CRH刺激腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径的初步研究
【摘要】 目的 探讨促肾上腺激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)刺激腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径。方法 利用拮抗剂分别拮抗巨噬细胞的CRH-R1、CHR-R2受体、cAMP和PKA磷酸化后，检测CRH刺激后巨噬细胞分泌TNF-α的含量和观察CRH-R1、CRH-R2、P-PKA和P-CREB在细胞中分布的变化。结果 正常巨噬细胞中有CRH-R1、CRH-R2和P-PKA的染色颗粒，而无P-CREB染色;CRH刺激后，CRH-R1、CRH-R2、P-PKA染色加深，并出现P-CREB染色颗粒。拮抗CRH-R1组、拮抗CRH-R2组和正常对照组之间无统计学差异，三组均显著低于CRH刺激组(P<0.01);cAMP拮抗组低于正常组(P<0.01);拮抗PKA组明显高于其他各组(P<0.01)。结论 CRH-R1、CRH-R2均参与了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的过程。第二信使cAMP可能是CRH调节巨噬细胞产生TNF-α的关键。PKA信号途径可能与CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制途径有关。
, http://www.100md.com
关键词 CRH 巨噬细胞 TNF-α 信号转导
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)07-0577-03
A Preliminary sudy on the pathway of signal transduetion throughwhich the
macrophages of the abdominal cavity are stimulated by CHR to secrete TNF-α
Chang Jinping，Zhou Jihong，Liu Baohua，et al.
Institute of Field Surgery of Daping ospital of3n Mititary Medical offieer University，Chongqing400042.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the pathway of signal transduction which macrophages secrete TNF-αafter CRH stimulated.Methods We adopted different
antagonists to antagonize the CRH-R1，CRH-R2，phosphoˉrylated of cAMP or PKA separately.Then we detected the content of TNF-αin superior fluid of cultured macrophages in different time after CRH stimulated，and we observed the changes of
distribution of CRH-R1，CRH-R2，P-PKA，P-CREB in marophages at the same time.Results The color granules of CRH-R1，CRH-R2and P-PKA were discovered in cytoplasmia of the normal macrophages.The colors of the three granules were deepened aferCRH stimulated.The buffy granules of P-CREB were discovered in macrophages after CRH stimulated too.There were not statistical discrepancies among the antagonist-CRH-R1group、the antagonist-CRH-R2group and the normal group;but the contents of TNF-αof the three groups significantly decreased compared with the CRH stimulated group(P<0.01).The antagonist of cAMP groups significantly decreased compared with normal contrl group(P<0.01).The contents of TNF-αof antagonist of PKA group significantly increased Compared with the other groups(P<0.01).Conclusion CRH-R1and CRH-R2both participate in the process of which CRH stimulate macrophage to secrete TNF-α.The second messenger cAMP may be the key for CRH to regulate macrophage to produce TNF-α.The signal transduction way of PKA may be concerned with the restraining pathway of which CRH stimuate macrophage to secrete TNF-α.
, 百拇医药
Key words CRH macrophage TNF-α signal transduction
目前对促肾上腺激素释放激素(CRH)刺激细胞产生的生理效应机制主要集中在对中枢神经细胞的研究上，其机制是通过Gs[激活性G蛋白-有介导激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)的作用]系统来作用。但对CRH在外周的直接免疫调节功能的机制尚无报道。本实验第一次利用不同的拮抗剂来观察巨噬细胞在CRH刺激下分泌TNF-α的含量变化和其免疫细胞染色，以探讨CRH直接调节巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径，以便找出CRH是如何直接参与调节免疫反应的。
1 材料和方法
1.1 腹腔巨噬细胞的培养 按参照的方法 [1] ，断颈处死的成年健康Wistar雄性大鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物室提供)，在腹膜上剪开一小孔，注入预冷的D-Hanks液10ml，轻柔按摩腹壁5次，吸出灌洗液约5ml，800rpm离心5min，弃上清液，加入含10%小牛血清(Hyclone美国)的RPMI1640培养液(Gibco美国)，轻轻吹打成均匀的细胞悬液。台盼蓝(Sigma美国)测定细胞活性计数，调整细胞浓度至5×10 6 /ml。接种于放有盖玻片的24孔培养板内，置于37℃、5%CO 2 、95%湿度的培养箱内培养(Shellab美国)。培养贴壁2h后，弃培养液，用预冷的PBS洗涤培养孔，去除未贴壁的细胞，贴壁者即为巨噬细胞。
, 百拇医药
1.2 实验分组和取材 取培养2h的巨噬细胞，随机分为以下6组:正常对照组(NG)、CRH刺激组(CRHG)、拮抗CRH-R1受体组(CPG)、拮抗CRH-R2受体组(CRG)、拮抗cAMP组(H89G)和拮抗PKA组(PKAG)。NG加入等体积的正常培养液;CRHG中加入含终浓度为10 -9 M的CRH(Calˉbiochem公司)的培养液 [2] ，CPG中加入含10 -9 M的CRH和5×10 -4 M的CP154526(辉瑞公司赠送)的培养液 [3] ，CRG的培养液中加入含10 -9 M的CRH和10 -6 M的CRH9-41(Calˉbiochem公司)的培养液 [4] ，H89G中加入含10 -9 M的CRH和10-6 M的H89(Calbiochem公司)的培养液 [5] ，PKAG中加入含10 -9 M的CRH和10 -4 M的PKA拮抗剂6-22(Calˉbiochem公司)的培养液 [6] ，分别于培养0.5h、1h、2h、4h和8h取培养细胞上清液和培养的巨噬细胞。
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1.3 CRH-R1、CRH-R2、P-PKA、P-CREB的免疫细胞化学染色 其中一抗工作液浓度分别为:CRH-R11:400;CRH-R21:400;P-PKA1:300;P-CREB1:300。二抗为生物素化山羊抗大鼠IgG(北京中山生物公司)，浓度为1:100。于显微镜下观察，以细胞膜或细胞核出现棕褐色颗粒为阳性判定标准。
1.4 TNF-α含量的测定 按TNF-α(Dlaclone，法国)试剂盒说明书测培养细胞上清液内TNF-α含量。
1.5 统计学处理 实验所得计量资料用均数±标准差表示(X±s)，采用SPSS10.0软件进行配对资料的t检验的统计学分析，P<0.05表示有明显统计学意义，P<0.01表示 有非常明显的统计学意义。
2 结果
, http://www.100md.com 在正常的巨噬细胞的胞浆内均有CRH-R1和CRH-R2两种受体分布，其阳性产物染色呈棕黄色颗粒，并在CRH刺激后着色加深，见图片1。正常的巨噬细胞胞浆内有P-PKA的浅黄色颗粒出现，而无P-CREB染色;CRH刺激后，细胞的胞浆、胞核内均有两者的棕黄色颗粒出现，并胞核染色均强于胞浆，尤其以P-CREB的细胞核膜深染，见图片2。
CRHG各时相点TNF-α的含量均显著高于正常对照组(P<0.01)，并随CRH的刺激时间延长，分别于1h和8h上升的幅度最大，于8h到达峰值(P<0.01)，见表1。
CPG和CRG分泌的TNF-α量无统计学差异，与NG之间也无统计学差异。但两组与CRHG有显著差异(P<0.01)，尤其在1h和8h抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的上升幅度最大，见表1。
H89能明显抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α，尤其在8h H89G明显低于NG和CRHG。另外，该组分泌的TNF-α明显低于PKAG分泌的量(P<0.01)，见表1。
, 百拇医药
PKAG的巨噬细胞分泌的TNF-α明显高于其他各组(P<0.01)，为NG的4.8～15倍;为CRHG的2.4～12倍;其中在0.5h最为突出分别为NG的15倍，CRHG的12倍，见表1。
表1 不同拮抗剂对CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的影响 略
3 讨论
CRH主要是通过与CRH-R1受体或CRH-R2受体结合后通过Gs来激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)系统来传导信号，其中第二信使环腺苷一磷酸(Cyclic adenoˉsine monophosphate，CAMP)和cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response-element binding protein，CREB)是这一信号通路的关键环节 [7～9] 。在CRH对中枢神经细胞的信号通路的研究中，CRH-R1是主要的受体。但Agelaki等人利用体内和体外的模型发现在内毒素休克早期，CRH-R1受体被拮抗后，可以抑制内毒素诱导的巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的升高 [9] 。
, http://www.100md.com
我们利用体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞和不同的拮抗剂来初步研究CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径。发现CRH-R1和CRH-R2两种受体均存在于巨噬细胞胞浆内，当CRH刺激后，胞浆内的两种受体表达明显增加。而CRH-R1受体拮抗剂CP154526和CRH-R2受体拮抗剂CRH9-41均能有效降低CRH刺激这两组的巨噬细胞 分泌TNF-α，尤其在上升幅度最大的两个时相点1h和8h最突出。这表明外源性的CRH的刺激信号是通过这两种受体传递的。
我们又发现cAMP的拮抗剂H89能有效地降低CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的能力，尤其是在CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α达到峰值的8h最显著，这提示cAMP是CRH信号途径的关键环节。免疫组化的结果发现:CRH刺激后原本在正常细胞不表达的P-CREB在细胞胞浆、胞核内出现，其中胞核染色深于胞浆，并有核膜深染的现象，这提示CRH可以刺激巨噬细胞表达P-CREB，并CREB可能有核内移的过程。故我们推测CRH通过两种受体将信号传给cAMP，活化的cAMP通过P-CREB将信号传入细胞核，作用于位于TNF-α基因的TATA盒上游的CREB结合位点，调节TNF-α的表达 [10～11] 。但实验结果中，在2～4h的时间段里cAMP的拮抗剂却增加巨噬细胞分泌TNF-α的能力，其原因有待进一步研究。
, http://www.100md.com
另外，有趣的是PKA拮抗剂非常显著地增强了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的能力，在0.5h为正常组的15倍和CRH刺激组的12倍。免疫组化显示CRH刺激后，P-PKA表达增加并从胞浆内移入胞核，这提示PKA信号途径可能与CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制有关。
综上所述，我们的研究发现CRH的两种受体均参与了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径，并且第二信使cAMP是途径的关键环节，通过P-CREB将信号传入细胞核内，作用于位于TNF-α基因的TATA盒上游的CREB结合位点，调节TNF-α的表达。另外P-PKA途径可能是巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制过程。这些资料证明神经内分泌系统可以通过CRH在巨噬细胞活化和细胞因子产生的水平上直接影响免疫系统。目前CRH→CRH-R→cAMP→CREB→靶基因位点的信号途径具体环节仍不清楚，进一步研究可能为揭开中枢神经系统如何通过CRH等神经介质来调节外周免疫细胞产生效应的机制，为临床有效控制应激后的高细胞因子血症和减轻各种应激产生的过度免疫反应以及为治疗自身免疫性疾病提供新的方法。(本文图片略。)
, 百拇医药
参考文献
1 司徒镇强，吴军正.细胞培养，西安:世界图书出版社，2000，181-182.
2 Lewis MW，Hermann GE，Rogers RC，et al.In vitro and in vivo analysis of the effects of corticotropin releasing factor on rat dorsal vagal comˉplex.J Physiol，2002，543(Pt1):135-146.
3 He L，Gilligan PJ，Zaczek R，et al.4-(1，3-Dimethoxyprop-2-ylamino)-2，7-dimethyl-8-(2，4-dichloropheny1)pyrazolo[1，5-a]-1，3，5-triazine:a potent，orally bioavailable CRF(1)receptor antagonist.:J Med Chem，2000，43(3):449-456.
, 百拇医药
4 Reis FM，Luisi S，Florio P，et al.Corticotropin-releasing factor，uroˉ cortin and endothelin-1stimulate activin A release from cultured huˉman placentalcells.Placenta，2002，23(6)522-525.
5 Kasagi Y，Horiba N，Sakai K，et al.Involvement of cAMP-response elˉement binding protein in corticotropin-releasing factor(CRF)-inˉduced down-regulation of CRF receptor1gene expression in rat anteriˉor pituitary cells.J Neuroendocrinol，2002，14(7):587-592.
, 百拇医药
6 Hillhouse EW，Grammatopoulos DK.Control of intracellular signalling by corticotropin-releasing hormone in human myometrium.Front Horm Res，2001，27:66-74.
7 Kasckow J，Mulchahey JJ，Aguilera G，et al.Corticotropin-releasing hormone
(CRH)expression and protein kinase A mediated CRH receptor signalling in an immortalized hypothalamic cell line.J Neuroendocsinol，2003，15(5)521-529.
8 Chen Y，Hatalski CG，Brunson KL，Baram TZ.Rapid phosphorylation of the CRE
, http://www.100md.com
binding protein precedes stress-induced activation of the corˉticotropin relea
sing hormone gene in medial parvocellular hypothalamic neurons of the immature rat.:Brain Res Mol Brain Res，2001，96(1-2):39-49.
9 Agelaki S，Tsatsanis C，Gravanis A，et al.Corticotropin-releasing horˉmone augments proinflammatory cytokine production frommacrophages in vitro and in lipopolysaccharide-induced endotoxin shock in mice.Infect-Immun，2002，70(11):6068-6074.
, 百拇医药
10 Wang W，Ji P，DowKE.Corticotropin-releasing hormone induces proˉliferation and TNF-alpha release in cultured rat microglia via MAP kinase signalling pathways.J Neurochem.2003，84(1):189-195.
11 Collins JS，Perry RT，Watson B Jr，et al.Association of a haplotype for tumor necrosis factor in siblings with late-onset Alzheimer disease:the NIMH Alzheimer Disease Genetics Initiative.:Am J Med Genet，2000，96(6):823-830.
作者单位:400042重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所
(收稿日期:2004-01-26)
(编辑 罗彬), 百拇医药
, http://www.100md.com
关键词 CRH 巨噬细胞 TNF-α 信号转导
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)07-0577-03
A Preliminary sudy on the pathway of signal transduetion throughwhich the
macrophages of the abdominal cavity are stimulated by CHR to secrete TNF-α
Chang Jinping，Zhou Jihong，Liu Baohua，et al.
Institute of Field Surgery of Daping ospital of3n Mititary Medical offieer University，Chongqing400042.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the pathway of signal transduction which macrophages secrete TNF-αafter CRH stimulated.Methods We adopted different
antagonists to antagonize the CRH-R1，CRH-R2，phosphoˉrylated of cAMP or PKA separately.Then we detected the content of TNF-αin superior fluid of cultured macrophages in different time after CRH stimulated，and we observed the changes of
distribution of CRH-R1，CRH-R2，P-PKA，P-CREB in marophages at the same time.Results The color granules of CRH-R1，CRH-R2and P-PKA were discovered in cytoplasmia of the normal macrophages.The colors of the three granules were deepened aferCRH stimulated.The buffy granules of P-CREB were discovered in macrophages after CRH stimulated too.There were not statistical discrepancies among the antagonist-CRH-R1group、the antagonist-CRH-R2group and the normal group;but the contents of TNF-αof the three groups significantly decreased compared with the CRH stimulated group(P<0.01).The antagonist of cAMP groups significantly decreased compared with normal contrl group(P<0.01).The contents of TNF-αof antagonist of PKA group significantly increased Compared with the other groups(P<0.01).Conclusion CRH-R1and CRH-R2both participate in the process of which CRH stimulate macrophage to secrete TNF-α.The second messenger cAMP may be the key for CRH to regulate macrophage to produce TNF-α.The signal transduction way of PKA may be concerned with the restraining pathway of which CRH stimuate macrophage to secrete TNF-α.
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Key words CRH macrophage TNF-α signal transduction
目前对促肾上腺激素释放激素(CRH)刺激细胞产生的生理效应机制主要集中在对中枢神经细胞的研究上，其机制是通过Gs[激活性G蛋白-有介导激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)的作用]系统来作用。但对CRH在外周的直接免疫调节功能的机制尚无报道。本实验第一次利用不同的拮抗剂来观察巨噬细胞在CRH刺激下分泌TNF-α的含量变化和其免疫细胞染色，以探讨CRH直接调节巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径，以便找出CRH是如何直接参与调节免疫反应的。
1 材料和方法
1.1 腹腔巨噬细胞的培养 按参照的方法 [1] ，断颈处死的成年健康Wistar雄性大鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物室提供)，在腹膜上剪开一小孔，注入预冷的D-Hanks液10ml，轻柔按摩腹壁5次，吸出灌洗液约5ml，800rpm离心5min，弃上清液，加入含10%小牛血清(Hyclone美国)的RPMI1640培养液(Gibco美国)，轻轻吹打成均匀的细胞悬液。台盼蓝(Sigma美国)测定细胞活性计数，调整细胞浓度至5×10 6 /ml。接种于放有盖玻片的24孔培养板内，置于37℃、5%CO 2 、95%湿度的培养箱内培养(Shellab美国)。培养贴壁2h后，弃培养液，用预冷的PBS洗涤培养孔，去除未贴壁的细胞，贴壁者即为巨噬细胞。
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1.2 实验分组和取材 取培养2h的巨噬细胞，随机分为以下6组:正常对照组(NG)、CRH刺激组(CRHG)、拮抗CRH-R1受体组(CPG)、拮抗CRH-R2受体组(CRG)、拮抗cAMP组(H89G)和拮抗PKA组(PKAG)。NG加入等体积的正常培养液;CRHG中加入含终浓度为10 -9 M的CRH(Calˉbiochem公司)的培养液 [2] ，CPG中加入含10 -9 M的CRH和5×10 -4 M的CP154526(辉瑞公司赠送)的培养液 [3] ，CRG的培养液中加入含10 -9 M的CRH和10 -6 M的CRH9-41(Calˉbiochem公司)的培养液 [4] ，H89G中加入含10 -9 M的CRH和10-6 M的H89(Calbiochem公司)的培养液 [5] ，PKAG中加入含10 -9 M的CRH和10 -4 M的PKA拮抗剂6-22(Calˉbiochem公司)的培养液 [6] ，分别于培养0.5h、1h、2h、4h和8h取培养细胞上清液和培养的巨噬细胞。
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1.3 CRH-R1、CRH-R2、P-PKA、P-CREB的免疫细胞化学染色 其中一抗工作液浓度分别为:CRH-R11:400;CRH-R21:400;P-PKA1:300;P-CREB1:300。二抗为生物素化山羊抗大鼠IgG(北京中山生物公司)，浓度为1:100。于显微镜下观察，以细胞膜或细胞核出现棕褐色颗粒为阳性判定标准。
1.4 TNF-α含量的测定 按TNF-α(Dlaclone，法国)试剂盒说明书测培养细胞上清液内TNF-α含量。
1.5 统计学处理 实验所得计量资料用均数±标准差表示(X±s)，采用SPSS10.0软件进行配对资料的t检验的统计学分析，P<0.05表示有明显统计学意义，P<0.01表示 有非常明显的统计学意义。
2 结果
, http://www.100md.com 在正常的巨噬细胞的胞浆内均有CRH-R1和CRH-R2两种受体分布，其阳性产物染色呈棕黄色颗粒，并在CRH刺激后着色加深，见图片1。正常的巨噬细胞胞浆内有P-PKA的浅黄色颗粒出现，而无P-CREB染色;CRH刺激后，细胞的胞浆、胞核内均有两者的棕黄色颗粒出现，并胞核染色均强于胞浆，尤其以P-CREB的细胞核膜深染，见图片2。
CRHG各时相点TNF-α的含量均显著高于正常对照组(P<0.01)，并随CRH的刺激时间延长，分别于1h和8h上升的幅度最大，于8h到达峰值(P<0.01)，见表1。
CPG和CRG分泌的TNF-α量无统计学差异，与NG之间也无统计学差异。但两组与CRHG有显著差异(P<0.01)，尤其在1h和8h抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的上升幅度最大，见表1。
H89能明显抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α，尤其在8h H89G明显低于NG和CRHG。另外，该组分泌的TNF-α明显低于PKAG分泌的量(P<0.01)，见表1。
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PKAG的巨噬细胞分泌的TNF-α明显高于其他各组(P<0.01)，为NG的4.8～15倍;为CRHG的2.4～12倍;其中在0.5h最为突出分别为NG的15倍，CRHG的12倍，见表1。
表1 不同拮抗剂对CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的影响 略
3 讨论
CRH主要是通过与CRH-R1受体或CRH-R2受体结合后通过Gs来激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)系统来传导信号，其中第二信使环腺苷一磷酸(Cyclic adenoˉsine monophosphate，CAMP)和cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response-element binding protein，CREB)是这一信号通路的关键环节 [7～9] 。在CRH对中枢神经细胞的信号通路的研究中，CRH-R1是主要的受体。但Agelaki等人利用体内和体外的模型发现在内毒素休克早期，CRH-R1受体被拮抗后，可以抑制内毒素诱导的巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的升高 [9] 。
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我们利用体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞和不同的拮抗剂来初步研究CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径。发现CRH-R1和CRH-R2两种受体均存在于巨噬细胞胞浆内，当CRH刺激后，胞浆内的两种受体表达明显增加。而CRH-R1受体拮抗剂CP154526和CRH-R2受体拮抗剂CRH9-41均能有效降低CRH刺激这两组的巨噬细胞 分泌TNF-α，尤其在上升幅度最大的两个时相点1h和8h最突出。这表明外源性的CRH的刺激信号是通过这两种受体传递的。
我们又发现cAMP的拮抗剂H89能有效地降低CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的能力，尤其是在CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α达到峰值的8h最显著，这提示cAMP是CRH信号途径的关键环节。免疫组化的结果发现:CRH刺激后原本在正常细胞不表达的P-CREB在细胞胞浆、胞核内出现，其中胞核染色深于胞浆，并有核膜深染的现象，这提示CRH可以刺激巨噬细胞表达P-CREB，并CREB可能有核内移的过程。故我们推测CRH通过两种受体将信号传给cAMP，活化的cAMP通过P-CREB将信号传入细胞核，作用于位于TNF-α基因的TATA盒上游的CREB结合位点，调节TNF-α的表达 [10～11] 。但实验结果中，在2～4h的时间段里cAMP的拮抗剂却增加巨噬细胞分泌TNF-α的能力，其原因有待进一步研究。
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另外，有趣的是PKA拮抗剂非常显著地增强了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的能力，在0.5h为正常组的15倍和CRH刺激组的12倍。免疫组化显示CRH刺激后，P-PKA表达增加并从胞浆内移入胞核，这提示PKA信号途径可能与CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制有关。
综上所述，我们的研究发现CRH的两种受体均参与了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径，并且第二信使cAMP是途径的关键环节，通过P-CREB将信号传入细胞核内，作用于位于TNF-α基因的TATA盒上游的CREB结合位点，调节TNF-α的表达。另外P-PKA途径可能是巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制过程。这些资料证明神经内分泌系统可以通过CRH在巨噬细胞活化和细胞因子产生的水平上直接影响免疫系统。目前CRH→CRH-R→cAMP→CREB→靶基因位点的信号途径具体环节仍不清楚，进一步研究可能为揭开中枢神经系统如何通过CRH等神经介质来调节外周免疫细胞产生效应的机制，为临床有效控制应激后的高细胞因子血症和减轻各种应激产生的过度免疫反应以及为治疗自身免疫性疾病提供新的方法。(本文图片略。)
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参考文献
1 司徒镇强，吴军正.细胞培养，西安:世界图书出版社，2000，181-182.
2 Lewis MW，Hermann GE，Rogers RC，et al.In vitro and in vivo analysis of the effects of corticotropin releasing factor on rat dorsal vagal comˉplex.J Physiol，2002，543(Pt1):135-146.
3 He L，Gilligan PJ，Zaczek R，et al.4-(1，3-Dimethoxyprop-2-ylamino)-2，7-dimethyl-8-(2，4-dichloropheny1)pyrazolo[1，5-a]-1，3，5-triazine:a potent，orally bioavailable CRF(1)receptor antagonist.:J Med Chem，2000，43(3):449-456.
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4 Reis FM，Luisi S，Florio P，et al.Corticotropin-releasing factor，uroˉ cortin and endothelin-1stimulate activin A release from cultured huˉman placentalcells.Placenta，2002，23(6)522-525.
5 Kasagi Y，Horiba N，Sakai K，et al.Involvement of cAMP-response elˉement binding protein in corticotropin-releasing factor(CRF)-inˉduced down-regulation of CRF receptor1gene expression in rat anteriˉor pituitary cells.J Neuroendocrinol，2002，14(7):587-592.
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6 Hillhouse EW，Grammatopoulos DK.Control of intracellular signalling by corticotropin-releasing hormone in human myometrium.Front Horm Res，2001，27:66-74.
7 Kasckow J，Mulchahey JJ，Aguilera G，et al.Corticotropin-releasing hormone
(CRH)expression and protein kinase A mediated CRH receptor signalling in an immortalized hypothalamic cell line.J Neuroendocsinol，2003，15(5)521-529.
8 Chen Y，Hatalski CG，Brunson KL，Baram TZ.Rapid phosphorylation of the CRE
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binding protein precedes stress-induced activation of the corˉticotropin relea
sing hormone gene in medial parvocellular hypothalamic neurons of the immature rat.:Brain Res Mol Brain Res，2001，96(1-2):39-49.
9 Agelaki S，Tsatsanis C，Gravanis A，et al.Corticotropin-releasing horˉmone augments proinflammatory cytokine production frommacrophages in vitro and in lipopolysaccharide-induced endotoxin shock in mice.Infect-Immun，2002，70(11):6068-6074.
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10 Wang W，Ji P，DowKE.Corticotropin-releasing hormone induces proˉliferation and TNF-alpha release in cultured rat microglia via MAP kinase signalling pathways.J Neurochem.2003，84(1):189-195.
11 Collins JS，Perry RT，Watson B Jr，et al.Association of a haplotype for tumor necrosis factor in siblings with late-onset Alzheimer disease:the NIMH Alzheimer Disease Genetics Initiative.:Am J Med Genet，2000，96(6):823-830.
作者单位:400042重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所
(收稿日期:2004-01-26)
(编辑 罗彬), 百拇医药