自体骨髓干细胞治疗心肌梗死的新进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)05-0604-03
尽管目前的药物和介入治疗有效干预了急性心肌梗死的发生和预后，但它的转归一直使我们束手无策。坏死的心肌无法再生，依靠纤维母细胞增生修复，形成的纤维瘢痕替代原心肌组织，功能丧失，最终不可避免地发展为心力衰竭。现有的治疗手段有限，心脏移植又受到长期免疫抑制、感染机会多、供体来源不足、死亡率高等诸多因素的限制，干细胞移植越来越受到关注。
干细胞根据来源分为胚胎干细胞(ESCs)和成体干细胞。当受精卵分裂发育为囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。成体干细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，组织类型非常广泛，和心肌细胞有关有骨髓造血干细胞、外周血干细胞、脐血干细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌卫星细胞(SCs)等。目前，研究最多的用于治疗心肌梗死的干细胞有胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞和骨髓干细胞(Bone marrow stem cell，BMSc)。
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在基础研究方面，可以说三者在技术方法、成果等各个方面均取得了重大突破。但由于前两者的某些缺陷，如ESCs的细胞来源困难及免疫抑制问题、SCs很难获得足够的细胞数量及移植后是否会形成异位兴奋点等在短期内不易解决，因此BMSc最被看好，且临床应用前景颇为乐观。现就骨髓干细胞移植的最新成果、进展着重阐述。
1 骨髓干细胞的分类及特点
混合骨髓的干细胞成分中除造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)外，还有骨髓基质中能分化为多种间质成分的干细胞———间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs主要来源骨髓，人们还从脐带血和外周血中及其它组织中分离得到MSCs。此外，骨髓干细胞的某些亚群在适当条件下可诱导分化为心肌细胞或内皮细胞。目前用于移植的自体骨髓干细胞主要包括:MSCs、骨髓单个核细胞(MNCs)、HSCs、内皮祖细胞、SP细胞、CD34+/-、Lin-c-kit pos 细胞等。
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1.1 骨髓间充质干细胞 MSCs是各种间质细胞的前体细胞，具有很强的增殖能力和多向分化潜能。Liechty KW等将成人MSCs移植入羊子宫后，发现MSCs原位特异性分化为骨骼、软骨、肌腱、骨骼基质、肌肉和心肌细胞 [1] 。MSCs尽管含量仅2～5个/10 6 单个核细胞，但可体外扩增十亿倍而不丧失干细胞活性。
2000年Wang JS等 [2] 观察到MSCs具有微环境依赖性分化，移植4周后开始表达肌球蛋白重链、收缩蛋白等成心肌细胞表型，形成缝隙连接，MSCs能够向心肌样细胞分化并可能替代宿主心肌细胞。Toma C等 [3] 也证实了人类MSC分化为心肌细胞的表型水平和与宿主心肌的水平相一致(如肌丝蛋白，β肌球蛋白重链、α肌动蛋白、肌动蛋白T、肌钙蛋白T、受磷蛋白)。Wang JS等 [4] 在2001进一步证实经冠脉循环移植的MSCs也能够定居心脏并分化为心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞三种细胞系。Shake J等 [5] 建立猪的心肌梗死模型后，将标记有Di-Ⅰ的自体骨髓间充质干细胞注射入梗死心肌，每周检测血液动力学和心功能，2周后可检测到心肌特异蛋白，4周后心收缩功能改善、室壁变薄减轻，免疫组化显示移植细胞移入并分化为心肌细胞。
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研究表明，MSC分泌多种炎症细胞因子，如白介素-1和肿瘤坏死因子-α和生长因子，如碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、angiopoietin-1 [6] ，在干细胞分化成心肌细胞及血管内皮中发挥积极作用。
1.2 骨髓造血干细胞 HSC除了具有重建受体造血与免疫功能外，在体外及体内经诱导可向非细胞系列分化。1999年证实造血干细胞可起到成心肌细胞和内皮祖细胞的作用。
2001年有两个研究小组报道了骨髓造血干/祖细胞在不同的条件下可分化为心肌细胞。他们将绿色荧光蛋白(GFP)阳性的转基因雄性小鼠Lin(-)c-kit + 和CD34 - /low c-kit + Sca-1 + 的骨髓造血干/祖细胞注射到梗死心肌附近。Orlic D等 [7，8] 在存活的受体小鼠梗死部位发现了带状新生细胞群，细胞中含多种心肌细胞特异蛋白，如肌球蛋白、转录因子GATA-4、连结蛋白43等。GFP + 和Y染色体阳性提示该新生细胞群是由移植的Lin(-)c-kit + 骨髓造血干/祖细胞分化生成。结果证实受损的心肌功能得到了部分恢复。Jackson KA [9] 等将CD34 - /low c-kit + Sca-1 + HSCs(所谓的SP细胞)移植给受致死性照射的小鼠，再行冠脉结扎60min后再通。结果发现，分化的心肌细胞首先出现在梗死区周围，约占总数的0.02%，并有LacZ和α肌动蛋白的表达而无FIT-1基因表达(FIT-1是内皮细胞的标志，在SP干细胞中缺乏)，证明了HSCs的心肌再生潜能。
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1.3 其它干细胞亚群 SP细胞、CD34 - 、Lin(-)c-kit + 细胞已如前述。此外，成人骨髓中包含的内皮祖细胞(EPCs)，能直接诱导实验性心肌梗死灶的新血管形成和受损的血管系统再生。新血管形成使梗死区周围过度肥大的心肌细胞凋落、有活力的心肌长期获救、胶原沉积减少和心功能持续改善。
骨髓中的CD34 + 细胞在体外分化为内皮细胞，在体内诱导分化为小血管内皮并能分泌一些生长因子，把CD34 + 骨髓细胞注射到DA鼠模型的缺血心肌内，6天后证实微血管的密度明显增加。
1.4 骨髓单个核细胞 MNCs集成了所有的骨髓干细胞成份。Kamihata H等发现通过MNCs移植分泌促血管生成因子和细胞激素并整合新生血管灶，可改善局部血流和心功能，减小梗死面积，且不会引起纤维增生和成骨等副效应 [6] 。植入经体外扩增的EPCs或MN CD34 + 细胞(即HSCs)可促进新血管再生和阻止缺血心肌的过度肥大 [10] ;植入非造血系骨髓细胞(即间充质干细胞)，则在缺血心肌组织中分化为心肌细胞和血管结构，新分化的心肌细胞占心室梗死部分的68%，明显改善缺血性心脏病的预后。
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2 骨髓干细胞移植实践
2.1 骨髓干细胞移植的原理 干细胞移植改善心肌梗死的机制包括:(1)一定的微环境下分化为心肌细胞，替代原有的受损心肌减少瘢痕组织的形成;(2)分化为血管内皮细胞，促进新血管发生和原有血管的再生，从而改善缺血心肌的血供;(3)再生心肌细胞与原宿主细胞形成细胞间连接，直接参与心脏的同步收缩;(4)移植细胞分泌促血管生成因子和一些炎症因子，启动和调节新血管发生;(5)功能性心肌细胞增加，提高心脏的顺应性，改善心室重塑，使射血分数增加，心功能改善。
2.2 骨髓干细胞模型 Fukuda K从鼠的骨髓基质中分离出了成心肌细胞系(Cardiomyogenic cell line，CMG细胞系) [11] 。间质细胞永生化，经5—氮胞苷处理，筛检出自搏细胞，其中30%1周后形成肌管样结构，2周后开始自发搏动，3周出现同步搏动，这些细胞表达心钠素和脑钠素，显示出心肌样的超微结构，如肌节和心房颗粒，产生窦房结样或心室细胞样的动作电位，同源收缩蛋白基因分析提示它们和胎儿的心室肌细胞具有相似的表型。该细胞系为研究提供了有力的模型。
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2.3 细胞移植的途径 目前干细胞移植的途径主要包括心肌内注射和血管内移植。较早期的实验多采取心肌内直接注射的方式，开胸后经心外膜注射到梗死心肌边缘，或冠状动脉旁路术(CABG)或换瓣时注射，也有人通过胸腔镜向心肌注射或经心内膜注射。因手术相对较大增加移植的危险性、须多点注射增加了对心肌损伤、对手术条件要求高等使它存在一定局限，但因为效果可靠，所以延用至今。血管内移植有很多途径，最早人们将主动脉暂时结扎后向心室腔内注入干细胞，但因转移干细胞效率不高，现多采用经冠状动脉导管选择性冠脉内注射 [12] 。移植细胞呈点状或线状分布于缺血冠状血管支配的心肌各层，较心肌内注射更有利于心肌细胞的保护。血管内注射后移植细胞的迁徙机制尚不完全清楚，有人推测因为干细胞有迁徙性，它们可能是游走出血管从正常区域移行到梗死区;另一种解释是心肌梗死的瘢痕并非完全是坏死组织，有研究发现梗死心肌组织的微血管网功能可部分恢复。
2.4 剂量与时间窗 移植细胞的数量因干细胞种类不同而异，多数实验常在10 4 ～10 8个，以10 5 ～10 6 个为多。移植时机长短不一，短到梗死模型建立后即刻行细胞移植，梗死后1周的也有甚至更长。理论上说，移植越早对心肌梗死的预后改善越有利，多数实验先提取、纯化骨髓，再制成心梗模型，可在数小时内行干细胞移植。但从临床应用的角度来看是不够现实，因为单是纯化骨髓就需1天的时间，如果还要有其它处理，如基因改造可能需要更长的时间。所以要寻求一个合适的时间窗，既可完成干细胞制备，又不至晚到影响移植的效果。
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2.5 细胞识别和效果评价方法 供体细胞移植后的探知和识别很关键。常用的技术包括:通过比色法探知β-牛乳糖、抗体标记、通过荧光显微镜探知GFP和原位杂交探知Y染色体。
目前评价的指标包括:(1)供体来源成活细胞的数量和分化后的心肌细胞的数量及所占的比重;(2)新生毛细血管 密度、供体来源内皮细胞的数量;(3)心功能评估，如局部心肌血流量、射血分数、左室舒张末期容积、室壁活动能力等;(4)选择性冠状动脉造影及血管超声，判定冠脉血流及侧支循环的建立情况;(5)相关的细胞因子及促血管生成因子的检测，以判定干细胞的自我更新及分化活性。
2.6 基础研究向临床试验过渡 Hammano等 [13] 于2001年为5例冠心病外科搭桥手术患者术中植入自体骨髓细胞，3例心肌灌注明显改善，未发现有害变化。Assmus B等 [12]于2002年入选20例急性心梗患者进行骨髓干细胞和外周血干细胞移植的对比研究，移植后两组心脏功能、冠脉血流储备有明显改善，两组之间无统计学差异。Strauer等 [14] 于2002年经冠状动脉骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死，左室造影显示细胞移植无运动区明显缩小，心功能指标明显改善。2003年1月Stamm C等 [15] 为6例行搭桥术的心梗患者行自体AC133 + (含CD34 - )干细胞心肌内注射，Tse H-F等 [16] 为8例严重冠心病患者经导管移植自体MNCs，症状、心肌灌注、心功能均有明显改善，也证明了治疗安全性。我国高连如等也对4例急性心肌梗死患者行冠脉成形术同时冠脉内注入MNCs，PET示梗死区缩小
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、心功能改善。
2.7 基因治疗在干细胞治疗中的应用 转基因技术结合于干细胞移植研究中，可以促进心肌细胞转化、替代或修复损伤心肌和诱导新血管发生。基因转导媒介包括病毒基因(逆转录Vir、腺Vir、AAV、HVJ)、脂蛋白、质粒DNA。人们应用BMC或MSCs注入缺血心肌尽管取得了有限的成功，但因移植的干细胞生存能力差、保持活性的能力差、受损部位血流不足，以至许多干细胞死亡，没有足够的细胞再生和修复心脏组织。基因工程改造后的干细胞有望克服这种缺陷。Yang Y等将转导了VEGF cDNA的干细胞进行移植，结果心梗区域的血管数量及心脏功能改善的程度比单纯干细胞移植组明显增加 [17] 。2003年8月Nat Med上发表了Brigham和Czau等完成的基因工程改造干细胞的新研究，将小鼠的BMC进行基因改造，以病毒为载体在干细胞中加入一个单肽的Akitl，阻断引发细胞凋亡的信号。Akitl被激活，受损部位的干细胞存活且比改造前有更足够的时间分化为心肌细胞，2周后小鼠心功能恢复正常。Murry博士强调:将基因治疗和干细胞移植结合能大大提高控制细胞行为的能力，是一个有发展的研究方向。
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3 小结与展望
目前研究中尚存在一些问题:(1)干细胞分化机制与条件不完全清楚，限制了对分化调控的深入研究;(2)目前多采用单个核细胞或间充质干细胞，但哪种干细胞类型更适宜移植，通过什么方法分离纯化，都没有统一的说法;(3)供体细胞的生存时间过短，如何能延长寿命保证充分分化为心肌细胞，使心脏功能持续改善;(4)细胞识别及分化鉴定问题，尚没有统一可靠的方法，尤其临床试验中尚无安全准确的示踪技术;(5)细胞移植时机的问题，因为纯化干细胞约需1天的时间，急性心肌梗死却需要快速的救治;(6)关于干细胞移植的安全性问题，特别是基因技术应用后，是否有机会增加转化为癌细胞的机会还不知道;(7)临床研究干细胞移植常与CABG和PTCA同时进行，其独立作用尚无法评估，需要进一步的对照研究 [17] ;(8)转基因技术要解决好包括可调控性、长期表达、传递策略、临床试验设计、结果判定标准等问题才能取得实质性的进步。
尽管诸多问题需解决，但BMC移植的临床应用潜力是巨大的。Rosen的小组正致力于用细胞治疗向心脏呈递基因，来改善心脏的电脉冲、产生生物起搏器来替代机械起搏器的技术研究。有理由相信:自体骨髓的干细胞移植可能有一天会成为治疗损伤或病变心脏的常规，并最终免除心脏移植的必要。
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参考文献
1 Liechty K W，MacKenzie T C，Shaaban A F，et al.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transpla ntation in sheep.Nat Med，2000，6(11):1282-1286.
2 Wang J S，ShumTim D，Galipeau J，et al.Marrow stromal cells for celluˉlar cardiomyoplasty:feasibility and potential clinical advantages.J Thoˉrac Cardiovasc Surg，2000，120(5):999-1005.
3 Toma C，Pittenger M F，Cahill K S，et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation，2002，105(1):93-98.
, http://www.100md.com
4 Wang J S，ShumTim D，Chedrawy E，Chiu R C.The cornoary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration:pathophysiologic and therapeutic implications.J Thorac Cardiovasc Surg，2001，122(4):699-705.
5 Shake JG，Gruber PJ，Baumgartner WA，et al.Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model:engraftment and funcˉtional effects.AnnThorac Surg，2002，73(6):1919-1925，1926.
6 Kamihata H，Matsubara H，Nishiue T，et al.Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfuˉsion and regional function via side supply of angioblasts，angiogenic ligˉands，and cytokines.Circulation，2001，104(9):1046-1052.
, 百拇医药
7 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice.Ann N Y Acad Sci，2001，938:221-230.
8 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells reˉpair the infarcted heart，improving function and survival.Proc Natl Acad SciU S A，2001，98(18):10344-10349.
9 Jackson K A，Majka S M，Wang H，et al.Regeneration of ischemic carˉdiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells.J Clin Invest，2001，107(11):1395-1402.
, http://www.100md.com
10 Kocher A A，Schuster M D，Szabolcs M J，Takuma S，et al.Neovascuˉlarization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents car diomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function.Nat Med，2001，7(4):430-436.
11 Fukuda K.Development of regenerative cardiomyocytes frommesenchyˉmal ste
m cells for cardiovascular tissue engineering.Artif Organs，2001，25(3):187-19
, http://www.100md.com
3.
12 Assmus B，Schachinger V，Teupe C，Britten M，et al.Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial inˉfarction(TOPCARE-AMI).Circulation，2002，106(24):3009-3017.
13 Hamano K，Nishida M，Hirata K，Mikamo A，et al.Local implantation of auto
logous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease:clinical trial and preliminary results.Jpn Circ J，2001，65(9):845-847.
, 百拇医药
14 Strauer BE，BrehmM，Zeus T，et al.Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans.Circulation，2002，106:online.
15 Stamm C，Westphal B，Kleine H D，Petzsch M，et al.Autologous bone marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration.Lancet，2003，361(9351):45-46.
16 Tse H F，Kwong Y L，Chan JKF，Lo Gladys，et al.Angiogenesis in isˉchemicmyocardium by intramyocardial autolgous bone marrowmononuˉclear cell implantation.Lancet，2003，361(9351):47-49.
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17 Yang Y，Min J Y Rana J S Ke Q，Cai J，Chen Y，et al.VEGF enhances functional improvement of postinfarcted hearts by transplantation of ESC-differentiated
cells.J Appl Physiol，2002，93(3):1140-1151.
作者单位:100036北京空军总医院心血管内科
(收稿日期:2004-02-04)
(编辑 小川), http://www.100md.com
尽管目前的药物和介入治疗有效干预了急性心肌梗死的发生和预后，但它的转归一直使我们束手无策。坏死的心肌无法再生，依靠纤维母细胞增生修复，形成的纤维瘢痕替代原心肌组织，功能丧失，最终不可避免地发展为心力衰竭。现有的治疗手段有限，心脏移植又受到长期免疫抑制、感染机会多、供体来源不足、死亡率高等诸多因素的限制，干细胞移植越来越受到关注。
干细胞根据来源分为胚胎干细胞(ESCs)和成体干细胞。当受精卵分裂发育为囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。成体干细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，组织类型非常广泛，和心肌细胞有关有骨髓造血干细胞、外周血干细胞、脐血干细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌卫星细胞(SCs)等。目前，研究最多的用于治疗心肌梗死的干细胞有胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞和骨髓干细胞(Bone marrow stem cell，BMSc)。
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在基础研究方面，可以说三者在技术方法、成果等各个方面均取得了重大突破。但由于前两者的某些缺陷，如ESCs的细胞来源困难及免疫抑制问题、SCs很难获得足够的细胞数量及移植后是否会形成异位兴奋点等在短期内不易解决，因此BMSc最被看好，且临床应用前景颇为乐观。现就骨髓干细胞移植的最新成果、进展着重阐述。
1 骨髓干细胞的分类及特点
混合骨髓的干细胞成分中除造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)外，还有骨髓基质中能分化为多种间质成分的干细胞———间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs主要来源骨髓，人们还从脐带血和外周血中及其它组织中分离得到MSCs。此外，骨髓干细胞的某些亚群在适当条件下可诱导分化为心肌细胞或内皮细胞。目前用于移植的自体骨髓干细胞主要包括:MSCs、骨髓单个核细胞(MNCs)、HSCs、内皮祖细胞、SP细胞、CD34+/-、Lin-c-kit pos 细胞等。
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1.1 骨髓间充质干细胞 MSCs是各种间质细胞的前体细胞，具有很强的增殖能力和多向分化潜能。Liechty KW等将成人MSCs移植入羊子宫后，发现MSCs原位特异性分化为骨骼、软骨、肌腱、骨骼基质、肌肉和心肌细胞 [1] 。MSCs尽管含量仅2～5个/10 6 单个核细胞，但可体外扩增十亿倍而不丧失干细胞活性。
2000年Wang JS等 [2] 观察到MSCs具有微环境依赖性分化，移植4周后开始表达肌球蛋白重链、收缩蛋白等成心肌细胞表型，形成缝隙连接，MSCs能够向心肌样细胞分化并可能替代宿主心肌细胞。Toma C等 [3] 也证实了人类MSC分化为心肌细胞的表型水平和与宿主心肌的水平相一致(如肌丝蛋白，β肌球蛋白重链、α肌动蛋白、肌动蛋白T、肌钙蛋白T、受磷蛋白)。Wang JS等 [4] 在2001进一步证实经冠脉循环移植的MSCs也能够定居心脏并分化为心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞三种细胞系。Shake J等 [5] 建立猪的心肌梗死模型后，将标记有Di-Ⅰ的自体骨髓间充质干细胞注射入梗死心肌，每周检测血液动力学和心功能，2周后可检测到心肌特异蛋白，4周后心收缩功能改善、室壁变薄减轻，免疫组化显示移植细胞移入并分化为心肌细胞。
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研究表明，MSC分泌多种炎症细胞因子，如白介素-1和肿瘤坏死因子-α和生长因子，如碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、angiopoietin-1 [6] ，在干细胞分化成心肌细胞及血管内皮中发挥积极作用。
1.2 骨髓造血干细胞 HSC除了具有重建受体造血与免疫功能外，在体外及体内经诱导可向非细胞系列分化。1999年证实造血干细胞可起到成心肌细胞和内皮祖细胞的作用。
2001年有两个研究小组报道了骨髓造血干/祖细胞在不同的条件下可分化为心肌细胞。他们将绿色荧光蛋白(GFP)阳性的转基因雄性小鼠Lin(-)c-kit + 和CD34 - /low c-kit + Sca-1 + 的骨髓造血干/祖细胞注射到梗死心肌附近。Orlic D等 [7，8] 在存活的受体小鼠梗死部位发现了带状新生细胞群，细胞中含多种心肌细胞特异蛋白，如肌球蛋白、转录因子GATA-4、连结蛋白43等。GFP + 和Y染色体阳性提示该新生细胞群是由移植的Lin(-)c-kit + 骨髓造血干/祖细胞分化生成。结果证实受损的心肌功能得到了部分恢复。Jackson KA [9] 等将CD34 - /low c-kit + Sca-1 + HSCs(所谓的SP细胞)移植给受致死性照射的小鼠，再行冠脉结扎60min后再通。结果发现，分化的心肌细胞首先出现在梗死区周围，约占总数的0.02%，并有LacZ和α肌动蛋白的表达而无FIT-1基因表达(FIT-1是内皮细胞的标志，在SP干细胞中缺乏)，证明了HSCs的心肌再生潜能。
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1.3 其它干细胞亚群 SP细胞、CD34 - 、Lin(-)c-kit + 细胞已如前述。此外，成人骨髓中包含的内皮祖细胞(EPCs)，能直接诱导实验性心肌梗死灶的新血管形成和受损的血管系统再生。新血管形成使梗死区周围过度肥大的心肌细胞凋落、有活力的心肌长期获救、胶原沉积减少和心功能持续改善。
骨髓中的CD34 + 细胞在体外分化为内皮细胞，在体内诱导分化为小血管内皮并能分泌一些生长因子，把CD34 + 骨髓细胞注射到DA鼠模型的缺血心肌内，6天后证实微血管的密度明显增加。
1.4 骨髓单个核细胞 MNCs集成了所有的骨髓干细胞成份。Kamihata H等发现通过MNCs移植分泌促血管生成因子和细胞激素并整合新生血管灶，可改善局部血流和心功能，减小梗死面积，且不会引起纤维增生和成骨等副效应 [6] 。植入经体外扩增的EPCs或MN CD34 + 细胞(即HSCs)可促进新血管再生和阻止缺血心肌的过度肥大 [10] ;植入非造血系骨髓细胞(即间充质干细胞)，则在缺血心肌组织中分化为心肌细胞和血管结构，新分化的心肌细胞占心室梗死部分的68%，明显改善缺血性心脏病的预后。
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2 骨髓干细胞移植实践
2.1 骨髓干细胞移植的原理 干细胞移植改善心肌梗死的机制包括:(1)一定的微环境下分化为心肌细胞，替代原有的受损心肌减少瘢痕组织的形成;(2)分化为血管内皮细胞，促进新血管发生和原有血管的再生，从而改善缺血心肌的血供;(3)再生心肌细胞与原宿主细胞形成细胞间连接，直接参与心脏的同步收缩;(4)移植细胞分泌促血管生成因子和一些炎症因子，启动和调节新血管发生;(5)功能性心肌细胞增加，提高心脏的顺应性，改善心室重塑，使射血分数增加，心功能改善。
2.2 骨髓干细胞模型 Fukuda K从鼠的骨髓基质中分离出了成心肌细胞系(Cardiomyogenic cell line，CMG细胞系) [11] 。间质细胞永生化，经5—氮胞苷处理，筛检出自搏细胞，其中30%1周后形成肌管样结构，2周后开始自发搏动，3周出现同步搏动，这些细胞表达心钠素和脑钠素，显示出心肌样的超微结构，如肌节和心房颗粒，产生窦房结样或心室细胞样的动作电位，同源收缩蛋白基因分析提示它们和胎儿的心室肌细胞具有相似的表型。该细胞系为研究提供了有力的模型。
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2.3 细胞移植的途径 目前干细胞移植的途径主要包括心肌内注射和血管内移植。较早期的实验多采取心肌内直接注射的方式，开胸后经心外膜注射到梗死心肌边缘，或冠状动脉旁路术(CABG)或换瓣时注射，也有人通过胸腔镜向心肌注射或经心内膜注射。因手术相对较大增加移植的危险性、须多点注射增加了对心肌损伤、对手术条件要求高等使它存在一定局限，但因为效果可靠，所以延用至今。血管内移植有很多途径，最早人们将主动脉暂时结扎后向心室腔内注入干细胞，但因转移干细胞效率不高，现多采用经冠状动脉导管选择性冠脉内注射 [12] 。移植细胞呈点状或线状分布于缺血冠状血管支配的心肌各层，较心肌内注射更有利于心肌细胞的保护。血管内注射后移植细胞的迁徙机制尚不完全清楚，有人推测因为干细胞有迁徙性，它们可能是游走出血管从正常区域移行到梗死区;另一种解释是心肌梗死的瘢痕并非完全是坏死组织，有研究发现梗死心肌组织的微血管网功能可部分恢复。
2.4 剂量与时间窗 移植细胞的数量因干细胞种类不同而异，多数实验常在10 4 ～10 8个，以10 5 ～10 6 个为多。移植时机长短不一，短到梗死模型建立后即刻行细胞移植，梗死后1周的也有甚至更长。理论上说，移植越早对心肌梗死的预后改善越有利，多数实验先提取、纯化骨髓，再制成心梗模型，可在数小时内行干细胞移植。但从临床应用的角度来看是不够现实，因为单是纯化骨髓就需1天的时间，如果还要有其它处理，如基因改造可能需要更长的时间。所以要寻求一个合适的时间窗，既可完成干细胞制备，又不至晚到影响移植的效果。
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2.5 细胞识别和效果评价方法 供体细胞移植后的探知和识别很关键。常用的技术包括:通过比色法探知β-牛乳糖、抗体标记、通过荧光显微镜探知GFP和原位杂交探知Y染色体。
目前评价的指标包括:(1)供体来源成活细胞的数量和分化后的心肌细胞的数量及所占的比重;(2)新生毛细血管 密度、供体来源内皮细胞的数量;(3)心功能评估，如局部心肌血流量、射血分数、左室舒张末期容积、室壁活动能力等;(4)选择性冠状动脉造影及血管超声，判定冠脉血流及侧支循环的建立情况;(5)相关的细胞因子及促血管生成因子的检测，以判定干细胞的自我更新及分化活性。
2.6 基础研究向临床试验过渡 Hammano等 [13] 于2001年为5例冠心病外科搭桥手术患者术中植入自体骨髓细胞，3例心肌灌注明显改善，未发现有害变化。Assmus B等 [12]于2002年入选20例急性心梗患者进行骨髓干细胞和外周血干细胞移植的对比研究，移植后两组心脏功能、冠脉血流储备有明显改善，两组之间无统计学差异。Strauer等 [14] 于2002年经冠状动脉骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死，左室造影显示细胞移植无运动区明显缩小，心功能指标明显改善。2003年1月Stamm C等 [15] 为6例行搭桥术的心梗患者行自体AC133 + (含CD34 - )干细胞心肌内注射，Tse H-F等 [16] 为8例严重冠心病患者经导管移植自体MNCs，症状、心肌灌注、心功能均有明显改善，也证明了治疗安全性。我国高连如等也对4例急性心肌梗死患者行冠脉成形术同时冠脉内注入MNCs，PET示梗死区缩小
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、心功能改善。
2.7 基因治疗在干细胞治疗中的应用 转基因技术结合于干细胞移植研究中，可以促进心肌细胞转化、替代或修复损伤心肌和诱导新血管发生。基因转导媒介包括病毒基因(逆转录Vir、腺Vir、AAV、HVJ)、脂蛋白、质粒DNA。人们应用BMC或MSCs注入缺血心肌尽管取得了有限的成功，但因移植的干细胞生存能力差、保持活性的能力差、受损部位血流不足，以至许多干细胞死亡，没有足够的细胞再生和修复心脏组织。基因工程改造后的干细胞有望克服这种缺陷。Yang Y等将转导了VEGF cDNA的干细胞进行移植，结果心梗区域的血管数量及心脏功能改善的程度比单纯干细胞移植组明显增加 [17] 。2003年8月Nat Med上发表了Brigham和Czau等完成的基因工程改造干细胞的新研究，将小鼠的BMC进行基因改造，以病毒为载体在干细胞中加入一个单肽的Akitl，阻断引发细胞凋亡的信号。Akitl被激活，受损部位的干细胞存活且比改造前有更足够的时间分化为心肌细胞，2周后小鼠心功能恢复正常。Murry博士强调:将基因治疗和干细胞移植结合能大大提高控制细胞行为的能力，是一个有发展的研究方向。
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3 小结与展望
目前研究中尚存在一些问题:(1)干细胞分化机制与条件不完全清楚，限制了对分化调控的深入研究;(2)目前多采用单个核细胞或间充质干细胞，但哪种干细胞类型更适宜移植，通过什么方法分离纯化，都没有统一的说法;(3)供体细胞的生存时间过短，如何能延长寿命保证充分分化为心肌细胞，使心脏功能持续改善;(4)细胞识别及分化鉴定问题，尚没有统一可靠的方法，尤其临床试验中尚无安全准确的示踪技术;(5)细胞移植时机的问题，因为纯化干细胞约需1天的时间，急性心肌梗死却需要快速的救治;(6)关于干细胞移植的安全性问题，特别是基因技术应用后，是否有机会增加转化为癌细胞的机会还不知道;(7)临床研究干细胞移植常与CABG和PTCA同时进行，其独立作用尚无法评估，需要进一步的对照研究 [17] ;(8)转基因技术要解决好包括可调控性、长期表达、传递策略、临床试验设计、结果判定标准等问题才能取得实质性的进步。
尽管诸多问题需解决，但BMC移植的临床应用潜力是巨大的。Rosen的小组正致力于用细胞治疗向心脏呈递基因，来改善心脏的电脉冲、产生生物起搏器来替代机械起搏器的技术研究。有理由相信:自体骨髓的干细胞移植可能有一天会成为治疗损伤或病变心脏的常规，并最终免除心脏移植的必要。
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参考文献
1 Liechty K W，MacKenzie T C，Shaaban A F，et al.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transpla ntation in sheep.Nat Med，2000，6(11):1282-1286.
2 Wang J S，ShumTim D，Galipeau J，et al.Marrow stromal cells for celluˉlar cardiomyoplasty:feasibility and potential clinical advantages.J Thoˉrac Cardiovasc Surg，2000，120(5):999-1005.
3 Toma C，Pittenger M F，Cahill K S，et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation，2002，105(1):93-98.
, http://www.100md.com
4 Wang J S，ShumTim D，Chedrawy E，Chiu R C.The cornoary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration:pathophysiologic and therapeutic implications.J Thorac Cardiovasc Surg，2001，122(4):699-705.
5 Shake JG，Gruber PJ，Baumgartner WA，et al.Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model:engraftment and funcˉtional effects.AnnThorac Surg，2002，73(6):1919-1925，1926.
6 Kamihata H，Matsubara H，Nishiue T，et al.Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfuˉsion and regional function via side supply of angioblasts，angiogenic ligˉands，and cytokines.Circulation，2001，104(9):1046-1052.
, 百拇医药
7 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice.Ann N Y Acad Sci，2001，938:221-230.
8 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells reˉpair the infarcted heart，improving function and survival.Proc Natl Acad SciU S A，2001，98(18):10344-10349.
9 Jackson K A，Majka S M，Wang H，et al.Regeneration of ischemic carˉdiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells.J Clin Invest，2001，107(11):1395-1402.
, http://www.100md.com
10 Kocher A A，Schuster M D，Szabolcs M J，Takuma S，et al.Neovascuˉlarization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents car diomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function.Nat Med，2001，7(4):430-436.
11 Fukuda K.Development of regenerative cardiomyocytes frommesenchyˉmal ste
m cells for cardiovascular tissue engineering.Artif Organs，2001，25(3):187-19
, http://www.100md.com
3.
12 Assmus B，Schachinger V，Teupe C，Britten M，et al.Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial inˉfarction(TOPCARE-AMI).Circulation，2002，106(24):3009-3017.
13 Hamano K，Nishida M，Hirata K，Mikamo A，et al.Local implantation of auto
logous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease:clinical trial and preliminary results.Jpn Circ J，2001，65(9):845-847.
, 百拇医药
14 Strauer BE，BrehmM，Zeus T，et al.Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans.Circulation，2002，106:online.
15 Stamm C，Westphal B，Kleine H D，Petzsch M，et al.Autologous bone marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration.Lancet，2003，361(9351):45-46.
16 Tse H F，Kwong Y L，Chan JKF，Lo Gladys，et al.Angiogenesis in isˉchemicmyocardium by intramyocardial autolgous bone marrowmononuˉclear cell implantation.Lancet，2003，361(9351):47-49.
, 百拇医药
17 Yang Y，Min J Y Rana J S Ke Q，Cai J，Chen Y，et al.VEGF enhances functional improvement of postinfarcted hearts by transplantation of ESC-differentiated
cells.J Appl Physiol，2002，93(3):1140-1151.
作者单位:100036北京空军总医院心血管内科
(收稿日期:2004-02-04)
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