加味肾气丸对哮喘患者淋巴细胞亚群的影响
【摘要】 目的 研究加味肾气丸对哮喘Th1/Th2细胞凋亡的影响及其机制。方法 分离哮喘缓解期患者外周血CD4 + 细胞，检测其活化Caspase-3及不同表型细胞Fas表达与加味肾气丸对其影响。结果 空白对照与加味肾气丸(浓度分别为0.01、0.02、0.04g/ml)刺激体外培养支气管哮喘外周血CD4 + 细胞24h，Th2细胞凋亡率分别为15.30±2.16、18.13±4.33、21.74±5.44及23.42±6.35(与空白对照相比P<0.05;加味肾气丸浓度为0.01g/ml，与0.04g/ml，两者相比，P<0.05);活化Caspase-3分别为(10.76±2.60)、(12.35±2.96)、(13.86±3.07)及(14.77±3.17)ng/ml(空白对照与加味肾气丸浓度为0.02g/ml及0.04g/ml两者相比，P<0.05);相关分析显示，CCR3阳性细胞凋亡与其Fas表达呈显著正相关(r=0.609，P=0.000)，与Capase-3表达亦呈显著正相关(r=0.679，P=0.000)。加味肾气丸对Th1相比凋亡率及Fas表达无明显影响。结论 加味肾气丸通过诱导哮喘患者Th2细胞Fas及活化Caspase-3表达诱导其凋亡。
, 百拇医药
关键词 哮喘 加味肾气丸 T辅助细胞 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0514-03
细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，在免疫系统的发育与炎症反应中发挥重要作用。业已证明，细胞凋亡哮喘气道炎症过程，多种中药对哮喘气道炎症具有抑制作用 [1] 。为研究加味肾气丸哮喘Th1/Th2细胞凋亡的影响及其机制，我们观察加味肾气丸对体外培养CD4 + 细胞Fas及Capase-3表达的影响，以期阐明加味肾气丸的作用机理。
1 材料与方法
1.1 试验对象 所有支气管哮喘均应符合中华医学会呼吸病分会哮喘诊断标准。共选择支气管哮喘患者10例，均为支气管哮喘稳定期患者。同时选择10例健康人做对照。所有受试者试验前1个月内未使用免疫调节剂及细胞毒药物。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 流式细胞仪为法国Coulter公司产品;酶标仪芬兰Lab System产品。
1.3 试剂 FITC标记抗CCR3抗体、PE标记CCR5及Cy5标记Annevin V，均购自R&D公司(美国);抗CD单克隆抗体购自公司;INF-γ与IL-4ELISA试剂盒购自晶美公司;淋巴细胞分离液购自上海生化公司。
1.4 方法 (1)中药制备:按文献 [2] 报道方法制备。黄芪60g，丹参12g，肉桂3g，制附片3g，生地24g，怀药15g，山萸10g，茯苓10g，泽泻10g，丹皮10g。上述中药按常规水煎取上清，经浓缩、冷冻、干燥后制成粉剂备用。用前以DMEM培养基配成0.04g/ml浓度，以直径为0.22μ的微孔滤膜过滤除菌，于4℃冰箱保存。(2)淋巴细胞分离:所有受试对象均于早晨空腹无菌取肘静脉血40ml，枸橼酸钠(130mmol/L，pH7.4)抗凝，5%FCS/Hank’s液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面，室温离心1000g，20min。收集上层淋巴细胞。以培养基调成2ml细胞悬液。(3)T淋巴细胞分离:将细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞。将未贴壁细胞加入已用Hank’s处理的长100mm，直径3mm的尼龙毛柱中，60min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞。1000rpm离心10min，调成细胞悬液。(4)CD4 + 细胞分离:在无菌平皿中加入抗CD8单抗6μg，以pH9.5的PBS6ml稀释后旋转平皿使溶液均匀覆盖平皿底部。室温水平放置40min后，洗4次，用含1%的FCS的PBS液封闭，制成抗体包被平皿。将T细胞悬液(5×10 6 /5ml)加入平皿内，置4℃水平放置70min，吸取未黏附细胞。(5)上述分离细胞以含5%小牛血清的PRMI1640培养基重悬，按5×10 5 /ml接种于6孔培养板。37℃，5%CO 2 培养24h。每例标本分为4份，第1孔为空白对照组，第2～4孔加入中药，终浓度分别为0.01g/ml，0.02g/ml及0.04g/ml。(6)收集培养细胞，PBS洗1次，每10 5 细胞加入1μl人IgG，室温孵育15min。(7)加入25μl FITC标记抗CCR3抗体、25μl PE标记CCR5及5μlCy5标记Annevin V，4℃孵育30min。(8)PBS洗细胞1次，重悬于400μl PBS中，流式细胞仪检测CCR5与Annevin V双阳性，CCR3与Annevin V双阳性细胞。(9)Caspase-3测定:用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定活化Caspase-3。每孔加入2μl生物素标记的ZVKD-fmk inhibitor，室温孵育1h后将细胞吸入EP管，1000g离心5min，PBS洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置4℃冰箱保存。按试剂盒说明进行ELISA检测活化Caspase-3。
, http://www.100md.com
1.5 统计学方法 数据均以均数±标准差表达，分别以t检验及直线相关分析进行分析，P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 加味肾气丸对不同亚群CD4 + 细胞Fas表达的影响 0.02g/ml加味肾气丸可促进支气管哮喘CCR3阳性T淋巴细胞Fas表达，0.04g/ml时更加明显(见表1)。
2.2 加味肾气丸对CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3影响 0.02g/ml加味肾气丸可增加体外培养支气管哮喘患者外周血CD4 + 活化Caspase-3表达(见表2)。
2.3 CCR3阳性细胞凋亡与Fas表达及活化Capase-3分泌相关分析 相关分析显示，CCR3阳性细胞凋亡与其Fas表 达呈显著正相关(r=0.609，P=0.000)(见图1)。
, 百拇医药
表1 加味肾气丸对不同亚群CD4 + 细胞Fas表达的影响 略
表2 加味肾气丸对CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3影响 略
3 讨论
中药对细胞凋亡具有调节作用。沈自尹等 [3] 的研究表明，由附子、肉桂、熟地、山茱萸、淮山药、仙灵脾、茯苓、炙甘草组成的补肾中药对衰老大鼠T淋巴细胞凋亡具有抑制作用，但由桃仁、红花、生地、白芍、当归、川芎组成的活血化瘀中药复方却无此作用。补肾复方主要通过抑制衰老大鼠T细胞过度表达Fas与FasL调控其凋亡。王蓉蓉等 [4]的研究发现，由丹参、益母草、枸杞子、淫羊藿、黄芪、甘草等组成的补肾化瘀药可促进HL-60细胞凋亡。张国强等 [5] 观察丹参对人肾成纤维细胞3H TdR掺入率的影响，并用流式细胞仪检测了细胞凋亡及C-myc蛋白表达情况，发现丹参对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用，并通过使C-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡。中药对细胞凋亡的抑制或促进依赖于细胞状态及种类。我们的研究发现，加味肾气丸对支气管哮喘Th2细胞具有促进作用，这种作用与诱导该类细胞表达Fas有关。
, 百拇医药
中药诱导细胞凋亡的机制较复杂。在体内，由于多数中药对内分泌-神经-体液及细胞因子表达均具有调节作用，故可能通过内环境的改变调节细胞凋亡过程。体外研究发现，抗肿瘤、活血化瘀及补益中药可诱导Fas或FasL及调节其他与细胞凋亡有关基因的表达促进细胞凋亡 [6] 。丹参酮A可显著增加HL-60和K562两种细胞caspase-3酶活性，对caspase-1活性无明显影响[7] 。我们的研究发现，0.02g/ml浓度加味肾气丸可促进体外培养支气管哮喘外周血CD4 + 细胞活化caspase-3产生，而同样浓度加味肾气丸仅对Th2细胞Fas表达及凋亡有促进作用，因此，我们认为，加味肾气丸促进Th2细胞凋亡主要通过Fas-caspase-3途经介导。
Fas是细胞外信号介导细胞凋亡的重要途径，而caspase-3是细胞外与细胞内多种凋亡信号途径的共同通道 [8] 。相关分析显示，加味肾气丸作用或活化caspase-3水平与Th2细胞凋亡的相关系数高于Fas与Th2细胞凋亡的相关系数，提示除Fas外，加味肾气丸促进Th2细胞凋亡可能存在其他细胞外或细胞内凋亡信号。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Noma T，Sugawara Y，Aoki K，et al.Induction of peripheral mononuclear cell apoptosis in asthmatic patients in remission.J Asthma，2002，39:591-601.
2 尤红，王宝恩，王泰龄，等.复方861对肝星状细胞的增殖和凋亡的干预作用.中华肝脏病杂志，2000，8:78-80.
3 沈自尹.中国中西医结合杂志，2000，20(11):808.
4 王蓉蓉，殷玉志，刘素宾.补肾化瘀药对HL-60细胞凋亡的诱导作用.中国中医药信息杂志，1998，5:24-25.
5 张国强，叶任高，孔庆渝，等.丹参对狼疮性肾炎成纤维细胞凋亡增殖及C-myc蛋白表达的影响.中国中西医结合杂志，1997，17:473-475.
, 百拇医药
6 张侠，刘端棋，刘彦珠，等.温阳散结中药诱导BEL7402细胞凋亡的初步研究.中国中药杂志，2000，25:824-825.
7 Sung HJ，Choi SM，Yoon Y，et al.Tanshinon-eⅡA，an ingredient of Salvia miltiorrhiza bunge，induces apoptosis in human leukemia cell lines through the activation of caspase-3.Exp Mol Med，1999，31:174-178.
8 Lee ZH，Lee SE，Kwack K，et al.Caspase-mediated cleavage ofTRAF3in FasL-stimulated Jurkat-T cells.J Leukoc Biol，2001，69:490-496.
作者单位:1 610015四川省成都市第一人民医院
2 四川大学华西医院
3 四川大学华西口腔医院
(编辑 李木), 百拇医药
, 百拇医药
关键词 哮喘 加味肾气丸 T辅助细胞 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)06-0514-03
细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，在免疫系统的发育与炎症反应中发挥重要作用。业已证明，细胞凋亡哮喘气道炎症过程，多种中药对哮喘气道炎症具有抑制作用 [1] 。为研究加味肾气丸哮喘Th1/Th2细胞凋亡的影响及其机制，我们观察加味肾气丸对体外培养CD4 + 细胞Fas及Capase-3表达的影响，以期阐明加味肾气丸的作用机理。
1 材料与方法
1.1 试验对象 所有支气管哮喘均应符合中华医学会呼吸病分会哮喘诊断标准。共选择支气管哮喘患者10例，均为支气管哮喘稳定期患者。同时选择10例健康人做对照。所有受试者试验前1个月内未使用免疫调节剂及细胞毒药物。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 流式细胞仪为法国Coulter公司产品;酶标仪芬兰Lab System产品。
1.3 试剂 FITC标记抗CCR3抗体、PE标记CCR5及Cy5标记Annevin V，均购自R&D公司(美国);抗CD单克隆抗体购自公司;INF-γ与IL-4ELISA试剂盒购自晶美公司;淋巴细胞分离液购自上海生化公司。
1.4 方法 (1)中药制备:按文献 [2] 报道方法制备。黄芪60g，丹参12g，肉桂3g，制附片3g，生地24g，怀药15g，山萸10g，茯苓10g，泽泻10g，丹皮10g。上述中药按常规水煎取上清，经浓缩、冷冻、干燥后制成粉剂备用。用前以DMEM培养基配成0.04g/ml浓度，以直径为0.22μ的微孔滤膜过滤除菌，于4℃冰箱保存。(2)淋巴细胞分离:所有受试对象均于早晨空腹无菌取肘静脉血40ml，枸橼酸钠(130mmol/L，pH7.4)抗凝，5%FCS/Hank’s液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面，室温离心1000g，20min。收集上层淋巴细胞。以培养基调成2ml细胞悬液。(3)T淋巴细胞分离:将细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞。将未贴壁细胞加入已用Hank’s处理的长100mm，直径3mm的尼龙毛柱中，60min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞。1000rpm离心10min，调成细胞悬液。(4)CD4 + 细胞分离:在无菌平皿中加入抗CD8单抗6μg，以pH9.5的PBS6ml稀释后旋转平皿使溶液均匀覆盖平皿底部。室温水平放置40min后，洗4次，用含1%的FCS的PBS液封闭，制成抗体包被平皿。将T细胞悬液(5×10 6 /5ml)加入平皿内，置4℃水平放置70min，吸取未黏附细胞。(5)上述分离细胞以含5%小牛血清的PRMI1640培养基重悬，按5×10 5 /ml接种于6孔培养板。37℃，5%CO 2 培养24h。每例标本分为4份，第1孔为空白对照组，第2～4孔加入中药，终浓度分别为0.01g/ml，0.02g/ml及0.04g/ml。(6)收集培养细胞，PBS洗1次，每10 5 细胞加入1μl人IgG，室温孵育15min。(7)加入25μl FITC标记抗CCR3抗体、25μl PE标记CCR5及5μlCy5标记Annevin V，4℃孵育30min。(8)PBS洗细胞1次，重悬于400μl PBS中，流式细胞仪检测CCR5与Annevin V双阳性，CCR3与Annevin V双阳性细胞。(9)Caspase-3测定:用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定活化Caspase-3。每孔加入2μl生物素标记的ZVKD-fmk inhibitor，室温孵育1h后将细胞吸入EP管，1000g离心5min，PBS洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置4℃冰箱保存。按试剂盒说明进行ELISA检测活化Caspase-3。
, http://www.100md.com
1.5 统计学方法 数据均以均数±标准差表达，分别以t检验及直线相关分析进行分析，P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 加味肾气丸对不同亚群CD4 + 细胞Fas表达的影响 0.02g/ml加味肾气丸可促进支气管哮喘CCR3阳性T淋巴细胞Fas表达，0.04g/ml时更加明显(见表1)。
2.2 加味肾气丸对CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3影响 0.02g/ml加味肾气丸可增加体外培养支气管哮喘患者外周血CD4 + 活化Caspase-3表达(见表2)。
2.3 CCR3阳性细胞凋亡与Fas表达及活化Capase-3分泌相关分析 相关分析显示，CCR3阳性细胞凋亡与其Fas表 达呈显著正相关(r=0.609，P=0.000)(见图1)。
, 百拇医药
表1 加味肾气丸对不同亚群CD4 + 细胞Fas表达的影响 略
表2 加味肾气丸对CD4 + 细胞分泌活化Caspase-3影响 略
3 讨论
中药对细胞凋亡具有调节作用。沈自尹等 [3] 的研究表明，由附子、肉桂、熟地、山茱萸、淮山药、仙灵脾、茯苓、炙甘草组成的补肾中药对衰老大鼠T淋巴细胞凋亡具有抑制作用，但由桃仁、红花、生地、白芍、当归、川芎组成的活血化瘀中药复方却无此作用。补肾复方主要通过抑制衰老大鼠T细胞过度表达Fas与FasL调控其凋亡。王蓉蓉等 [4]的研究发现，由丹参、益母草、枸杞子、淫羊藿、黄芪、甘草等组成的补肾化瘀药可促进HL-60细胞凋亡。张国强等 [5] 观察丹参对人肾成纤维细胞3H TdR掺入率的影响，并用流式细胞仪检测了细胞凋亡及C-myc蛋白表达情况，发现丹参对人肾成纤维细胞增殖有抑制作用，并通过使C-myc蛋白高水平表达而诱导细胞凋亡。中药对细胞凋亡的抑制或促进依赖于细胞状态及种类。我们的研究发现，加味肾气丸对支气管哮喘Th2细胞具有促进作用，这种作用与诱导该类细胞表达Fas有关。
, 百拇医药
中药诱导细胞凋亡的机制较复杂。在体内，由于多数中药对内分泌-神经-体液及细胞因子表达均具有调节作用，故可能通过内环境的改变调节细胞凋亡过程。体外研究发现，抗肿瘤、活血化瘀及补益中药可诱导Fas或FasL及调节其他与细胞凋亡有关基因的表达促进细胞凋亡 [6] 。丹参酮A可显著增加HL-60和K562两种细胞caspase-3酶活性，对caspase-1活性无明显影响[7] 。我们的研究发现，0.02g/ml浓度加味肾气丸可促进体外培养支气管哮喘外周血CD4 + 细胞活化caspase-3产生，而同样浓度加味肾气丸仅对Th2细胞Fas表达及凋亡有促进作用，因此，我们认为，加味肾气丸促进Th2细胞凋亡主要通过Fas-caspase-3途经介导。
Fas是细胞外信号介导细胞凋亡的重要途径，而caspase-3是细胞外与细胞内多种凋亡信号途径的共同通道 [8] 。相关分析显示，加味肾气丸作用或活化caspase-3水平与Th2细胞凋亡的相关系数高于Fas与Th2细胞凋亡的相关系数，提示除Fas外，加味肾气丸促进Th2细胞凋亡可能存在其他细胞外或细胞内凋亡信号。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Noma T，Sugawara Y，Aoki K，et al.Induction of peripheral mononuclear cell apoptosis in asthmatic patients in remission.J Asthma，2002，39:591-601.
2 尤红，王宝恩，王泰龄，等.复方861对肝星状细胞的增殖和凋亡的干预作用.中华肝脏病杂志，2000，8:78-80.
3 沈自尹.中国中西医结合杂志，2000，20(11):808.
4 王蓉蓉，殷玉志，刘素宾.补肾化瘀药对HL-60细胞凋亡的诱导作用.中国中医药信息杂志，1998，5:24-25.
5 张国强，叶任高，孔庆渝，等.丹参对狼疮性肾炎成纤维细胞凋亡增殖及C-myc蛋白表达的影响.中国中西医结合杂志，1997，17:473-475.
, 百拇医药
6 张侠，刘端棋，刘彦珠，等.温阳散结中药诱导BEL7402细胞凋亡的初步研究.中国中药杂志，2000，25:824-825.
7 Sung HJ，Choi SM，Yoon Y，et al.Tanshinon-eⅡA，an ingredient of Salvia miltiorrhiza bunge，induces apoptosis in human leukemia cell lines through the activation of caspase-3.Exp Mol Med，1999，31:174-178.
8 Lee ZH，Lee SE，Kwack K，et al.Caspase-mediated cleavage ofTRAF3in FasL-stimulated Jurkat-T cells.J Leukoc Biol，2001，69:490-496.
作者单位:1 610015四川省成都市第一人民医院
2 四川大学华西医院
3 四川大学华西口腔医院
(编辑 李木), 百拇医药