黄芪对实验性糖尿病大鼠血管内皮细胞一氧化氮合酶的影响
【摘要】 目的 观察中药黄芪对糖尿病大鼠血管内皮细胞NOS的影响，探讨黄芪防治糖尿病合并血管病变的作用及其机制。方法 用四氧嘧啶制作糖尿病大鼠模型，以黄芪水煎液灌胃治疗，优降糖灌胃进行对照。治疗4周后取一段主动脉，采用血管内皮细胞(VEC)平铺技术与组织化学相结合等方法，观察各组血管内皮细胞NOS的活性。结果 造模组NOS活性明显减弱，黄芪能增强NOS活性，与优降糖组相比差异有显著性，与正常空白组相比虽略有降低，但无统计学意义。结论 黄芪对糖尿病大鼠血管内皮细胞具有保护作用。
关键词 黄芪 糖尿病 血管内皮细胞 一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0385-02
Effect of astragalus membranaceus on the NOS
of vascular endothelial cells of diabetic rats
, http://www.100md.com
Xiong Yingchun，Hong Xiaoping，Chen Zebin.
Department of Anatomy and Histology and Embryology，Hubei TCM，Wuhan430061.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Astragalus membranaceus on vascular endothelial cells of diabetic rats.Methods The experiment was studiedon diabetic wistar rats injected alloxan saline through abdominal cavity，poured the Chinese medicine astragalus membranaceus into their stomach，and compared with medicine glyˉburide.4weeks later，studywas carried out on activity of the NOS in vascular endothelial cells of aorta by the hautchen technique of endothelium and histochemistry method.Results the activity of NOS in the VEC reduced.Astragalus membranaceus can increase the activity of NOS in the VEC.And this function was obviously better than that of glyˉburide.Conclusion Astragalus membranaceus can effectually prevent the vascular endothelial cells being damaged in diabetic rats.
, 百拇医药
Key words astragalus membranaceus diabetes mellitus vascular endothelial cells NOS
糖尿病合并血管病变是糖尿病较常见和难治的并发症之一。血管内皮细胞形态和功能的异常与糖尿病并发症的发生、发展密切相关 [1] 。血管内皮细胞能自分泌很多生物活性物质，其中内皮源性NO具有调节血管张力和抑制内膜增生的作用，一氧化氮合酶(NOS)活性异常参与了动脉硬化等血管病的发生、发展 [2] 。中药黄芪在治疗糖尿病及其并发症方面疗效确切，而且对心血管的作用较为广泛 [3] 。本实验观察黄芪对糖尿病大鼠VEC的NOS活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 动物:Wistar大鼠40只，雌雄不限，体重200～250g(同济医科大学动物实验中心提供)。药物:四氧嘧啶，Sigma公司生产。黄芪生药由湖北中医学院药学系提供，按标准方法自行制备水煎液，浓缩至生药1g/ml。优降糖，天津药业集团制药股份有限公司，批号12020270。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型的建立 大鼠空腹24h，以2.5%四氧嘧啶生理盐水溶液，按每天120mg/kg剂量对大鼠进行腹腔注射，药液现配现用，每天1次，连续2天。造模后第5日测血糖(不禁食)，以血糖在16.65～27.8mmol/L之间作为造模成功的标准。
1.3 给药和分组 大鼠随机分为4组:正常空白对照组，造模对照组，优降糖对照组，黄芪治疗组。大鼠造模成功后，当时分别以优降糖灌胃治疗组(0.25mg/kg)，黄芪灌胃治疗组(5ml/kg)，每天定时治疗1次，实验期间各组动物均自由饮食，连续观察4周。
1.4 取材 实验4周结束后，各组大鼠用2%戊巴比妥钠溶液深度麻醉后，打开腹腔，迅速取出大鼠腹主动脉，先用生理盐水洗净血液，再用4%多聚甲醛溶液灌注5min固定，除去血管外组织，剪开血管，将动脉内膜面朝上贴于滤纸，再放入4%多聚甲醛溶液中外固定30min。
1.5 NADPH-d(还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶)组织化学法 将已固定好的动脉浸入30%的蔗糖溶液中，置于冰箱中12h。从滤纸上取下血管，将其放入0.3%triˉtonPBS溶液(pH7.4)中振动30min，然后入NADPH-d孵化液[10ml加入硝基四唑氮蓝(NBT)2mg充分溶解，取溶液2ml，加入2mg的NADPH-4Na]中孵育90min，放入0.01mmol/L PBS溶液中冲洗3次终止反应。此时血管呈现蓝色。
, 百拇医药
1.6 血管VEC平铺 将血管常规梯度脱水，剪成3段，用16%火棉胶溶液将动脉段内膜面朝下贴于已挂好了火棉胶的载玻片上，压平，自然干燥(约1h)。干燥后将贴了血管的火棉胶玻片浸入30%的酒精中软化30～60min，然后用小小心剥去主动脉的外膜和中膜，保留血管内皮细胞层，常规梯度脱水(至100%)，以石碳酸、甲苯、二甲苯混合液透明，中性树胶封片。
1.7 观察、计数及统计学处理 用千屏图像分析软件测平均光密度值。每片随机选3视野，分别计数，取均值为该片的平均光密度值，其值越小，表明颜色越深，NOS活性越大。所得数据应用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 镜下观察 400倍镜下:各组大鼠VEC染成蓝色，呈现NOS阳性反应，胞膜明显，胞浆染色较淡，胞核呈卵圆形，染色深，细胞边界清晰(图A-D)。
2.2 测定平均光密度值以及组间比较 见表1。
, 百拇医药
表1 VEC的NOS平均光密度值(X±s)
由表1可以看出:造模组显著低于正常组(P<0.01)，说明VEC着色浅，其NOS活性降低，优降糖组NOS活性高于造模组(P<0.05)。黄芪组NOS活性高于优降糖组(P<0.05)，差异有显著性;其与正常组接近(P>0.05)，差异无统计学意义。
3 讨论
血管内皮细胞不仅构成了血-组织屏障的重要部分，还具有很重要的生物学特性，它能自分泌和旁分泌血管活性物质，其分泌的物质与神经递质及体液因素一起组成了一个较完整的心血管功能调控系统。其中一氧化氮(NO)曾被称为血管内皮细胞舒张因子，NO的生物学作用广泛，除能作为神经介质，能调节细胞生长、增殖等作用之外，其主要能调节血管扩张，此生物学效应是通过NO因其本身的亲脂性能迅速进入细胞膜，与可溶性的鸟苷酸环化酶上的血红素基因组合，导致靶细胞中的c-GMP增加，继而引起血管松弛等效应。临床和实验报道NO在糖尿病的病程中呈现动态改变 [4，5] 早期NO升高，晚期NO减少。前者可能是由于机体代偿作用及内皮素等刺激引起NO释放增加;而在糖尿病晚期NO都明显减少，说明血管内皮细胞功能损害，其舒张功能减弱，缩血管物质增加，导致了动脉粥 样硬化等糖尿病合并血管病变的发生和发展。
, 百拇医药
NO是由左旋精氨酸(L-精氨酸)在一氧化氮合酶(NOS)的催化下与氧作用后生成的。这一反应取决于L-精氨酸及NOS的存在，缺一不可，只有能表达产生NOS的细胞才能合成NO。NOS有两个型已明确:一是结构型NOS(cNOS)，其活化依靠钙和调钙蛋白的参与，主要分布在血管内皮细胞、血小板、脑和周围神经组织中，正常血管内皮细胞胞浆成分和胞膜成分均可测得NOS活性，以膜成分为高 [6] 。二是诱生型NOS(iNOS)，其活化不依靠钙离子和调钙蛋白，能引起NO长时间释放。NADPH-d组织化学染色已作为NOS分布的一种标志而广泛用于其定位研究，据认为，NSO的C端可将NADPH的电子传递至硝基四唑氮蓝(NBT)，并将底物NBT还原成不溶性紫蓝色沉淀，此结果即为NOS阳性反应。本实验为确定测得的是内皮细胞上的NOS，故采用血管内皮细胞平铺技术与组织化学相结合的方法。4周后镜下观察各组VEC呈现蓝色，胞膜明显，颜色较深，胞浆染色较淡，胞核清晰，细胞边界清晰。只是文献报道NOS在血管内皮细胞中胞浆和胞膜上，可在此实验中胞核却显示非常明显。其原因还有待进一步研究。用分析软件测其平均光密度值测定NOS活性，结果显示造模组NOS活性降低，说明内皮细胞功能损伤，与文献报道一致;黄芪治疗组NOS活性升高，且明显优于优降糖，内皮细胞趋于正常，由此说明黄芪能维护血管内皮细胞的功能，对VEC具有保护作用，其作用可能是通过调节血管内皮细胞NOS活性而实现的，这也可能是黄芪治疗糖尿病合并血管并发症的主要途径之一。至于黄芪是如何作用于血管内皮细胞NOS，其机理有待于进一步探讨。(本文图片见封三)
, 百拇医药
参考文献
1 段文卓.高血糖对大鼠血管内皮舒张功能的影响.中国病理生理杂志，1998，14(5):488-490.
2 Meurice T，Vallet B，Bauters C.Role of endothelial cells in restenosis afˉter coronary angioplasty.Fundan clin pharmacol，1996，10(3):234-242.
3 路绪文.黄芪与心血管疾病.药学实践杂志，2002，20(1):3-6.
4 夏军.糖尿病患者血浆内皮素、一氧化氮检测及相关性研究.中国医药学报，1999，14(2):16-17.
5 陈国荣.黄芪对糖尿病性肾病大鼠心肌脂质过氧化作用及一氧化氮水平的影响.中国应用生理学杂志，2001，17(2):186-188.6 孙长凯.NO、NOS及其医学意义.解放军医学杂志，1995，20(5):390-393.
作者单位:430061湖北中医学院解剖组胚教研室
(收稿日期:2003-11-26)
(编辑子 萱), 百拇医药
关键词 黄芪 糖尿病 血管内皮细胞 一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0385-02
Effect of astragalus membranaceus on the NOS
of vascular endothelial cells of diabetic rats
, http://www.100md.com
Xiong Yingchun，Hong Xiaoping，Chen Zebin.
Department of Anatomy and Histology and Embryology，Hubei TCM，Wuhan430061.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Astragalus membranaceus on vascular endothelial cells of diabetic rats.Methods The experiment was studiedon diabetic wistar rats injected alloxan saline through abdominal cavity，poured the Chinese medicine astragalus membranaceus into their stomach，and compared with medicine glyˉburide.4weeks later，studywas carried out on activity of the NOS in vascular endothelial cells of aorta by the hautchen technique of endothelium and histochemistry method.Results the activity of NOS in the VEC reduced.Astragalus membranaceus can increase the activity of NOS in the VEC.And this function was obviously better than that of glyˉburide.Conclusion Astragalus membranaceus can effectually prevent the vascular endothelial cells being damaged in diabetic rats.
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Key words astragalus membranaceus diabetes mellitus vascular endothelial cells NOS
糖尿病合并血管病变是糖尿病较常见和难治的并发症之一。血管内皮细胞形态和功能的异常与糖尿病并发症的发生、发展密切相关 [1] 。血管内皮细胞能自分泌很多生物活性物质，其中内皮源性NO具有调节血管张力和抑制内膜增生的作用，一氧化氮合酶(NOS)活性异常参与了动脉硬化等血管病的发生、发展 [2] 。中药黄芪在治疗糖尿病及其并发症方面疗效确切，而且对心血管的作用较为广泛 [3] 。本实验观察黄芪对糖尿病大鼠VEC的NOS活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 动物:Wistar大鼠40只，雌雄不限，体重200～250g(同济医科大学动物实验中心提供)。药物:四氧嘧啶，Sigma公司生产。黄芪生药由湖北中医学院药学系提供，按标准方法自行制备水煎液，浓缩至生药1g/ml。优降糖，天津药业集团制药股份有限公司，批号12020270。
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1.2 动物模型的建立 大鼠空腹24h，以2.5%四氧嘧啶生理盐水溶液，按每天120mg/kg剂量对大鼠进行腹腔注射，药液现配现用，每天1次，连续2天。造模后第5日测血糖(不禁食)，以血糖在16.65～27.8mmol/L之间作为造模成功的标准。
1.3 给药和分组 大鼠随机分为4组:正常空白对照组，造模对照组，优降糖对照组，黄芪治疗组。大鼠造模成功后，当时分别以优降糖灌胃治疗组(0.25mg/kg)，黄芪灌胃治疗组(5ml/kg)，每天定时治疗1次，实验期间各组动物均自由饮食，连续观察4周。
1.4 取材 实验4周结束后，各组大鼠用2%戊巴比妥钠溶液深度麻醉后，打开腹腔，迅速取出大鼠腹主动脉，先用生理盐水洗净血液，再用4%多聚甲醛溶液灌注5min固定，除去血管外组织，剪开血管，将动脉内膜面朝上贴于滤纸，再放入4%多聚甲醛溶液中外固定30min。
1.5 NADPH-d(还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶)组织化学法 将已固定好的动脉浸入30%的蔗糖溶液中，置于冰箱中12h。从滤纸上取下血管，将其放入0.3%triˉtonPBS溶液(pH7.4)中振动30min，然后入NADPH-d孵化液[10ml加入硝基四唑氮蓝(NBT)2mg充分溶解，取溶液2ml，加入2mg的NADPH-4Na]中孵育90min，放入0.01mmol/L PBS溶液中冲洗3次终止反应。此时血管呈现蓝色。
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1.6 血管VEC平铺 将血管常规梯度脱水，剪成3段，用16%火棉胶溶液将动脉段内膜面朝下贴于已挂好了火棉胶的载玻片上，压平，自然干燥(约1h)。干燥后将贴了血管的火棉胶玻片浸入30%的酒精中软化30～60min，然后用小小心剥去主动脉的外膜和中膜，保留血管内皮细胞层，常规梯度脱水(至100%)，以石碳酸、甲苯、二甲苯混合液透明，中性树胶封片。
1.7 观察、计数及统计学处理 用千屏图像分析软件测平均光密度值。每片随机选3视野，分别计数，取均值为该片的平均光密度值，其值越小，表明颜色越深，NOS活性越大。所得数据应用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 镜下观察 400倍镜下:各组大鼠VEC染成蓝色，呈现NOS阳性反应，胞膜明显，胞浆染色较淡，胞核呈卵圆形，染色深，细胞边界清晰(图A-D)。
2.2 测定平均光密度值以及组间比较 见表1。
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表1 VEC的NOS平均光密度值(X±s)
由表1可以看出:造模组显著低于正常组(P<0.01)，说明VEC着色浅，其NOS活性降低，优降糖组NOS活性高于造模组(P<0.05)。黄芪组NOS活性高于优降糖组(P<0.05)，差异有显著性;其与正常组接近(P>0.05)，差异无统计学意义。
3 讨论
血管内皮细胞不仅构成了血-组织屏障的重要部分，还具有很重要的生物学特性，它能自分泌和旁分泌血管活性物质，其分泌的物质与神经递质及体液因素一起组成了一个较完整的心血管功能调控系统。其中一氧化氮(NO)曾被称为血管内皮细胞舒张因子，NO的生物学作用广泛，除能作为神经介质，能调节细胞生长、增殖等作用之外，其主要能调节血管扩张，此生物学效应是通过NO因其本身的亲脂性能迅速进入细胞膜，与可溶性的鸟苷酸环化酶上的血红素基因组合，导致靶细胞中的c-GMP增加，继而引起血管松弛等效应。临床和实验报道NO在糖尿病的病程中呈现动态改变 [4，5] 早期NO升高，晚期NO减少。前者可能是由于机体代偿作用及内皮素等刺激引起NO释放增加;而在糖尿病晚期NO都明显减少，说明血管内皮细胞功能损害，其舒张功能减弱，缩血管物质增加，导致了动脉粥 样硬化等糖尿病合并血管病变的发生和发展。
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NO是由左旋精氨酸(L-精氨酸)在一氧化氮合酶(NOS)的催化下与氧作用后生成的。这一反应取决于L-精氨酸及NOS的存在，缺一不可，只有能表达产生NOS的细胞才能合成NO。NOS有两个型已明确:一是结构型NOS(cNOS)，其活化依靠钙和调钙蛋白的参与，主要分布在血管内皮细胞、血小板、脑和周围神经组织中，正常血管内皮细胞胞浆成分和胞膜成分均可测得NOS活性，以膜成分为高 [6] 。二是诱生型NOS(iNOS)，其活化不依靠钙离子和调钙蛋白，能引起NO长时间释放。NADPH-d组织化学染色已作为NOS分布的一种标志而广泛用于其定位研究，据认为，NSO的C端可将NADPH的电子传递至硝基四唑氮蓝(NBT)，并将底物NBT还原成不溶性紫蓝色沉淀，此结果即为NOS阳性反应。本实验为确定测得的是内皮细胞上的NOS，故采用血管内皮细胞平铺技术与组织化学相结合的方法。4周后镜下观察各组VEC呈现蓝色，胞膜明显，颜色较深，胞浆染色较淡，胞核清晰，细胞边界清晰。只是文献报道NOS在血管内皮细胞中胞浆和胞膜上，可在此实验中胞核却显示非常明显。其原因还有待进一步研究。用分析软件测其平均光密度值测定NOS活性，结果显示造模组NOS活性降低，说明内皮细胞功能损伤，与文献报道一致;黄芪治疗组NOS活性升高，且明显优于优降糖，内皮细胞趋于正常，由此说明黄芪能维护血管内皮细胞的功能，对VEC具有保护作用，其作用可能是通过调节血管内皮细胞NOS活性而实现的，这也可能是黄芪治疗糖尿病合并血管并发症的主要途径之一。至于黄芪是如何作用于血管内皮细胞NOS，其机理有待于进一步探讨。(本文图片见封三)
, 百拇医药
参考文献
1 段文卓.高血糖对大鼠血管内皮舒张功能的影响.中国病理生理杂志，1998，14(5):488-490.
2 Meurice T，Vallet B，Bauters C.Role of endothelial cells in restenosis afˉter coronary angioplasty.Fundan clin pharmacol，1996，10(3):234-242.
3 路绪文.黄芪与心血管疾病.药学实践杂志，2002，20(1):3-6.
4 夏军.糖尿病患者血浆内皮素、一氧化氮检测及相关性研究.中国医药学报，1999，14(2):16-17.
5 陈国荣.黄芪对糖尿病性肾病大鼠心肌脂质过氧化作用及一氧化氮水平的影响.中国应用生理学杂志，2001，17(2):186-188.6 孙长凯.NO、NOS及其医学意义.解放军医学杂志，1995，20(5):390-393.
作者单位:430061湖北中医学院解剖组胚教研室
(收稿日期:2003-11-26)
(编辑子 萱), 百拇医药