通用型ABO反定型试剂红细胞的研制
【摘要】 目的 研究可用于各种方法的通用型ABO反定型试剂红细胞。方法 观察SAN型保养液配制的通用型ABO反定型试剂红细胞的保存和应用效果。结果 这种新的保养液可于4℃保存试剂红细胞3个月，它在ABO反定型试验中敏感性高、特异性强，无抗原抗体免疫反应导致的溶血现象。结论 通用型ABO反定型试剂红细胞贮存时间长，可用于微量板等方法的ABO反定型试验，试验结果可靠。
关键词 试剂红细胞 保养液 微量板法 溶血
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)05-0579-02
The study of current model reagent of red blood cell in reverse ABO typing
Zhu Jianying，Sun Ainong，Luo Hongqing
, http://www.100md.com
Shaoguan Central Blood Station，Guangdong512026.
【Abstract】 Objective To develop a current model reagent of red blood cell(RBC)in reverse ABO typing for ways and means.Methods Observing application of SAN reagent RBC preservative solution formulated current model reagent of RBC in reverse ABO typing and storage.Results This new reagent RBC can be stored for3mnths on4℃.Its sensitivity and specificity are high，it did not lead hemolysis of antigen-antibodies reaction.Conclusion The curˉrent model reagent of RBC in reverse ABO typing that can be stored for a long time，and can be used for microp
, 百拇医药
late method and so on，the testing result are reliable.
Key words reagent red blood cell preservative solution microplate method hemolysis
ABO血型是供、受血者必做项目，仅用单克隆试剂进行ABO正定型的试验结果不可靠 [1～4] ，需要采用ABO反定型试验来验证 [3，4] 。普通保养液或生理盐水配制的试剂红细胞，在ABO反定型试验中会出现一些溶血、弱凝集现象(尤其是微量板法)，导致许多结果无法判断。盐水法交叉配血试验是重要的红细胞相容性试验，在ABO不相溶的配血时也可出现溶血、弱凝集，甚至假阴性(前带现象)，严重干扰试验结果的报告 [2，5] 。为了保证ABO反定型试验和盐水法配血试验结果准确可靠，我们合作研制了定名为SAN型的试剂红细胞保养液，并配制成“通用型ABO反定型试剂红细胞”(由中山市红十字中心血站在广东省卫生厅立项)，用于各种方法的反定型试验，现报告如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 通用型ABO反定型试剂红细胞保养液(即“SAN液”)的制备 NaCl、葡萄糖、肌苷、腺嘌呤、EDTA钠盐、促凝剂适量，加蒸馏水溶解后调节pH值为6.8～6.9，抑菌剂为氯霉素和硫酸新霉素。
1.1.2 对照保养液 改良Alsever液 [2] 和AS-3液 [6] 均采用经典配方自配，另外商品化试剂红细胞保养液分别购自国内两个著名血液中心。
1.1.3 试剂红细胞悬液 4人以上A、B、O同型献血员新鲜的红细胞混合，用生理盐水洗涤二遍，接着用相应的保养液洗涤一遍，最后用该保养液配成所需浓度的红细胞悬液(应用液)，4℃贮存备用。
1.1.4 血清标本 收集采血后4℃贮存12h以内且未出现溶血的献血员血清。当时室温变化为23℃～29℃。
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1.1.5 人源抗A、B、D、C、c、E、e抗血清及抗人球蛋白 分别由本站制备和日本东京红十字血液中心及英国伦敦血液中心提供。
1.2 方法
1.2.1 微量板法 1滴(25～30μl)A或B或O型2.5%～3.5%浓度左右的试剂红细胞悬液与1滴受检者血清置96孔微量板中混匀，20℃～37℃孵育1～60min，离心并用微型振荡器悬浮压积的红细胞，肉眼观察或酶标仪—计算机系统判读并打印结果。若无悬挂微量板的离心机，则孵育时间必须超过15min。
1.2.2 纸片法、瓷片法、磁盘法 1滴(25～30μl)A或B或O型2.5%～3.5%浓度左右的试剂红细胞悬液与1滴受检者血清置纸片、瓷片、磁盘上混匀，在室温或37℃温箱中孵育，15min内观察凝集情况。
2 结果
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2.1 通用型ABO试剂红细胞贮存期间溶血及外观变化 分别取SAN液及对照生理盐水、改良Alsever液、AS-3液及两个血液中心供应的三批商品化保养液配制的A、B、O型各2份供血者红细胞悬液于4℃贮存，定期肉眼观察红细胞变化。结果显示红细胞最早出现溶血或发黑的时间分别是:生理盐水中为3～6天，改良Alsever液中为5周，AS-3液中为7周，三批商品化保养液品为5～12周，SAN液为14周。同时用邻-甲联苯胺法和氯丙嗪法，测得SAN液保存的红细胞在4℃贮存期间游离血红蛋白变化为:0～13周时小于40mg/L(正常人参考值范围)，14～28周为50～79mg/L，1年后红细胞呈暗红色，但仍然未全部溶血。
2.2 红细胞抗原在贮存期间的变化取新鲜采集献血者的A、B、O型红细胞一批，用SAN液配置成悬液，4℃贮存，每周检测人源抗A、B、D、C、c、E、e抗体效价(试管盐水法、抗球蛋白法)，结果显示14周内上述抗体效价无明显变化。贮存12个月时仍可检测到红细胞上ABO抗原。
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2.3 不同介质悬浮的红细胞在微量板法中比较 分别取SAN液和生理盐水、改良Alsever液、AS-3液及两个血液中心供应的三批商品化保养液配制的A、B、O型试剂红细胞悬液，与128份已知ABO血型的随机献血者血清混匀(即ABO反定型)，微量板置37℃温箱中孵育30min后再离心观察结果。试验显示:SAN液中的A(B)型红细胞与献血者血清中相应抗-A(B)全部呈强凝集(4+～4±)!无任何溶血现象，无假凝集，其血型检测的结果同供者已知血型符合;其它所有介质配制的A(B)型红细胞与相应抗-A(B)反应都存在一些(16例以上)溶血和弱凝集现象，严重干扰结果的正确判断，尤其生理盐水配制红细胞导致溶血和弱凝集现象最为严重，竟有39例。随后以室温条件代替37℃中孵育，重复上述128份标本的ABO反定型，结果室温下SAN液配制的红细胞同37℃条件试验结果一致，其它所有介质配制的红细胞在试验中仍然出现溶血和弱凝集现象，只是发生频率较37℃时降低。显然SAN液配制的红细胞在试验中敏感性高。
2.4 不同介质悬浮的红细胞在纸(玻)片法、瓷片法、磁盘(板)法中的应用 取SAN液和生理盐水、改良Alsever液、AS-3液配制的A和B型红细胞，分别在纸片、玻璃片、瓷板、瓷砖、磁盘(板)上对120例A、B、O型供血者血清，进行ABO反定型，结果SAN液介质中仅1例出现弱凝集1+，余下标本均呈3+～4+，无一例溶血;而其它介质中均出现较多(9～21例)弱凝集1+，且有溶血现象。
, 百拇医药
2.5 实际应用情况 自1998年9月起至今，将SAN液配制的通用型ABO试剂红细胞，供应有关医院检验科，反应良好，多次检出不规则抗体和异常血型。
3 讨论
抗-A(B)和相应抗原红细胞结合后激活补体，在体内或体外引起溶血。血型血清学试验补体的激活需钙、镁离子参加，因此国外用EDTA钾盐溶液络合钙、镁离子，消除溶血的干扰，但红细胞只能当天使用 [2，5] 。经反复研究，我 们采用国内市场易购且络合金属离子较强的EDTA钠盐和促凝剂及其它试剂组成的SAN液悬浮红细胞，同样能防止补体被激活，并且既增强试验敏感性，又能长期保存红细胞。
EDTA不仅防止补体激活，还可以防止高效价抗-A(B)在ABO反定型时出现的前带现象(不凝集，即假阴性) [5] 。试验表明抗-A(B)溶血活性随孵育时间延长和温度升高而增强，它能造成红细胞弱凝集，假阴性、溶血，严重干扰血型血清学试验结果的判定 [5] 。
, 百拇医药
关于试剂红细胞保养液(包括将红细胞醛化后保存)的研究国内外一直很热门，曾有多篇的报道 [6] ，但由于未考虑补体被激活的影响，因而所配制的红细胞均不适合用于盐水法配血试验和微量板法ABO反定型，这也是为什么国内许多采供血机构虽然引进了先进的微量板法自动化加样设备，却未开展ABO反定型试验的原因。我们的SAN液中含有丰富能量物质葡萄糖、肌苷、腺嘌呤，从而保证了细胞代谢能源所需，达到延长红细胞寿命的目的。
SAN液所配制的通用型ABO反定型试剂红细胞，4℃保存长达3个月，易悬浮，可用于微量板法、纸(玻)片法、瓷片法、磁盘(板)法进行的ABO反定型试验，并能接受已经溶血标本的检测，避免重新采血样而耽误时间，适合手工和自动化仪器系统检测。
参考文献
1 ScottML，Voak D.Detection of acquired B antigen by monoclonal anti-B blood grouping reagents.Transfusion，1997，37(1):103.
, 百拇医药
2 Judd WJ.Methods in immunohematology.2nd edition.USA:Montgomery Scientific Publications，1994，Ⅶ-Ⅷ，14-15，184-186.
3 孙爱农，吴晓燕.单克隆试剂导致ABO血型初探.中国输血杂志，1999，12(3):157.
4 孙爱农，孙星河，吴晓燕.单克隆试剂导致ABO定型假阳性结果的观察.广东医学，2000，21(12):1053.
5 Shulman IA，Calderon C.Effect of delayed centrifugation or reading on the detection of ABO incompatibility by the immediate-spin crossˉmatch.Transfusion，1991，31(3):197.
6 SimonTL，Marcus CS，Myhre BA，et al.Effectcs of AS-3nutrient-adˉditive solution on42and49days of storage of red cells.Transfusion，1987，27(2):178.
作者单位:1 512026广东省韶关市中心血站
2 广东省中山市中心血站
(收稿日期:2004-01-08)
(编辑 秋实), 百拇医药
关键词 试剂红细胞 保养液 微量板法 溶血
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)05-0579-02
The study of current model reagent of red blood cell in reverse ABO typing
Zhu Jianying，Sun Ainong，Luo Hongqing
, http://www.100md.com
Shaoguan Central Blood Station，Guangdong512026.
【Abstract】 Objective To develop a current model reagent of red blood cell(RBC)in reverse ABO typing for ways and means.Methods Observing application of SAN reagent RBC preservative solution formulated current model reagent of RBC in reverse ABO typing and storage.Results This new reagent RBC can be stored for3mnths on4℃.Its sensitivity and specificity are high，it did not lead hemolysis of antigen-antibodies reaction.Conclusion The curˉrent model reagent of RBC in reverse ABO typing that can be stored for a long time，and can be used for microp
, 百拇医药
late method and so on，the testing result are reliable.
Key words reagent red blood cell preservative solution microplate method hemolysis
ABO血型是供、受血者必做项目，仅用单克隆试剂进行ABO正定型的试验结果不可靠 [1～4] ，需要采用ABO反定型试验来验证 [3，4] 。普通保养液或生理盐水配制的试剂红细胞，在ABO反定型试验中会出现一些溶血、弱凝集现象(尤其是微量板法)，导致许多结果无法判断。盐水法交叉配血试验是重要的红细胞相容性试验，在ABO不相溶的配血时也可出现溶血、弱凝集，甚至假阴性(前带现象)，严重干扰试验结果的报告 [2，5] 。为了保证ABO反定型试验和盐水法配血试验结果准确可靠，我们合作研制了定名为SAN型的试剂红细胞保养液，并配制成“通用型ABO反定型试剂红细胞”(由中山市红十字中心血站在广东省卫生厅立项)，用于各种方法的反定型试验，现报告如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 通用型ABO反定型试剂红细胞保养液(即“SAN液”)的制备 NaCl、葡萄糖、肌苷、腺嘌呤、EDTA钠盐、促凝剂适量，加蒸馏水溶解后调节pH值为6.8～6.9，抑菌剂为氯霉素和硫酸新霉素。
1.1.2 对照保养液 改良Alsever液 [2] 和AS-3液 [6] 均采用经典配方自配，另外商品化试剂红细胞保养液分别购自国内两个著名血液中心。
1.1.3 试剂红细胞悬液 4人以上A、B、O同型献血员新鲜的红细胞混合，用生理盐水洗涤二遍，接着用相应的保养液洗涤一遍，最后用该保养液配成所需浓度的红细胞悬液(应用液)，4℃贮存备用。
1.1.4 血清标本 收集采血后4℃贮存12h以内且未出现溶血的献血员血清。当时室温变化为23℃～29℃。
, 百拇医药
1.1.5 人源抗A、B、D、C、c、E、e抗血清及抗人球蛋白 分别由本站制备和日本东京红十字血液中心及英国伦敦血液中心提供。
1.2 方法
1.2.1 微量板法 1滴(25～30μl)A或B或O型2.5%～3.5%浓度左右的试剂红细胞悬液与1滴受检者血清置96孔微量板中混匀，20℃～37℃孵育1～60min，离心并用微型振荡器悬浮压积的红细胞，肉眼观察或酶标仪—计算机系统判读并打印结果。若无悬挂微量板的离心机，则孵育时间必须超过15min。
1.2.2 纸片法、瓷片法、磁盘法 1滴(25～30μl)A或B或O型2.5%～3.5%浓度左右的试剂红细胞悬液与1滴受检者血清置纸片、瓷片、磁盘上混匀，在室温或37℃温箱中孵育，15min内观察凝集情况。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 通用型ABO试剂红细胞贮存期间溶血及外观变化 分别取SAN液及对照生理盐水、改良Alsever液、AS-3液及两个血液中心供应的三批商品化保养液配制的A、B、O型各2份供血者红细胞悬液于4℃贮存，定期肉眼观察红细胞变化。结果显示红细胞最早出现溶血或发黑的时间分别是:生理盐水中为3～6天，改良Alsever液中为5周，AS-3液中为7周，三批商品化保养液品为5～12周，SAN液为14周。同时用邻-甲联苯胺法和氯丙嗪法，测得SAN液保存的红细胞在4℃贮存期间游离血红蛋白变化为:0～13周时小于40mg/L(正常人参考值范围)，14～28周为50～79mg/L，1年后红细胞呈暗红色，但仍然未全部溶血。
2.2 红细胞抗原在贮存期间的变化取新鲜采集献血者的A、B、O型红细胞一批，用SAN液配置成悬液，4℃贮存，每周检测人源抗A、B、D、C、c、E、e抗体效价(试管盐水法、抗球蛋白法)，结果显示14周内上述抗体效价无明显变化。贮存12个月时仍可检测到红细胞上ABO抗原。
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2.3 不同介质悬浮的红细胞在微量板法中比较 分别取SAN液和生理盐水、改良Alsever液、AS-3液及两个血液中心供应的三批商品化保养液配制的A、B、O型试剂红细胞悬液，与128份已知ABO血型的随机献血者血清混匀(即ABO反定型)，微量板置37℃温箱中孵育30min后再离心观察结果。试验显示:SAN液中的A(B)型红细胞与献血者血清中相应抗-A(B)全部呈强凝集(4+～4±)!无任何溶血现象，无假凝集，其血型检测的结果同供者已知血型符合;其它所有介质配制的A(B)型红细胞与相应抗-A(B)反应都存在一些(16例以上)溶血和弱凝集现象，严重干扰结果的正确判断，尤其生理盐水配制红细胞导致溶血和弱凝集现象最为严重，竟有39例。随后以室温条件代替37℃中孵育，重复上述128份标本的ABO反定型，结果室温下SAN液配制的红细胞同37℃条件试验结果一致，其它所有介质配制的红细胞在试验中仍然出现溶血和弱凝集现象，只是发生频率较37℃时降低。显然SAN液配制的红细胞在试验中敏感性高。
2.4 不同介质悬浮的红细胞在纸(玻)片法、瓷片法、磁盘(板)法中的应用 取SAN液和生理盐水、改良Alsever液、AS-3液配制的A和B型红细胞，分别在纸片、玻璃片、瓷板、瓷砖、磁盘(板)上对120例A、B、O型供血者血清，进行ABO反定型，结果SAN液介质中仅1例出现弱凝集1+，余下标本均呈3+～4+，无一例溶血;而其它介质中均出现较多(9～21例)弱凝集1+，且有溶血现象。
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2.5 实际应用情况 自1998年9月起至今，将SAN液配制的通用型ABO试剂红细胞，供应有关医院检验科，反应良好，多次检出不规则抗体和异常血型。
3 讨论
抗-A(B)和相应抗原红细胞结合后激活补体，在体内或体外引起溶血。血型血清学试验补体的激活需钙、镁离子参加，因此国外用EDTA钾盐溶液络合钙、镁离子，消除溶血的干扰，但红细胞只能当天使用 [2，5] 。经反复研究，我 们采用国内市场易购且络合金属离子较强的EDTA钠盐和促凝剂及其它试剂组成的SAN液悬浮红细胞，同样能防止补体被激活，并且既增强试验敏感性，又能长期保存红细胞。
EDTA不仅防止补体激活，还可以防止高效价抗-A(B)在ABO反定型时出现的前带现象(不凝集，即假阴性) [5] 。试验表明抗-A(B)溶血活性随孵育时间延长和温度升高而增强，它能造成红细胞弱凝集，假阴性、溶血，严重干扰血型血清学试验结果的判定 [5] 。
, 百拇医药
关于试剂红细胞保养液(包括将红细胞醛化后保存)的研究国内外一直很热门，曾有多篇的报道 [6] ，但由于未考虑补体被激活的影响，因而所配制的红细胞均不适合用于盐水法配血试验和微量板法ABO反定型，这也是为什么国内许多采供血机构虽然引进了先进的微量板法自动化加样设备，却未开展ABO反定型试验的原因。我们的SAN液中含有丰富能量物质葡萄糖、肌苷、腺嘌呤，从而保证了细胞代谢能源所需，达到延长红细胞寿命的目的。
SAN液所配制的通用型ABO反定型试剂红细胞，4℃保存长达3个月，易悬浮，可用于微量板法、纸(玻)片法、瓷片法、磁盘(板)法进行的ABO反定型试验，并能接受已经溶血标本的检测，避免重新采血样而耽误时间，适合手工和自动化仪器系统检测。
参考文献
1 ScottML，Voak D.Detection of acquired B antigen by monoclonal anti-B blood grouping reagents.Transfusion，1997，37(1):103.
, 百拇医药
2 Judd WJ.Methods in immunohematology.2nd edition.USA:Montgomery Scientific Publications，1994，Ⅶ-Ⅷ，14-15，184-186.
3 孙爱农，吴晓燕.单克隆试剂导致ABO血型初探.中国输血杂志，1999，12(3):157.
4 孙爱农，孙星河，吴晓燕.单克隆试剂导致ABO定型假阳性结果的观察.广东医学，2000，21(12):1053.
5 Shulman IA，Calderon C.Effect of delayed centrifugation or reading on the detection of ABO incompatibility by the immediate-spin crossˉmatch.Transfusion，1991，31(3):197.
6 SimonTL，Marcus CS，Myhre BA，et al.Effectcs of AS-3nutrient-adˉditive solution on42and49days of storage of red cells.Transfusion，1987，27(2):178.
作者单位:1 512026广东省韶关市中心血站
2 广东省中山市中心血站
(收稿日期:2004-01-08)
(编辑 秋实), 百拇医药