽复合物 移植瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)04-0388-03
Experimental study on anti-transplant tumor with heat shock
protein-70 antigen peptide complex
, 百拇医药 Zhang Shubo，Dong Ju，Ma Liren，et al.
Department of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital of China North Coal Medical College，Tangshan063000.
【Abstract】 Objective To explore an effective recipe for pulmonary adenocarcinoma.Methods The mice which LA795were injected subcutaneously in the right back，were treated by purification of HAC70from mouse pulˉmonary adenocarcinoma LA795.Results In the immunized group and the combined immune and chemical therapy group，the mouse survival periods were prolonged.Conclusion HAC70is of powerful antineoplastic immunogenicity，which protects experimental animals from attacks of tumor cells，inhibits the growth of tumor cells，prolongs animal surˉvival periods.
, 百拇医药
Key words heat shock protein70 antigen peptide complex transplant tumor
为了寻找一种治疗肺腺癌有效的方法，我科自2000年9月～2003年10月对小鼠LA795肺腺癌细胞热休克蛋白70抗原肽复合物(HAC70)进行提纯扩增，并对种植LA795肺腺癌细胞的T739雌性近交系小鼠进行包括HAC免疫治疗在内的各种治疗的动物实验，取得良好的治疗效果。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 小鼠肺腺癌细胞标LA795;中国协和医科大学基础研究院提供。T739雌性纯系小鼠(6～10周龄);中国医学科学院肿瘤研究所动物研究中心提供。RPMI-1640，AmohotericinB，GIBCO公司产品。Hepes，BSA，SDS.Acr.Bis.Coomassie brilliant blue R-250。PMSF，ADP-Agarose，ADP二钠盐，2-Me，TEMED，抗小鼠HSP70单抗;SIGMA公司产品。DeAe-52;WHATMAN公司产品。SephdexG-200;PARMACIˉA公司产品。羊抗鼠IgG:ROCKLAND公司产品。Aprotinin;BOEHRINGER公司产品。DTT:PROMEGA公司产品。MTT，USB公司分装。低分子量标准蛋白质MARRER;天津TBD生物技术发育中心提供，中国科学院上海生化所产品。胎牛血清:天津生物技术发育中心提供。小鼠HSP70单克隆抗体:SANTA CRUZ BLOTOCHNOLOGY公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 小鼠肺腺癌LA795细胞HAC70的提纯 体外培养LA795细胞，获得约16g湿重细胞。经低渗、反复冻融、机器震荡后破碎细胞。通过ADP-AGAROSE亲和层析，DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白浓缩而获得蛋白质。再经SDS-PAGE电泳，WESTERN-BLOTS进行定性及纯度检验，证明为HSP70，通过CBB法测定蛋白浓度。
1.2.2 肿瘤模型的制备及实验分组 在96只雌性T739近交系小鼠右背皮下注射2.5×10 6个/ml LA795小鼠肺腺癌细胞悬液0.2ml以制备肿瘤动物模型，随机分为预防组、早期治疗组、晚期治疗组三大组，每大组32只小鼠。每大组再分为对照组、免疫组、化疗组、免疫+化疗组四个亚组，分别标为A、B、C、D组。预防组、早期治疗组、晚期治疗组分别在接种肿瘤细胞前14天、7天、接种肿瘤细胞当天及接种后7天、接种肿瘤细胞后10天、17天给予治疗。其中A组小鼠皮下注射PBS溶液0.2ml/只;B组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只，即100μg/只;C组小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg;D组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只，腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg，观察各组治疗后有无毒副反应;各亚组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞两周后)，随机在各亚组中抽取4只小鼠处死，解剖称肿瘤重量，余观察小鼠的生存期，将所得数据经SAS软件处理，成组设计单因素方差分析q检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 动物模型的检验结果 在10只纯系T739雌性8周龄小鼠右肩胛下接种LA795细胞，各注射为2.5×10 5 个/ml，0.2ml/只。接种10天后，接种部位可触及0.4～0.6cm肿物，肿块呈圆形或卵圆形，界限清楚、活动。肿物生长迅速。小鼠在接种肿瘤后25天开始死亡，第33天全部死亡，说明此模型适合应用于检验抗肿瘤药物。
2.2 各组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞2周后)荷瘤重量的变化 如表1。
表1 荷瘤重量 (略)
从表中可以看出，在预防组，B、D两组未见肿瘤形成，A、C组均形成肿瘤;用成组设计单因素方差分析及q检验，各处理组之间的差异有非常显著性(F=105.71，P<0.0001);其中A、C组之间无显著性，B、D组无差异，差异来源于A、C与B、D组之间(P<0.05)。在早期治疗组，A组肿瘤重量明显重于B、C、D组，用成组设计单因素方差分析及q检验，各处理组之间差异有非常显著性(F=217.48，P<0.0001)，其中A与B、C、D组之间，B与C、D组之间差异 有显著性(P<0.01)，C、D组之间差异无显著性(P>0.01)。在晚期治疗组，A组的荷瘤重量明显重于B、C、D组，用成组设计单因素方差分析及q检验各处理组之间差异有显著性(F=154.99，P<0.0001)，其中A与B、C、D组之间差异有显著性，但B、C、D组之间差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.3 各组的生存期 如表2。
表2 荷瘤小鼠的生存期略
从表中可以看出，在预防治疗组，B、D两亚组各有一只小鼠于接种肿瘤78天、82天死于肿瘤外，这两组其余小鼠均获长期生存(>90天)，且均无肿瘤生长。A、C两组均有肿瘤生长，且生存期明显短于B、D两组。A、C组之间和B、D组之间差异无显著性，差异来源于A、C组与B、D组之间。
在早期治疗组，B、D组生存期较A、C组明显延长，其中B与A、C组和D与A、C组之间差异有显著性。A、C组 之间差异有显著性，B、D组之间差异无显著性。
在晚期治疗组，B、D两组生存期较A、C组长，其中B与A、C组之间，D与A、C组之间差异有显著性，A、C组之间和B、D组之间差异无显著性。
由此可见，以自身肿瘤提取物HAC70作为肿瘤疫苗，可引起个体持久的抗肿瘤效应，既可预防肿瘤的攻击，又对机体已存在的肿瘤有明显的抑制作用，并延长动物的生存期。
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3 讨论
当今全球范围内，恶性肿瘤的发病率和死亡率仍居高不下，肺癌位居其首。尤其是肺腺癌，因其血行转移很早，且对放化疗不敏感，给其治疗带来极大的困难，成为目前国内外医学界急待攻克的难题。而肿瘤的生物治疗作为一门新兴技术，得到人们越来越多的关注。近来研究发现，很多肿瘤细胞表面都有抗原表达 [1，2] 。从肿瘤细胞提取的热休克蛋白多肽复合物(HAC)，含有多种肿瘤的相关抗原，不需分离肿瘤特异性抗原 [3～5] ，肿瘤抗原活化的多个CTL克隆，其杀瘤效应和特异性明显高于其他效应细胞 [6] 。以HAC免疫机体的生物疗法无疑给肺癌，尤其是肺腺癌的治疗开辟了光明前景。
试验通过体外小鼠腺癌LA795细胞培养，获得湿重16g细胞。联合应用ADP-Agarose亲和层析，DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白质浓缩等方法，获得了纯度较高的HAC70(纯度大于95%)。将获得蛋白质应用到LA795-T739小鼠肺腺癌肿瘤模型，研究HAC70的抗瘤效果。结果显示:HAC70不仅能预防LA795肿瘤的攻击，而且能抑制和杀灭肿瘤细胞，提高动物的生存期，且未见毒副作用。
, 百拇医药
根据现在对肿瘤疫苗的定义，肿瘤疫苗与预防传染病传统的疫苗不同，其不但具有预防作用，同时还具有治疗作用。其实质为特异性主动免疫，是利用肿瘤细胞(或肿瘤抗原)或/和修饰过的肿瘤细胞物质，诱导机体的特异性抗肿瘤活性细胞，以阻止肿瘤细胞的生长、扩散和复发。其预防和治疗作用的强弱从根本上取决于疫苗抗原性的大小和特异性程度 [7～9] 。
用HAC免疫可以诱导出对肿瘤或其他细胞的免疫反应，这说明HAC可以用于制备抗肿瘤、抗感染性疾病的疫苗 [10，11] 。以HAC疫苗免疫动物(如B、D两组)，证实其预防、抑制肿瘤生长及转移作用。模仿晚期癌症病人负荷肿瘤情况，晚期治疗组小鼠的治疗结果可能会近似于晚期肿瘤病人的治疗情况。实验结果显示疫苗处理组(免疫组)小鼠的荷瘤重量明显轻于其他各组，生存期明显延长，说明HAC70成为晚期肿瘤病人(尤其是肺腺癌)综合治疗中一个有希望的用药选择。
由此可见，以自身肿瘤提取物HAC70作为肿瘤疫苗， 可引起持久的抗肿瘤效应，可预防肿瘤的攻击。对机体已存在的肿瘤，有明显抑制肿瘤生长作用，延长荷瘤动物的生存期，且HSP本身是良好的佐剂，不需要附加任何人工佐剂，免去了佐剂带来的副作用;因为它不含任何外来的DNA或病毒载体，不产生遗传性改变，无害无毒诸副作用，HAC70作为肿瘤疫苗，将为肿瘤，尤其是肺腺癌的有效治疗开辟美好的前景。
, 百拇医药
参考文献
1 BonayM，Solerp，Riquefm，et al.Expression of heat shock protein in huˉman lung and lung cancer.Am J Respir Cell Mol Biol，1994，10:453-461.
2 张永幸，贺涵员，郭堂春，等.职业性肺癌中HSP70，HSP27与P 53 表达的相关性研究.中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(2):78-80.
3 Srivastava PR.Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reficulum:role in immune response to cancer and in antigen presentaˉtion.Adv Cancer Res，1993，62:153-177.
, 百拇医药
4 郭建成.热休克蛋白-肽复合物肿瘤疫苗.国外医学·肿瘤分册，1996，10:267-270.
5 Srivastava PR.Heat shock protein in immune response to cancer:the fourth path paradigm.Experientia，1994，50:1054-1060.
6 Coulie PG.Human tumor antigens recognized by T Cell:new perspecˉtives foranti-cancer vaccines?Mol Med Today，1997，3:261-268.
7 赵得容，潘志贵，邹玉臣.肿瘤的生物疗法概况.国外医学·免疫学分册，1996，19(2):91-93.
8 Ostrand RS，Pulaski BA，Clements VK，et al.Cell-based vaccines for the stimulatation of immunity to metastatic cancers.Immunol Rev，1999，170:101-114.
, 百拇医药
9 Baskar S.Gene-modified tumor cells as cellular vaccine.Immunol Imˉmunother，1996，43(3):165-173.
10 Malusecka E，Zborek A，Krzyzowska Grucas，et al.Expression of heat shock proteins HSP70and HSP27in primary non-small cell lung carˉcinomas.An immunohistochemical study.Anticancer Res，2001，21(2A):295-298.
11 Heike M，Noll B，Meyer Zum Buschenfelde KH，et al.Heat shock proˉtein-peptide complexes for use in Vaccines.J Ieukos Biol，1996，60(2):153-158.
作者单位:1 063000河北唐山华北煤炭医学院附属医院胸外科
2 063000河北唐山华北煤炭医学院微生物教研室
(收稿日期:2004-02-25)
(编辑 海涛), http://www.100md.com
关键词 热休克蛋白70 抗原肽复合物 移植瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)04-0388-03
Experimental study on anti-transplant tumor with heat shock
protein-70 antigen peptide complex
, 百拇医药 Zhang Shubo，Dong Ju，Ma Liren，et al.
Department of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital of China North Coal Medical College，Tangshan063000.
【Abstract】 Objective To explore an effective recipe for pulmonary adenocarcinoma.Methods The mice which LA795were injected subcutaneously in the right back，were treated by purification of HAC70from mouse pulˉmonary adenocarcinoma LA795.Results In the immunized group and the combined immune and chemical therapy group，the mouse survival periods were prolonged.Conclusion HAC70is of powerful antineoplastic immunogenicity，which protects experimental animals from attacks of tumor cells，inhibits the growth of tumor cells，prolongs animal surˉvival periods.
, 百拇医药
Key words heat shock protein70 antigen peptide complex transplant tumor
为了寻找一种治疗肺腺癌有效的方法，我科自2000年9月～2003年10月对小鼠LA795肺腺癌细胞热休克蛋白70抗原肽复合物(HAC70)进行提纯扩增，并对种植LA795肺腺癌细胞的T739雌性近交系小鼠进行包括HAC免疫治疗在内的各种治疗的动物实验，取得良好的治疗效果。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 小鼠肺腺癌细胞标LA795;中国协和医科大学基础研究院提供。T739雌性纯系小鼠(6～10周龄);中国医学科学院肿瘤研究所动物研究中心提供。RPMI-1640，AmohotericinB，GIBCO公司产品。Hepes，BSA，SDS.Acr.Bis.Coomassie brilliant blue R-250。PMSF，ADP-Agarose，ADP二钠盐，2-Me，TEMED，抗小鼠HSP70单抗;SIGMA公司产品。DeAe-52;WHATMAN公司产品。SephdexG-200;PARMACIˉA公司产品。羊抗鼠IgG:ROCKLAND公司产品。Aprotinin;BOEHRINGER公司产品。DTT:PROMEGA公司产品。MTT，USB公司分装。低分子量标准蛋白质MARRER;天津TBD生物技术发育中心提供，中国科学院上海生化所产品。胎牛血清:天津生物技术发育中心提供。小鼠HSP70单克隆抗体:SANTA CRUZ BLOTOCHNOLOGY公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 小鼠肺腺癌LA795细胞HAC70的提纯 体外培养LA795细胞，获得约16g湿重细胞。经低渗、反复冻融、机器震荡后破碎细胞。通过ADP-AGAROSE亲和层析，DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白浓缩而获得蛋白质。再经SDS-PAGE电泳，WESTERN-BLOTS进行定性及纯度检验，证明为HSP70，通过CBB法测定蛋白浓度。
1.2.2 肿瘤模型的制备及实验分组 在96只雌性T739近交系小鼠右背皮下注射2.5×10 6个/ml LA795小鼠肺腺癌细胞悬液0.2ml以制备肿瘤动物模型，随机分为预防组、早期治疗组、晚期治疗组三大组，每大组32只小鼠。每大组再分为对照组、免疫组、化疗组、免疫+化疗组四个亚组，分别标为A、B、C、D组。预防组、早期治疗组、晚期治疗组分别在接种肿瘤细胞前14天、7天、接种肿瘤细胞当天及接种后7天、接种肿瘤细胞后10天、17天给予治疗。其中A组小鼠皮下注射PBS溶液0.2ml/只;B组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只，即100μg/只;C组小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg;D组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只，腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg，观察各组治疗后有无毒副反应;各亚组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞两周后)，随机在各亚组中抽取4只小鼠处死，解剖称肿瘤重量，余观察小鼠的生存期，将所得数据经SAS软件处理，成组设计单因素方差分析q检验。
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2 结果
2.1 动物模型的检验结果 在10只纯系T739雌性8周龄小鼠右肩胛下接种LA795细胞，各注射为2.5×10 5 个/ml，0.2ml/只。接种10天后，接种部位可触及0.4～0.6cm肿物，肿块呈圆形或卵圆形，界限清楚、活动。肿物生长迅速。小鼠在接种肿瘤后25天开始死亡，第33天全部死亡，说明此模型适合应用于检验抗肿瘤药物。
2.2 各组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞2周后)荷瘤重量的变化 如表1。
表1 荷瘤重量 (略)
从表中可以看出，在预防组，B、D两组未见肿瘤形成，A、C组均形成肿瘤;用成组设计单因素方差分析及q检验，各处理组之间的差异有非常显著性(F=105.71，P<0.0001);其中A、C组之间无显著性，B、D组无差异，差异来源于A、C与B、D组之间(P<0.05)。在早期治疗组，A组肿瘤重量明显重于B、C、D组，用成组设计单因素方差分析及q检验，各处理组之间差异有非常显著性(F=217.48，P<0.0001)，其中A与B、C、D组之间，B与C、D组之间差异 有显著性(P<0.01)，C、D组之间差异无显著性(P>0.01)。在晚期治疗组，A组的荷瘤重量明显重于B、C、D组，用成组设计单因素方差分析及q检验各处理组之间差异有显著性(F=154.99，P<0.0001)，其中A与B、C、D组之间差异有显著性，但B、C、D组之间差异无显著性(P>0.05)。
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2.3 各组的生存期 如表2。
表2 荷瘤小鼠的生存期略
从表中可以看出，在预防治疗组，B、D两亚组各有一只小鼠于接种肿瘤78天、82天死于肿瘤外，这两组其余小鼠均获长期生存(>90天)，且均无肿瘤生长。A、C两组均有肿瘤生长，且生存期明显短于B、D两组。A、C组之间和B、D组之间差异无显著性，差异来源于A、C组与B、D组之间。
在早期治疗组，B、D组生存期较A、C组明显延长，其中B与A、C组和D与A、C组之间差异有显著性。A、C组 之间差异有显著性，B、D组之间差异无显著性。
在晚期治疗组，B、D两组生存期较A、C组长，其中B与A、C组之间，D与A、C组之间差异有显著性，A、C组之间和B、D组之间差异无显著性。
由此可见，以自身肿瘤提取物HAC70作为肿瘤疫苗，可引起个体持久的抗肿瘤效应，既可预防肿瘤的攻击，又对机体已存在的肿瘤有明显的抑制作用，并延长动物的生存期。
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3 讨论
当今全球范围内，恶性肿瘤的发病率和死亡率仍居高不下，肺癌位居其首。尤其是肺腺癌，因其血行转移很早，且对放化疗不敏感，给其治疗带来极大的困难，成为目前国内外医学界急待攻克的难题。而肿瘤的生物治疗作为一门新兴技术，得到人们越来越多的关注。近来研究发现，很多肿瘤细胞表面都有抗原表达 [1，2] 。从肿瘤细胞提取的热休克蛋白多肽复合物(HAC)，含有多种肿瘤的相关抗原，不需分离肿瘤特异性抗原 [3～5] ，肿瘤抗原活化的多个CTL克隆，其杀瘤效应和特异性明显高于其他效应细胞 [6] 。以HAC免疫机体的生物疗法无疑给肺癌，尤其是肺腺癌的治疗开辟了光明前景。
试验通过体外小鼠腺癌LA795细胞培养，获得湿重16g细胞。联合应用ADP-Agarose亲和层析，DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白质浓缩等方法，获得了纯度较高的HAC70(纯度大于95%)。将获得蛋白质应用到LA795-T739小鼠肺腺癌肿瘤模型，研究HAC70的抗瘤效果。结果显示:HAC70不仅能预防LA795肿瘤的攻击，而且能抑制和杀灭肿瘤细胞，提高动物的生存期，且未见毒副作用。
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根据现在对肿瘤疫苗的定义，肿瘤疫苗与预防传染病传统的疫苗不同，其不但具有预防作用，同时还具有治疗作用。其实质为特异性主动免疫，是利用肿瘤细胞(或肿瘤抗原)或/和修饰过的肿瘤细胞物质，诱导机体的特异性抗肿瘤活性细胞，以阻止肿瘤细胞的生长、扩散和复发。其预防和治疗作用的强弱从根本上取决于疫苗抗原性的大小和特异性程度 [7～9] 。
用HAC免疫可以诱导出对肿瘤或其他细胞的免疫反应，这说明HAC可以用于制备抗肿瘤、抗感染性疾病的疫苗 [10，11] 。以HAC疫苗免疫动物(如B、D两组)，证实其预防、抑制肿瘤生长及转移作用。模仿晚期癌症病人负荷肿瘤情况，晚期治疗组小鼠的治疗结果可能会近似于晚期肿瘤病人的治疗情况。实验结果显示疫苗处理组(免疫组)小鼠的荷瘤重量明显轻于其他各组，生存期明显延长，说明HAC70成为晚期肿瘤病人(尤其是肺腺癌)综合治疗中一个有希望的用药选择。
由此可见，以自身肿瘤提取物HAC70作为肿瘤疫苗， 可引起持久的抗肿瘤效应，可预防肿瘤的攻击。对机体已存在的肿瘤，有明显抑制肿瘤生长作用，延长荷瘤动物的生存期，且HSP本身是良好的佐剂，不需要附加任何人工佐剂，免去了佐剂带来的副作用;因为它不含任何外来的DNA或病毒载体，不产生遗传性改变，无害无毒诸副作用，HAC70作为肿瘤疫苗，将为肿瘤，尤其是肺腺癌的有效治疗开辟美好的前景。
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参考文献
1 BonayM，Solerp，Riquefm，et al.Expression of heat shock protein in huˉman lung and lung cancer.Am J Respir Cell Mol Biol，1994，10:453-461.
2 张永幸，贺涵员，郭堂春，等.职业性肺癌中HSP70，HSP27与P 53 表达的相关性研究.中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(2):78-80.
3 Srivastava PR.Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reficulum:role in immune response to cancer and in antigen presentaˉtion.Adv Cancer Res，1993，62:153-177.
, 百拇医药
4 郭建成.热休克蛋白-肽复合物肿瘤疫苗.国外医学·肿瘤分册，1996，10:267-270.
5 Srivastava PR.Heat shock protein in immune response to cancer:the fourth path paradigm.Experientia，1994，50:1054-1060.
6 Coulie PG.Human tumor antigens recognized by T Cell:new perspecˉtives foranti-cancer vaccines?Mol Med Today，1997，3:261-268.
7 赵得容，潘志贵，邹玉臣.肿瘤的生物疗法概况.国外医学·免疫学分册，1996，19(2):91-93.
8 Ostrand RS，Pulaski BA，Clements VK，et al.Cell-based vaccines for the stimulatation of immunity to metastatic cancers.Immunol Rev，1999，170:101-114.
, 百拇医药
9 Baskar S.Gene-modified tumor cells as cellular vaccine.Immunol Imˉmunother，1996，43(3):165-173.
10 Malusecka E，Zborek A，Krzyzowska Grucas，et al.Expression of heat shock proteins HSP70and HSP27in primary non-small cell lung carˉcinomas.An immunohistochemical study.Anticancer Res，2001，21(2A):295-298.
11 Heike M，Noll B，Meyer Zum Buschenfelde KH，et al.Heat shock proˉtein-peptide complexes for use in Vaccines.J Ieukos Biol，1996，60(2):153-158.
作者单位:1 063000河北唐山华北煤炭医学院附属医院胸外科
2 063000河北唐山华北煤炭医学院微生物教研室
(收稿日期:2004-02-25)
(编辑 海涛), http://www.100md.com