大鼠股外侧肌及其线粒体形态结构的年龄性改变
【摘要】 目的 探讨不同年龄组大鼠股外侧肌肌纤维及其线粒体形态结构的年龄性改变。方法 将SD雄性大鼠分为3月龄、12月龄和24月龄3组，用组织化学方法(HE、MGT、ATPase、NADH-TR)观察肌纤维的形态结构，用透射电镜技术观察骨骼肌细胞线粒体的超微形态结构。所有光镜切片及电镜照片选用新型图像分析软件，采用计算机图像分析系统进行形态计量分析。结果 ATPase染色示股外侧肌均呈Ⅱ型纤维。光镜下可见到24月龄组大鼠股外侧肌有群组性肌纤维萎缩;随增龄股外侧肌肌纤维平均截面积而减少(P<0.05)，24月龄组肌纤维面数密度明显高于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比差异无显著性(P>0.05);MGT积分光密度在24月龄组及12月龄组显著低于3月龄组(P<0.05)。随增龄线粒体平均体积增大(P<0.05);线粒体体密度、线粒体数密度、线粒体嵴膜密度随增龄而降低(P<0.05);24月龄组股外侧肌可见变性的巨大线粒体，线粒体嵴明显减少，有的线粒体空泡化。结论 随增龄大鼠股外侧肌肌纤维及其线粒体形态结构发生显著性变化。
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关键词 衰老 股外侧肌 线粒体 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0773-03
A morphometric study of age-related changes in cell
and mitochondria of vastus lateralis muscle in rats
Liu Yonghai，Zhao Hui，Xu Xingshun
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the age-related structural changes of vastus lateralis muscles in Spraqes-Dawley rats.Methods Histomorphometric and ultrustructural analysis of age-related structural changes in the vastus lateralis muscles is performened in3month，12month and24month aged rats.A morphometric quantitative study of cell and mitochondria of vastus lateralis muscles has been invastigated by using true color medical image analysis sysˉtem.Results It is found that the vastus lateralis muscles contains pour typeⅡfiber by ATPase staining.The average muscle fiber cross-sectional area decreased with aging.There was no significant difference of the numerical density on cross-sectional area of muscle fibers between the three groups(P>0.05).The groups of atrophic angulated fibrs are frenqently seen in the24month aged group，but no target fibers.The modified Gomori trichrome(MGT)staining showed that the mitochondrial reaction was significantly lower in12month and24month aged groups as compared with3month aged group(P<0.05).The mitochondrial average volume increase with aging.The volume density，numerical density，cristae membrane density were decreased with aging(P<0.05).Conclusion The fiber and mitochondria of vastus lateralis muscles has a significant structural changes with aging in rats.
, 百拇医药
Key words aging vastus lateralis muscles mitochondria rat
生物体之出生、成长、衰老直至死亡，这是不可抗拒的自然规律。认识这一规律必须从生物学本质也就是衰老机制方面着手，但这一机制至今尚未完全阐明。生理性衰老时，生物体内生理功能发生有害性减退，这些生理性功能的改变取决于生物体内细胞水平的形态结构改变 [1] 。本文采用组织化学及电镜方法，初步观察了大鼠股外侧肌肌纤维及其线粒体形态结构的年龄性改变，并进行定量分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物 本实验选用SD雄性大鼠，将动物分为3组，分别为3月龄、12月龄和24月龄组，每组各10只。
1.2 方法
1.2.1 取材与制片 (1)用3%戊巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉(45mg/1000g体重)，取右股外侧肌的深部肌肉一小块，约0.3cm×0.3cm×0.5cm大小，迅速放入异戊烷中，并在液氮内速冻，低温冰箱保存，用于冰冻切片的组织化学染色。另取右股外侧肌的深部肌肉，分割成0.5mm 3 大小的小块，放入戊二醛磷酸缓冲液内进行预固定，用于制作电镜标本。(2)将右股外侧肌的肌肉冰冻标本在恒冷切片机中进行冰冻切片，方向呈肌纤维横切，厚度为7μm，分别进行以下几种染色:苏本精-伊红染色(HE)，改良Gomori三色染色(MGT)、腺苷三磷酸酶染色(ATPase)和还原型辅酶四唑还原酶染色(NADH-TR)。股外侧肌常规电镜制片，铅铀染色，每只大鼠每个部位观察两个铜网，每个铜网随机照相2张，电镜照片放大20000倍。
, 百拇医药
1.2.2 形态计量分析 所有光镜切片及电镜照片选用新型图像分析软件，用计算机图像分析系统进行形态计量分析。资料进行单因素方差分析或秩和检验，利用SPSS/PC统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 光镜下股外侧肌结构的年龄性改变 不同年龄组大 鼠股外侧肌结构参数统计结果见表1。
表1 大鼠股外侧肌及其线粒体结构参数比较
注:与3月龄组相比ˇP<0.05，与12月龄组相比△P<0.05 24月龄组大鼠股外侧肌肌纤维平均截面积明显小于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比肌纤维平均截面积亦明显减小(P<0.05)，这提示随增龄股外侧肌肌纤维平均截面积而减少;24月龄组肌纤维面数密度明显高于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比差异无显著性(P>0.05);MGT积分光密度在24月龄组及12月龄组显著低于3月龄组(P<0.05)，24月龄组与12月龄组之间差异无显著性(P>0.05);ATPase染色示股外侧肌均呈Ⅱ型纤维;光镜下可见到24月龄组大鼠股外侧肌有群组性肌纤维萎缩;NADH-TR染色各年龄组均未见到靶纤维。
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2.2 电镜下股外侧肌线粒体形态结构年龄性改变 不同年龄组股外侧肌线粒体形态结构参数统计结果见表1。线粒体平均体积在24月龄组大于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比亦显著增大(P<0.05);线粒体体密度统计结果显示随增龄而减小，说明随增龄线粒体平均体积增大，而总体积减小。线粒体数密度随增龄而降低，24月龄组低于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比亦明显减小(P<0.05)，提示随增龄线粒体数量而减少。线粒体嵴膜密度在24月龄组小于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组小于3月龄组(P<0.05)，说明线粒体嵴膜密度随增龄而减小，即线粒体嵴减少。线粒体圆球度各年龄组之间差异无显著性(P>0.05)，即线粒体的外部形状随增龄无显著性改变。24月龄组股外侧肌可见变性的巨大线粒体，线粒体嵴明显减少，有的线粒体空泡化。
3 讨论
本实验经ATPase染色证明，大鼠股外侧肌仅含Ⅱ型纤维，同文献一致 [2] 。一般而言，Ⅱ型肌纤维形态结构的年龄性改变较Ⅰ型纤维为著 [3] ，主要表现为骨骼肌肌肉的体积和重量减少，最初有人认为骨骼肌体积减少是由于肌纤维的丢失所致，后来研究并没有发现骨骼肌纤维数目随增龄而减少 [4] 。我们的观察结果与后者一致，24月龄组大鼠股外侧肌和12月龄组及3月龄组相比其肌纤维面数密度没有降低，即肌纤维数目没有减少。本研究发现大鼠股外侧肌肌纤维平均截面积随增龄而减少，说明大鼠股外侧肌肌纤维随年龄而萎缩。因此，我们认为骨骼肌体积和重量随年龄的降低不是由于肌纤维数目的减少，而是由于纤维的萎缩所致。目前多数学者认为骨骼肌形态结构的年龄性改变是神经元性改变为主，肌源性改变少见;也有人提出由于 各种因素作用于前角运动神经元、周围神经、运动终板和肌肉，使运动单位减少导致肌肉萎缩。近来的研究发现老年人α运动神经元输入信号减少、神经元数目减少的现象 [5] 。老年人骨骼肌出现的靶样纤维及群组角状萎缩纤维等是神经元性改变的特征 [6] 。本实验NADH-TR染色，未发现24月龄组大鼠股外侧肌有靶纤维，这可能由于老年动物活动减少，肌萎缩的部分原因可能是废用性的，一般认为Ⅱ型纤维较易发生废用性萎缩 [3] ;研究报道，运动训练可使Ⅱ型纤维总面积增加27.6%，肌肉力量增加(174±31)%，改善肌肉功能 [7] 。大鼠股外侧肌MGT染色，发现在12月龄组及24月龄组大鼠反应能力降低，染色反应的强弱与线粒体数目有关。本实验中MGT染色的年龄性改变与电镜下观察到的线粒体数目的年龄性改变基本一致，我们认为MGT染色能比较客观地反映骨骼肌中线粒体的含量。线粒体是细胞的能量来源及能量转换系统，它在细胞对物的生物质合成、物质转运及信息传递过程中具有重要作用。
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本实验显示大鼠股外侧肌细胞内线粒体数密度随增龄而降低，说明线粒体数目减少;线粒体平均体积随增龄而增大，而线粒体体密度随增龄降低(即线粒体总体积减少)，增龄时线粒体体密度下降，认为是由于线粒体数目的减少所致，线粒体平均体积的增大可能是对线粒体数目减少的一种代偿性改变。在24月龄组大鼠股外侧肌细胞中，常可见到巨大变性线粒体的嵴明显减少，有的线粒体空泡化。股外侧肌中有的线粒体含有髓样层状结构，有人认为髓样层状结构是线粒体变性的一种标志 [8] 。嵴的作用是增加线粒体内膜的表面积，嵴的数目在不同细胞有很大差异，一般认为这与细胞代谢活性高低有关。文献中未见有关骨骼肌线粒体年龄性改变时嵴的定量分析，我们用形态计量学方法对不同年龄组大鼠股外侧线粒体嵴进行定量分析，实验结果显示随增龄大鼠股外侧肌线粒体嵴膜密度减小，即线粒体嵴减少。线粒体内膜和嵴是细胞进行氧化磷酸化的主要部位，是产生能量的场所，内膜和嵴的减少或破坏势必导致细胞氧化磷酸化功能障碍和能量生成的减少，这可能是导致骨骼肌细胞发生萎缩的原因之一。文献报道线粒体基因组(位于线粒体内膜上)功能异常与骨骼肌纤维萎缩密切相关 [9] 。线粒体内膜和嵴的多少与细胞呼吸功能及氧化状态呈正比，可以根据其减少的多少，推测细胞呼吸功能障碍和能量生成障碍的程度。总之，线粒体形态结构的改变与衰老的生物功能密切相关，因此研究线粒体形态结构的年龄性改变更具有生物学意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Herbener GH.A morphometric study of age-dependent chages in mitoˉchondial populations of mouse liver and heart.J Gerontol，1976，31(1):8-12.
2 Hollozy JO，che M，Cartee GD，et al.Skeletal muscle atrophy in old rats:differential chages in the three fiber type.Mech ageing Deve，1991，60(2):199-213.
3 孟晓落，黄克维.年龄因素对骨骼肌的影响.中华神经科杂志，1994，27(2):74-97.
4 Brown M.Change in fiber size，not muscle，in ageing skeletal muscle.Age ageing，1987，16:244-246.
, http://www.100md.com
5 Brooks SV.Skeletal muscle weeknees in old age.Med Sci Sports Exerc， 1994，26(4):432-439.
6 Progi P，Marchetti C，Scelsi R.Atumatic morphometric analysis of skeleˉtal muscle fibers in the aging man.The Anatomical Record，1987，217:39-43.
7 Parise G，Yarasheski KE.The utility of resistence exercise training and amino acid supplementation for reversing age-associated decrements in muscle protein mass and fuction.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2000，26(1):123-141.
, 百拇医药
8 Beregi E，Regious O，Huttle T，et al.Age-relatred changes in the skeletal muscle cells.Gerontology，1988，21:83-86.
9 Lee CM，LopezME，Weindruch R，et al.Association of age-related miˉtochondrial abnormalities with skeletel muscle fiber atrophy.Free Radic Biol Med，1998，25(8):964-972.
作者单位:221002徐州医学院附属医院神经科
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑使 臻), http://www.100md.com
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关键词 衰老 股外侧肌 线粒体 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0773-03
A morphometric study of age-related changes in cell
and mitochondria of vastus lateralis muscle in rats
Liu Yonghai，Zhao Hui，Xu Xingshun
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002.
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【Abstract】 Objective To study the age-related structural changes of vastus lateralis muscles in Spraqes-Dawley rats.Methods Histomorphometric and ultrustructural analysis of age-related structural changes in the vastus lateralis muscles is performened in3month，12month and24month aged rats.A morphometric quantitative study of cell and mitochondria of vastus lateralis muscles has been invastigated by using true color medical image analysis sysˉtem.Results It is found that the vastus lateralis muscles contains pour typeⅡfiber by ATPase staining.The average muscle fiber cross-sectional area decreased with aging.There was no significant difference of the numerical density on cross-sectional area of muscle fibers between the three groups(P>0.05).The groups of atrophic angulated fibrs are frenqently seen in the24month aged group，but no target fibers.The modified Gomori trichrome(MGT)staining showed that the mitochondrial reaction was significantly lower in12month and24month aged groups as compared with3month aged group(P<0.05).The mitochondrial average volume increase with aging.The volume density，numerical density，cristae membrane density were decreased with aging(P<0.05).Conclusion The fiber and mitochondria of vastus lateralis muscles has a significant structural changes with aging in rats.
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Key words aging vastus lateralis muscles mitochondria rat
生物体之出生、成长、衰老直至死亡，这是不可抗拒的自然规律。认识这一规律必须从生物学本质也就是衰老机制方面着手，但这一机制至今尚未完全阐明。生理性衰老时，生物体内生理功能发生有害性减退，这些生理性功能的改变取决于生物体内细胞水平的形态结构改变 [1] 。本文采用组织化学及电镜方法，初步观察了大鼠股外侧肌肌纤维及其线粒体形态结构的年龄性改变，并进行定量分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物 本实验选用SD雄性大鼠，将动物分为3组，分别为3月龄、12月龄和24月龄组，每组各10只。
1.2 方法
1.2.1 取材与制片 (1)用3%戊巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉(45mg/1000g体重)，取右股外侧肌的深部肌肉一小块，约0.3cm×0.3cm×0.5cm大小，迅速放入异戊烷中，并在液氮内速冻，低温冰箱保存，用于冰冻切片的组织化学染色。另取右股外侧肌的深部肌肉，分割成0.5mm 3 大小的小块，放入戊二醛磷酸缓冲液内进行预固定，用于制作电镜标本。(2)将右股外侧肌的肌肉冰冻标本在恒冷切片机中进行冰冻切片，方向呈肌纤维横切，厚度为7μm，分别进行以下几种染色:苏本精-伊红染色(HE)，改良Gomori三色染色(MGT)、腺苷三磷酸酶染色(ATPase)和还原型辅酶四唑还原酶染色(NADH-TR)。股外侧肌常规电镜制片，铅铀染色，每只大鼠每个部位观察两个铜网，每个铜网随机照相2张，电镜照片放大20000倍。
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1.2.2 形态计量分析 所有光镜切片及电镜照片选用新型图像分析软件，用计算机图像分析系统进行形态计量分析。资料进行单因素方差分析或秩和检验，利用SPSS/PC统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 光镜下股外侧肌结构的年龄性改变 不同年龄组大 鼠股外侧肌结构参数统计结果见表1。
表1 大鼠股外侧肌及其线粒体结构参数比较
注:与3月龄组相比ˇP<0.05，与12月龄组相比△P<0.05 24月龄组大鼠股外侧肌肌纤维平均截面积明显小于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比肌纤维平均截面积亦明显减小(P<0.05)，这提示随增龄股外侧肌肌纤维平均截面积而减少;24月龄组肌纤维面数密度明显高于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比差异无显著性(P>0.05);MGT积分光密度在24月龄组及12月龄组显著低于3月龄组(P<0.05)，24月龄组与12月龄组之间差异无显著性(P>0.05);ATPase染色示股外侧肌均呈Ⅱ型纤维;光镜下可见到24月龄组大鼠股外侧肌有群组性肌纤维萎缩;NADH-TR染色各年龄组均未见到靶纤维。
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2.2 电镜下股外侧肌线粒体形态结构年龄性改变 不同年龄组股外侧肌线粒体形态结构参数统计结果见表1。线粒体平均体积在24月龄组大于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比亦显著增大(P<0.05);线粒体体密度统计结果显示随增龄而减小，说明随增龄线粒体平均体积增大，而总体积减小。线粒体数密度随增龄而降低，24月龄组低于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组与3月龄组相比亦明显减小(P<0.05)，提示随增龄线粒体数量而减少。线粒体嵴膜密度在24月龄组小于12月龄组及3月龄组(P<0.05)，12月龄组小于3月龄组(P<0.05)，说明线粒体嵴膜密度随增龄而减小，即线粒体嵴减少。线粒体圆球度各年龄组之间差异无显著性(P>0.05)，即线粒体的外部形状随增龄无显著性改变。24月龄组股外侧肌可见变性的巨大线粒体，线粒体嵴明显减少，有的线粒体空泡化。
3 讨论
本实验经ATPase染色证明，大鼠股外侧肌仅含Ⅱ型纤维，同文献一致 [2] 。一般而言，Ⅱ型肌纤维形态结构的年龄性改变较Ⅰ型纤维为著 [3] ，主要表现为骨骼肌肌肉的体积和重量减少，最初有人认为骨骼肌体积减少是由于肌纤维的丢失所致，后来研究并没有发现骨骼肌纤维数目随增龄而减少 [4] 。我们的观察结果与后者一致，24月龄组大鼠股外侧肌和12月龄组及3月龄组相比其肌纤维面数密度没有降低，即肌纤维数目没有减少。本研究发现大鼠股外侧肌肌纤维平均截面积随增龄而减少，说明大鼠股外侧肌肌纤维随年龄而萎缩。因此，我们认为骨骼肌体积和重量随年龄的降低不是由于肌纤维数目的减少，而是由于纤维的萎缩所致。目前多数学者认为骨骼肌形态结构的年龄性改变是神经元性改变为主，肌源性改变少见;也有人提出由于 各种因素作用于前角运动神经元、周围神经、运动终板和肌肉，使运动单位减少导致肌肉萎缩。近来的研究发现老年人α运动神经元输入信号减少、神经元数目减少的现象 [5] 。老年人骨骼肌出现的靶样纤维及群组角状萎缩纤维等是神经元性改变的特征 [6] 。本实验NADH-TR染色，未发现24月龄组大鼠股外侧肌有靶纤维，这可能由于老年动物活动减少，肌萎缩的部分原因可能是废用性的，一般认为Ⅱ型纤维较易发生废用性萎缩 [3] ;研究报道，运动训练可使Ⅱ型纤维总面积增加27.6%，肌肉力量增加(174±31)%，改善肌肉功能 [7] 。大鼠股外侧肌MGT染色，发现在12月龄组及24月龄组大鼠反应能力降低，染色反应的强弱与线粒体数目有关。本实验中MGT染色的年龄性改变与电镜下观察到的线粒体数目的年龄性改变基本一致，我们认为MGT染色能比较客观地反映骨骼肌中线粒体的含量。线粒体是细胞的能量来源及能量转换系统，它在细胞对物的生物质合成、物质转运及信息传递过程中具有重要作用。
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本实验显示大鼠股外侧肌细胞内线粒体数密度随增龄而降低，说明线粒体数目减少;线粒体平均体积随增龄而增大，而线粒体体密度随增龄降低(即线粒体总体积减少)，增龄时线粒体体密度下降，认为是由于线粒体数目的减少所致，线粒体平均体积的增大可能是对线粒体数目减少的一种代偿性改变。在24月龄组大鼠股外侧肌细胞中，常可见到巨大变性线粒体的嵴明显减少，有的线粒体空泡化。股外侧肌中有的线粒体含有髓样层状结构，有人认为髓样层状结构是线粒体变性的一种标志 [8] 。嵴的作用是增加线粒体内膜的表面积，嵴的数目在不同细胞有很大差异，一般认为这与细胞代谢活性高低有关。文献中未见有关骨骼肌线粒体年龄性改变时嵴的定量分析，我们用形态计量学方法对不同年龄组大鼠股外侧线粒体嵴进行定量分析，实验结果显示随增龄大鼠股外侧肌线粒体嵴膜密度减小，即线粒体嵴减少。线粒体内膜和嵴是细胞进行氧化磷酸化的主要部位，是产生能量的场所，内膜和嵴的减少或破坏势必导致细胞氧化磷酸化功能障碍和能量生成的减少，这可能是导致骨骼肌细胞发生萎缩的原因之一。文献报道线粒体基因组(位于线粒体内膜上)功能异常与骨骼肌纤维萎缩密切相关 [9] 。线粒体内膜和嵴的多少与细胞呼吸功能及氧化状态呈正比，可以根据其减少的多少，推测细胞呼吸功能障碍和能量生成障碍的程度。总之，线粒体形态结构的改变与衰老的生物功能密切相关，因此研究线粒体形态结构的年龄性改变更具有生物学意义。
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参考文献
1 Herbener GH.A morphometric study of age-dependent chages in mitoˉchondial populations of mouse liver and heart.J Gerontol，1976，31(1):8-12.
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4 Brown M.Change in fiber size，not muscle，in ageing skeletal muscle.Age ageing，1987，16:244-246.
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5 Brooks SV.Skeletal muscle weeknees in old age.Med Sci Sports Exerc， 1994，26(4):432-439.
6 Progi P，Marchetti C，Scelsi R.Atumatic morphometric analysis of skeleˉtal muscle fibers in the aging man.The Anatomical Record，1987，217:39-43.
7 Parise G，Yarasheski KE.The utility of resistence exercise training and amino acid supplementation for reversing age-associated decrements in muscle protein mass and fuction.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2000，26(1):123-141.
, 百拇医药
8 Beregi E，Regious O，Huttle T，et al.Age-relatred changes in the skeletal muscle cells.Gerontology，1988，21:83-86.
9 Lee CM，LopezME，Weindruch R，et al.Association of age-related miˉtochondrial abnormalities with skeletel muscle fiber atrophy.Free Radic Biol Med，1998，25(8):964-972.
作者单位:221002徐州医学院附属医院神经科
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑使 臻), http://www.100md.com