白眉蝮蛇去整合素adinbitor对B16黑色素瘤细胞在体内外增殖的抑制作用
【摘要】 目的 研究基因工程方法获得的来自于中国旅顺白眉蝮蛇毒腺的重组去整合素adinbitor在抗肿瘤方面的作用，为抗肿瘤新药开发提供依据。方法 体外实验采用MTT法检测，并用Hoechst染色法鉴定细胞凋亡;体内实验采用皮下注射B16细胞建立小鼠荷瘤模型检测。结果 adinbitor能以ID50为11μg/ml(1.22μmol/L)的浓度呈剂量依赖性方式抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的B16黑色素瘤细胞的增殖，诱导其发生细胞凋亡，并且对接种于C57BL/6小鼠的B16实体瘤的生长抑制作用显著(P<0.01)。结论 adinbitor在体外对B16细胞的增殖具有抑制作用，能显著导致B16细胞的凋亡，且在体内呈现较好的抗肿瘤效能，有希望成为一种抗癌新药。
关键词 去整合素 adinbitor 细胞增殖 细胞凋亡 抗肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0488-03
, 百拇医药
Inhibition onproli feration of B16melanoma cells
in vivo and in vitro by adinbitor，adisintegrin from
agkistrodon halys brevicaudus stejneger Wang Jihong，Wu Yu，Lv Li，et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，Dalian Medical University，Dalian116027.
【Abstract】 Objective To study the anti-tumor functions of the recombinant disintegrin adinbitor from Agkˉistrodon halys brevicaudus stejneger，provide a basis for developing the new anti-tumor agents.Methods Functions in vitro was examined by MTT，apoptosis determination was performed by Hoechst Apoptosis Kit;Thetumor bearing mice model was established by injecting B16melanoma cells.Results Adinbitor could inhibit B16melanoma cells proliferation induced by basic fibroblast growth factor(bFGF)with ID5011μg/ml(1.22μmol/L)and induce apoptosis of B16cells(P<0.01).Moreover，adinbitor could significantly inhibited growth of melanoma solid tumor implanted in C57BL/6mouse.Conclusion Not only has effect on inhibiting B16melanoma cells proliferation in vitro and induce apoptosis，adinbitor also has significantly functions of inhibition on growth of B16solid tumorin vivo.These indicated that adinbitor will be valuable in developing anti-tumor agents.
, 百拇医药
Key words disintegrin adinbitor cellular proliferation apoptosis anti-tumor
去整合素为一组来自于蛇毒的小分子量蛋白质家族，其一级结构为:含有约70个左右氨基酸残基及多个能形成二硫键的半胱氨酸，多为单链蛋白质分子。大多数去整合素含有RGD或KGD序列，这是被血小板纤维蛋原受体α 2b β 3 所识别的结构模体，同时也是表达于血管内皮细胞及肿瘤细胞表面的整合素α v β 3 和α 5 β 1 的拮抗剂的识别模体。对去整合素的研究表明，其除了具有已知的抗血小板聚集的活性外，还具有抗血管新生与肿瘤生长的作用 [1～7] ，这使得其成为以整合素为作用靶点的抗肿瘤新药的研究热点。
Adinbitor为来自于中国旅顺白眉蝮蛇(Agkistrodon halys brevicaudus stejneger)的去整合素家族的新成员，是通过基因工程手段获得的含73个氨基酸残基的重组蛋白。它含有去整合素的RGD模体及12个半胱氨酸残基。有关其基因克隆及其抗血小板聚集及血管新生功能的报告，将另文发表。本篇报道着重描述其对小鼠B16黑色素瘤细胞的活性测定结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 (1)重组去整合素adinbitor通过基因工程方法获得。(2)SPF级的C57BL/6小鼠购自中国科学院细胞库。(3)小鼠黑色素瘤B16细胞为本实验室保存;细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自碧云天公司;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自PEPROTECH EC LTD.;抗α v β 3 单克隆抗体购自CHEMICON公司;组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)购自Novagen公司。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质的可溶性表达与纯化 将带有pET23b-adˉinbitor重组质粒的大肠杆菌BL21培养至对数生长期后进行IPTG(1mmol/L)的诱导表达，蛋白质的纯化采用组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)进行。
, http://www.100md.com
1.2.2 MTT法检测重组蛋白对碱性成纤维生长因子(bFGF)诱导的B16细胞增殖的抑制作用将B16细胞(4×10 5 )接种入96孔板，加入终浓度为30ng/ml的bFGF诱导细胞增殖24h后，加入不同浓度的重组adinbitor或抗α v β3单克隆抗体(anti-α v β 3 mAb)继续培养24h，MTT法测定光吸收值，测定波长为490nm。
1.2.3 Adinbitor对B16细胞凋亡的诱导 细胞凋亡的测定采用Hoechst细胞凋亡试剂盒。B16(3×10 6 )接种于放置于6孔板中的灭菌盖玻片上。经24h的培养后，加入一系列浓度的adinbitor进行细胞凋亡的诱导。诱导24h后以PBS清洗细胞，甲醇/冰醋酸(3:1)固定5min，DNA结合荧光染料Hoechst33258染色10min，荧光显微镜对细胞核形态观察拍照，以区分均质的正常细胞核及染色质浓缩的凋亡细胞核。
, 百拇医药
1.2.4 重组adinbitor对荷瘤小鼠的治疗作用 将8周龄体重20g左右且雌雄各半的C57BL/6小鼠右腋皮下接种1×10 5 的B16黑色素瘤细胞，3天后将小鼠按雌雄各半随机分为三组，每组16只，分别给予生理盐水、环磷酰胺、Adinbitor注射治疗。右腋接种肿瘤处注射，隔天1次，注射3周。荷瘤对照组按照0.3ml生理盐水/20g体重的剂量注射，阳性对照组按照环磷酰胺1mg/kg体重的剂量注射，Adinbitor组按照1.25mg/kg体重的剂量注射重组adinbitor，观察并记录肿瘤生长情况。治疗3周后，处死大部分小鼠，取瘤体组织称重并测量大小，并进行统计学分析。剩余的少数小鼠进行生存期限观察。
2 结果
2.1 重组adinbitor的表达与纯化 经IPTG诱导，获得了adinbitor的可溶性表达。其分子量为9kD。表达产物经亲和层析纯化后，可获得浓度为1mg/ml的均质蛋白(略)。
, 百拇医药
2.2 Adinbitor对bFGF诱导的B16细胞增殖的的抑制 重组Adinbitor对bFGF诱导下的B16黑色素瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且与抗α v β 3 单克隆抗体的作用方式类似(见图2)。Adinbitor的半效应量(mddian infective dose，ID50)约为11μg/ml(1.22μmol/L)。这提示Adinbitor可能是通过阻断整合素α v β 3 的作用位点而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
2.3 由Adinbitor诱导的B16的细胞凋亡 荧光染料Hoechst33258常用于凋亡细胞核的确定本研究中，凋亡的B16细胞核由于其染色质的浓缩被染成亮蓝色，而正常细胞核只被染成轻微的蓝色。结果(略)表明，Adinbitor能有效诱导B16细胞发生凋亡。
2.4 Adinbitor对接种于C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤生长的抑制作用 经对各组瘤体大小与重量的方差分析，荷瘤对照组(NS)与环磷酰胺阳性对照组及注射重组adinbitor组差 异显著，P均<0.01;而环磷酰胺阳性对照组及注射重组adˉinbitor组的差异不显著，P>0.05(见图4及表1)。这说明重组Adinbitor对接种于C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤的生长具有显著的抑制作用，并且有效程度与传统抗肿瘤药物环磷酰胺相当。存活实验结果表明，注射环磷酰胺与重组Adinˉbitor的组别平均生存期比阴性对照组延长1周左右。
, 百拇医药
表1 Adinbitor对荷瘤小鼠肿瘤重量及体积的影响 略
3 讨论
寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。而多种来源于不同蛇种的去整合素已被证实具有抗血管新生，抑制肿瘤细胞的粘附与转移，引起肿瘤细胞凋亡的显著作用 [2～7] 。而此项关于重组去整合素adinbitor的研究得到了同样令人欣喜的结果。韩国的salmonsin对B16黑色素瘤细胞的增殖起抑制作用的ID50为2.7μmol/L[5] ，而adinbitor的ID50为1.22μmol/L，这说明adinbitor较salmonsin的作用更为有效。adinbitor对bFGF诱导的B16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用方式与抗α v β 3 单克隆抗体类似。由于bFGF可诱发肿瘤细胞表面高表达整合素α v β 3 ，由此推断，adinbitor的抑制增殖的作用是通过阻断整合素α v β 3 的作用位点而实现，表现在信号转导通路下游的现象就会引起细胞凋亡，而Hoechst细胞凋亡实验结果证实了这一点推测。而体内动物实验结果结合已完成的抑制血管新生活性测定(将另文发表)结果表明，adˉinbitor是通过抑制B16细胞的粘附和实体瘤表面血管新生，诱导肿瘤细胞凋亡的机理而对接种于小鼠体内的B16实体瘤的生长起到抑制作用的。因白眉蝮蛇是我国保护野生动物，所以直接从蛇毒中提取去整合素的方法是不可取的。采用基因工程方法制备去整合素对于保护野生动物资源与新药开发就显得十分必要。而笔者所做的大量实验结果已证实了重组Adinbitor作为去整合素的典型功能，有望发展成为一种抗肿瘤新药。
, 百拇医药
参考文献
1 Hong SY，Koh YS，Chung KH，et al.Snake venom disintegrin，saxatilin，inhibits platelet aggregation，human umbilical vein endothelial cell proˉliferation，and smooth muscle cell migration.Thrombosis Res，2002，105(1):79-86.
2 Yeh CH，Peng HC，Yang RS，et al.Rhodostomin，a snake venom disinteˉgrin，inhibits angiogenesis elicited by basic fibroblast growth factor and suppresses tumor growth by a selectiveα v β 3 blockade of endothelial cells.Mol Pharmaco，2001，59(5):1333-1342.
, http://www.100md.com
3 Yeh CH，Peng HC，HuangTF.Accutin，a newdisintegrin，inhibits angioˉgenesis in vitro and in vivo by acting as integrinα v β 3 antagonist and inˉducing apoptosis.Blood，1998，92(9):3268-3276.
4 Kang IC，Lee YD，Kim DS.A novel disintegrin salmosin inhibits tumor angiog enesis.Cancer Res，1999，59(15):3754-3760.
5 Kang IC，Kim DS，Jang Y，et al.Suppressive mechanism of salmosin，a novel disintegrin in B16melanoma cell metastasis.Biochem Biophys Res Commu，2000，275(1):169-173.
, http://www.100md.com
6 Trikha M，De Clerck YA，Markland FS.Contortrostatin，a snake venom disinte grin，inhibits beta1integrin-mediated human metastatic melanoma cell adhesion and blocks experimental matastasis.Cancer Res，1994，54(18):4993-4998.
7 Brooks PC，Montgomery AMP，Rosenfeld M.Integrinα v β 3 antagonists proˉmote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels.Cell，1994，79:1157-1164.
作者单位: 116027辽宁大连医科大学生物化学与分子生物学教研室
(编辑 李木), 百拇医药
关键词 去整合素 adinbitor 细胞增殖 细胞凋亡 抗肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0488-03
, 百拇医药
Inhibition onproli feration of B16melanoma cells
in vivo and in vitro by adinbitor，adisintegrin from
agkistrodon halys brevicaudus stejneger Wang Jihong，Wu Yu，Lv Li，et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，Dalian Medical University，Dalian116027.
【Abstract】 Objective To study the anti-tumor functions of the recombinant disintegrin adinbitor from Agkˉistrodon halys brevicaudus stejneger，provide a basis for developing the new anti-tumor agents.Methods Functions in vitro was examined by MTT，apoptosis determination was performed by Hoechst Apoptosis Kit;Thetumor bearing mice model was established by injecting B16melanoma cells.Results Adinbitor could inhibit B16melanoma cells proliferation induced by basic fibroblast growth factor(bFGF)with ID5011μg/ml(1.22μmol/L)and induce apoptosis of B16cells(P<0.01).Moreover，adinbitor could significantly inhibited growth of melanoma solid tumor implanted in C57BL/6mouse.Conclusion Not only has effect on inhibiting B16melanoma cells proliferation in vitro and induce apoptosis，adinbitor also has significantly functions of inhibition on growth of B16solid tumorin vivo.These indicated that adinbitor will be valuable in developing anti-tumor agents.
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Key words disintegrin adinbitor cellular proliferation apoptosis anti-tumor
去整合素为一组来自于蛇毒的小分子量蛋白质家族，其一级结构为:含有约70个左右氨基酸残基及多个能形成二硫键的半胱氨酸，多为单链蛋白质分子。大多数去整合素含有RGD或KGD序列，这是被血小板纤维蛋原受体α 2b β 3 所识别的结构模体，同时也是表达于血管内皮细胞及肿瘤细胞表面的整合素α v β 3 和α 5 β 1 的拮抗剂的识别模体。对去整合素的研究表明，其除了具有已知的抗血小板聚集的活性外，还具有抗血管新生与肿瘤生长的作用 [1～7] ，这使得其成为以整合素为作用靶点的抗肿瘤新药的研究热点。
Adinbitor为来自于中国旅顺白眉蝮蛇(Agkistrodon halys brevicaudus stejneger)的去整合素家族的新成员，是通过基因工程手段获得的含73个氨基酸残基的重组蛋白。它含有去整合素的RGD模体及12个半胱氨酸残基。有关其基因克隆及其抗血小板聚集及血管新生功能的报告，将另文发表。本篇报道着重描述其对小鼠B16黑色素瘤细胞的活性测定结果。
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1 材料与方法
1.1 材料 (1)重组去整合素adinbitor通过基因工程方法获得。(2)SPF级的C57BL/6小鼠购自中国科学院细胞库。(3)小鼠黑色素瘤B16细胞为本实验室保存;细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自碧云天公司;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自PEPROTECH EC LTD.;抗α v β 3 单克隆抗体购自CHEMICON公司;组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)购自Novagen公司。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质的可溶性表达与纯化 将带有pET23b-adˉinbitor重组质粒的大肠杆菌BL21培养至对数生长期后进行IPTG(1mmol/L)的诱导表达，蛋白质的纯化采用组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)进行。
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1.2.2 MTT法检测重组蛋白对碱性成纤维生长因子(bFGF)诱导的B16细胞增殖的抑制作用将B16细胞(4×10 5 )接种入96孔板，加入终浓度为30ng/ml的bFGF诱导细胞增殖24h后，加入不同浓度的重组adinbitor或抗α v β3单克隆抗体(anti-α v β 3 mAb)继续培养24h，MTT法测定光吸收值，测定波长为490nm。
1.2.3 Adinbitor对B16细胞凋亡的诱导 细胞凋亡的测定采用Hoechst细胞凋亡试剂盒。B16(3×10 6 )接种于放置于6孔板中的灭菌盖玻片上。经24h的培养后，加入一系列浓度的adinbitor进行细胞凋亡的诱导。诱导24h后以PBS清洗细胞，甲醇/冰醋酸(3:1)固定5min，DNA结合荧光染料Hoechst33258染色10min，荧光显微镜对细胞核形态观察拍照，以区分均质的正常细胞核及染色质浓缩的凋亡细胞核。
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1.2.4 重组adinbitor对荷瘤小鼠的治疗作用 将8周龄体重20g左右且雌雄各半的C57BL/6小鼠右腋皮下接种1×10 5 的B16黑色素瘤细胞，3天后将小鼠按雌雄各半随机分为三组，每组16只，分别给予生理盐水、环磷酰胺、Adinbitor注射治疗。右腋接种肿瘤处注射，隔天1次，注射3周。荷瘤对照组按照0.3ml生理盐水/20g体重的剂量注射，阳性对照组按照环磷酰胺1mg/kg体重的剂量注射，Adinbitor组按照1.25mg/kg体重的剂量注射重组adinbitor，观察并记录肿瘤生长情况。治疗3周后，处死大部分小鼠，取瘤体组织称重并测量大小，并进行统计学分析。剩余的少数小鼠进行生存期限观察。
2 结果
2.1 重组adinbitor的表达与纯化 经IPTG诱导，获得了adinbitor的可溶性表达。其分子量为9kD。表达产物经亲和层析纯化后，可获得浓度为1mg/ml的均质蛋白(略)。
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2.2 Adinbitor对bFGF诱导的B16细胞增殖的的抑制 重组Adinbitor对bFGF诱导下的B16黑色素瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且与抗α v β 3 单克隆抗体的作用方式类似(见图2)。Adinbitor的半效应量(mddian infective dose，ID50)约为11μg/ml(1.22μmol/L)。这提示Adinbitor可能是通过阻断整合素α v β 3 的作用位点而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
2.3 由Adinbitor诱导的B16的细胞凋亡 荧光染料Hoechst33258常用于凋亡细胞核的确定本研究中，凋亡的B16细胞核由于其染色质的浓缩被染成亮蓝色，而正常细胞核只被染成轻微的蓝色。结果(略)表明，Adinbitor能有效诱导B16细胞发生凋亡。
2.4 Adinbitor对接种于C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤生长的抑制作用 经对各组瘤体大小与重量的方差分析，荷瘤对照组(NS)与环磷酰胺阳性对照组及注射重组adinbitor组差 异显著，P均<0.01;而环磷酰胺阳性对照组及注射重组adˉinbitor组的差异不显著，P>0.05(见图4及表1)。这说明重组Adinbitor对接种于C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤的生长具有显著的抑制作用，并且有效程度与传统抗肿瘤药物环磷酰胺相当。存活实验结果表明，注射环磷酰胺与重组Adinˉbitor的组别平均生存期比阴性对照组延长1周左右。
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表1 Adinbitor对荷瘤小鼠肿瘤重量及体积的影响 略
3 讨论
寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。而多种来源于不同蛇种的去整合素已被证实具有抗血管新生，抑制肿瘤细胞的粘附与转移，引起肿瘤细胞凋亡的显著作用 [2～7] 。而此项关于重组去整合素adinbitor的研究得到了同样令人欣喜的结果。韩国的salmonsin对B16黑色素瘤细胞的增殖起抑制作用的ID50为2.7μmol/L[5] ，而adinbitor的ID50为1.22μmol/L，这说明adinbitor较salmonsin的作用更为有效。adinbitor对bFGF诱导的B16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用方式与抗α v β 3 单克隆抗体类似。由于bFGF可诱发肿瘤细胞表面高表达整合素α v β 3 ，由此推断，adinbitor的抑制增殖的作用是通过阻断整合素α v β 3 的作用位点而实现，表现在信号转导通路下游的现象就会引起细胞凋亡，而Hoechst细胞凋亡实验结果证实了这一点推测。而体内动物实验结果结合已完成的抑制血管新生活性测定(将另文发表)结果表明，adˉinbitor是通过抑制B16细胞的粘附和实体瘤表面血管新生，诱导肿瘤细胞凋亡的机理而对接种于小鼠体内的B16实体瘤的生长起到抑制作用的。因白眉蝮蛇是我国保护野生动物，所以直接从蛇毒中提取去整合素的方法是不可取的。采用基因工程方法制备去整合素对于保护野生动物资源与新药开发就显得十分必要。而笔者所做的大量实验结果已证实了重组Adinbitor作为去整合素的典型功能，有望发展成为一种抗肿瘤新药。
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参考文献
1 Hong SY，Koh YS，Chung KH，et al.Snake venom disintegrin，saxatilin，inhibits platelet aggregation，human umbilical vein endothelial cell proˉliferation，and smooth muscle cell migration.Thrombosis Res，2002，105(1):79-86.
2 Yeh CH，Peng HC，Yang RS，et al.Rhodostomin，a snake venom disinteˉgrin，inhibits angiogenesis elicited by basic fibroblast growth factor and suppresses tumor growth by a selectiveα v β 3 blockade of endothelial cells.Mol Pharmaco，2001，59(5):1333-1342.
, http://www.100md.com
3 Yeh CH，Peng HC，HuangTF.Accutin，a newdisintegrin，inhibits angioˉgenesis in vitro and in vivo by acting as integrinα v β 3 antagonist and inˉducing apoptosis.Blood，1998，92(9):3268-3276.
4 Kang IC，Lee YD，Kim DS.A novel disintegrin salmosin inhibits tumor angiog enesis.Cancer Res，1999，59(15):3754-3760.
5 Kang IC，Kim DS，Jang Y，et al.Suppressive mechanism of salmosin，a novel disintegrin in B16melanoma cell metastasis.Biochem Biophys Res Commu，2000，275(1):169-173.
, http://www.100md.com
6 Trikha M，De Clerck YA，Markland FS.Contortrostatin，a snake venom disinte grin，inhibits beta1integrin-mediated human metastatic melanoma cell adhesion and blocks experimental matastasis.Cancer Res，1994，54(18):4993-4998.
7 Brooks PC，Montgomery AMP，Rosenfeld M.Integrinα v β 3 antagonists proˉmote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels.Cell，1994，79:1157-1164.
作者单位: 116027辽宁大连医科大学生物化学与分子生物学教研室
(编辑 李木), 百拇医药