四逆汤类方提取物对内毒素血症大鼠浆中PGI 2 、AgⅡ、IL-2和TNF含量的影响
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【摘要】 目的 观察四逆汤类方提取物(ESNTSD)对内毒素血症大鼠血浆、血清中血管紧张素Ⅱ(AgⅡ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素Ⅱ(IL-2)、前列环素(PGI 2 )含量的影响。方法 经ESNTSD提取物作用后，取内毒素休克模型的大鼠血浆、血清，采用放射免疫法测定上述指标。结果 与模型组比较，葱白、干姜加附子提取物(EAGO)，猪胆汁、干姜加附子提取物(EAGB)，甘草、干姜加附子提取物(EAGL)，人参、干姜加附子提取物(EAGG)可以减少内毒素血症大鼠血清中IL-2、TNF和血浆中AgⅡ含量，增加血浆中6-酮-前列腺素F 1α (6-keto-PGF 1α )含量。EAGO减少TNF含量的作用强于附子加干姜(EAG)。EAGO、EAGL、EAGB、EAGG减少IL-2含量的作用强于EAG。EAGL增加6-keto-PGF 1α 的作用强于EAG。EAGO和EAGL减少AgⅡ含量的作用强于EAG。结论 ESNTSD可以提高内毒素血症大鼠血浆中6-keto-PGF 1α 含量，降低血清中IL-2、TNF和血浆中AgⅡ的含量。EAGO、EAGL、EAGB、EAGG的药理作用特点不尽相同。
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关键词 四逆汤类方 内毒素血症 前列环素 血管紧张素Ⅱ 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)05-0385-03
The effect of the extracts from Sini Tang Serial Decoctions on the contents
of PGI 2 ，AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma of rats with endotoxemia
Ge Yingchun，Liu Ping，Ma Tianshu，et al.
Department of Pharmacology，Institute of TCM of Dalian，Dalian116013.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the effect of the extracts from Sini Tang Serial Decoctions(ESNTSD)on the contents of prostacyclin(PGI 2 )，angiotensinⅡ(AgⅡ)，interleukin-2(IL-2)and tumor necrosis factor(TNF)in the plasma or serum of rats with endotoxemia.Methods These parameters in the plasma or serum of rats in endotoxic shock were measured with radio immunoassay after being treated with the ESNTSD.Results Compared with the model group，our results indicated that ESNTSD increased significantly the content of6-keto-PGF 1α ，but decreased the contents of AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma and serum of rats with endotoxemia，extracts of aconite root，dried ginˉger and fistular onion stalk(EAGO)decreased significantly the contents of TNF compared with the extracts of aconite root and dried ginger(EAG).Extracts of aconite root，dried ginger and prepared licorice root(EAGL)，extracts of aˉconite root，dried ginger and pig’s bile(EAGB)，extracts of aconite root，dried ginger and ginseng(EAGG)and EAGO decreased significantly the contents of IL-2compared with the EAG.EAGL increased significantly the contents of6-keto-PGF 1α compared with the AGE.EAGL and EAGO decreased significantly the contents of AgⅡcompared with the AGE.Conclusion The results suggested that ESNTSD increased significantly the content of6-keto-PGF 1α，but decreased significantly the contnets of AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma or serum of rats with endotoxemia.Howevˉer，the character of effect of EAGO，EAGL，EAGB and EAGG on these parameters in the plasma of rats with endotoxˉemia were different.
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Key words Sini Tang Serial Decoctions endotoxemia prostacyclin angiotensinⅡinterleukin-2 tumor necrosis factor
“四逆汤类方”是以医圣张仲景制定的“四逆汤”为核心，构成的治少阴病，阳气虚阴寒盛，真阴也伤的一类方剂，用于亡阳厥逆之回阳救逆。其组方精良，配伍严谨，且有蕴涵丰富的配伍规律和以辨证为核心指导遣药组方的配伍原则。包括四逆汤、通脉四逆汤、人参四逆汤、茯苓四逆汤、白通汤、白通加猪胆汁汤、通脉四逆加猪胆汁汤等。现代医学有关“四逆汤”配伍的研究较多，目前尚未见“四逆汤类方”配伍规律研究的报道。本研究以“四逆汤”为核心，探讨附子、干姜分别与葱白、猪胆汁、人参配伍后的提取物对内毒素血症大鼠免疫功能和血管活性物质释放影响的差别，分析配伍使用的内在规律。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康SD大鼠56只，体重250～280g，雌雄兼用，由大连医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 药物 四逆汤类方提取物样品由吉林省中医中药研究院提供。干姜加附子提取物(EAG，413g生药/g)，葱白、干姜加附子提取物(EAGO，7275g生药/g)，猪胆汁、干姜加附子提取物(EAGB，961g生药/g)，甘草、干姜加附子提取物(EAGL，337g生药/g)，人参、干姜加附子提取物(EAGG，792g生药/g)。使用前用含5%吐温80的无菌生理盐水配制成注射液。
1.3 试剂和仪器 大肠杆菌内毒素(LPS，from E.Coli O 111 :B 4 ，Sigma)，无菌生理盐水配制2mg/ml溶液。PGI 2 的代谢产物6-酮-前列腺素F 1α (6-keto-PGF 1α )、IL-2、TNF、AgⅡ放免试剂盒(中国人民解放军总院开发中心)。γ计数器(GC-1200，中国西安)。
, 百拇医药 1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及方法 实验动物随机分7组，分别为对照组、模型组、EAG组、EAGO组、EAGL组、EAGB组和EAGG组，每组8只大鼠。大鼠经乙醚麻醉后，加药组分别经股静脉注射以下受试样品。EAG、EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组按每公斤体重予含8g生药的注射液5ml(5ml/kg)。作用 10min后，注射LPS10mg/kg，给药总体积均为10ml/kg。对照组(NS)注射含5%吐温80的等体积生理盐水。模型组(Mod)注射LPS10mg/kg补等体积生理盐水。作用4h后分别采血，按放射免疫试剂盒使用说明书的要求分离血浆、血清，测定各项放免指标。
1.4.2 检测项目 IL-2、TNF、6-keto-PGF 1α 、AgⅡ测定按放免检测试剂盒使用说明书操作，γ计数器测定。
1.5 统计学处理 测定结果以(pg/ml，ˉx±s)表示，数据经SPSS统计软件进行t检验及方差分析。
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2 实验结果
大鼠注射LPS后，血浆中6-keto-PGF 1α 、血清中IL-2、TNF含量均升高。与模型组比较，EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组可以显著降低IL-2和TNF的含量。与EAG组比较:EAGO减少TNF释放的作用显著增强。EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组减少IL-2释放的作用显著增强，EAGL增加6-keto-PGF 1α 的作用显著增强，EAGO和EAGL组减少AgⅡ释放的作用显著增强，详见表1。
表1 四逆汤类方提取物对内毒素血症大鼠血浆、血液中AgⅡ、IL-2、TNF和6-keto-PGF 1α 含量的影响
注:与Mod组比较ˇP<0.05，ˇˇP<0.01，ˇˇˇP<0.001;与EAG组比较△P<0.05，△△P<0.01。
3 讨论
, 百拇医药
四逆汤是回阳救逆的代表方，主治阳气衰微，阴寒内盛。可见于各种慢性病恶化加重发展到衰竭阶段，亦可是多种急性病病情发展迅速，正不敌邪的危重状态。四逆汤类方均可视为四逆汤之加减方[1] 。近年，有关四逆汤的现代医学研究已取得了许多成果，特别是对心血管系统的作用，以及对血管活性物质释放的影响 [2] 。迄今，尚未见四逆汤类方现代医学实验研究的报道。从以往中医临床研究资料来看，类方之间的用药依据病症有所侧重，似乎多用于调整心血管系统功能和改善免疫系统功能。从药理作用的角度分析，类方之间显然既有共性也各有特点。
内毒素可以造成动物的中毒性休克，并且注射LPS后随着时间的推移，动物的生理指标如血压等会发生变化，4h以后动脉血压与对照组比较发生明显变化 [3] 。研究表明，不同原因引起的休克其炎性细胞因子和介质的分泌不同，内毒素血症时细胞因子分泌增加 [4]。感染性休克患者的血浆TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平明显高于败血症患者。其中TNF-α和IL-2之间，IL-1β和IL-6之间有明显的相关性 [5] 。TNF是在多种因素的刺激诱导下，由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生的。给实验动物注射LPS后，血清中出现TNF。内毒素与TNF及其它细胞因子在感染性休克发病中起协同作用。在本实验中，模型组TNF含量升高，ESNTSD可以显著降低血清中TNF的含量，其中EAGO 减少TNF释放的作用强于EAG组。白细胞介素Ⅱ是一种由T淋巴细胞分泌，促进T淋巴细胞增殖的细胞因子。感染性休克时，其水平与TNF相关。在本实验中，内毒素血症大鼠IL-2释放增加。ESNTSD可以显著降低血清中IL-2的含量，各组降低IL-2含量的作用均强于EAG组。
, 百拇医药
血管活性物质的调节在休克的转归中发挥重要作用。AgⅡ由血管内皮细胞血管紧张素转换酶转化生成，是强烈的血管收缩剂。休克时血浆中AgⅡ含量增加。在本实验中，内毒素血症大鼠AgⅡ含量较对照组显著升高，ESNTSD可以显著降低血浆中AgⅡ的含量，其中EAGO和EAGL组减少AgⅡ释放的作用显著强于EAG组。PGI 2 是内皮细胞合成和释放的血管舒张因子，可扩张血管，抑制血小板聚集。因缺氧、酸中毒或内毒素作用，血管内皮可严重受损，PGI 2 产生减少。在本实验中，内毒素血症大鼠PGI 2 含量反应性升高。与模型组比较，ESNTSD可以显著增加血浆中PGI 2 的含量，其中EAGL增加PGI 2 释放的作用强于其他组。本实验结果表明，对内毒素血症大鼠模型免疫系统的调节和血管活性物质的释放，类方之间有其共性。特别是对IL-2含量的影响，类方之间差别不明显。但在其特点上又有差别，葱白、干姜加附子(白通汤)对大鼠内毒素血症中降低TNF的作用似乎强于其他类方。而甘草、干姜加附子(四逆汤)在调节血管活性物质释放方面强于其他类方。也许正是这种药理作用的差别，客观的反映了前人以辨证为核心的遣方用药原则，以及四逆汤类方蕴含丰富的配伍规律。
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参考文献
1 顾勤，汪红，顾武军.探析《伤寒论》以“四逆”命名的治厥方证治特点及现代药理基础.中医药学报，2001，29(1):29-32.
2 吴伟康，周琳，孙慧兰.四逆汤对心肌缺血大鼠心肌内皮素影响的实验研究.中国中西医结合杂志，2002，22(8):610-612.
3 李萍，陆松敏，李著，等.磷脂酶A 2 抑制剂地塞米松对内毒素血症动物的保护效应.创伤外科杂志，2001，3(2):116-118.
4 赵克森，金丽娟.休克的细胞和分子基础，第1版.北京:科学出版社，2002，237-247.
5 Endo S，Inada K，Inoue Y，et al.Two types of septic shock classified by the plasma levels of cytokines and endotoxin.Circ Shock，1992，38(4):264-274.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(NO.39930210)
作者单位:116013辽宁大连市中医研究所
130021吉林省中医中药研究院
(收稿日期:2004-02-04)
(编辑贝 子), 百拇医药
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关键词 四逆汤类方 内毒素血症 前列环素 血管紧张素Ⅱ 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)05-0385-03
The effect of the extracts from Sini Tang Serial Decoctions on the contents
of PGI 2 ，AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma of rats with endotoxemia
Ge Yingchun，Liu Ping，Ma Tianshu，et al.
Department of Pharmacology，Institute of TCM of Dalian，Dalian116013.
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【Abstract】 Objective To explore the effect of the extracts from Sini Tang Serial Decoctions(ESNTSD)on the contents of prostacyclin(PGI 2 )，angiotensinⅡ(AgⅡ)，interleukin-2(IL-2)and tumor necrosis factor(TNF)in the plasma or serum of rats with endotoxemia.Methods These parameters in the plasma or serum of rats in endotoxic shock were measured with radio immunoassay after being treated with the ESNTSD.Results Compared with the model group，our results indicated that ESNTSD increased significantly the content of6-keto-PGF 1α ，but decreased the contents of AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma and serum of rats with endotoxemia，extracts of aconite root，dried ginˉger and fistular onion stalk(EAGO)decreased significantly the contents of TNF compared with the extracts of aconite root and dried ginger(EAG).Extracts of aconite root，dried ginger and prepared licorice root(EAGL)，extracts of aˉconite root，dried ginger and pig’s bile(EAGB)，extracts of aconite root，dried ginger and ginseng(EAGG)and EAGO decreased significantly the contents of IL-2compared with the EAG.EAGL increased significantly the contents of6-keto-PGF 1α compared with the AGE.EAGL and EAGO decreased significantly the contents of AgⅡcompared with the AGE.Conclusion The results suggested that ESNTSD increased significantly the content of6-keto-PGF 1α，but decreased significantly the contnets of AgⅡ，IL-2and TNF in the plasma or serum of rats with endotoxemia.Howevˉer，the character of effect of EAGO，EAGL，EAGB and EAGG on these parameters in the plasma of rats with endotoxˉemia were different.
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Key words Sini Tang Serial Decoctions endotoxemia prostacyclin angiotensinⅡinterleukin-2 tumor necrosis factor
“四逆汤类方”是以医圣张仲景制定的“四逆汤”为核心，构成的治少阴病，阳气虚阴寒盛，真阴也伤的一类方剂，用于亡阳厥逆之回阳救逆。其组方精良，配伍严谨，且有蕴涵丰富的配伍规律和以辨证为核心指导遣药组方的配伍原则。包括四逆汤、通脉四逆汤、人参四逆汤、茯苓四逆汤、白通汤、白通加猪胆汁汤、通脉四逆加猪胆汁汤等。现代医学有关“四逆汤”配伍的研究较多，目前尚未见“四逆汤类方”配伍规律研究的报道。本研究以“四逆汤”为核心，探讨附子、干姜分别与葱白、猪胆汁、人参配伍后的提取物对内毒素血症大鼠免疫功能和血管活性物质释放影响的差别，分析配伍使用的内在规律。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康SD大鼠56只，体重250～280g，雌雄兼用，由大连医科大学实验动物中心提供。
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1.2 药物 四逆汤类方提取物样品由吉林省中医中药研究院提供。干姜加附子提取物(EAG，413g生药/g)，葱白、干姜加附子提取物(EAGO，7275g生药/g)，猪胆汁、干姜加附子提取物(EAGB，961g生药/g)，甘草、干姜加附子提取物(EAGL，337g生药/g)，人参、干姜加附子提取物(EAGG，792g生药/g)。使用前用含5%吐温80的无菌生理盐水配制成注射液。
1.3 试剂和仪器 大肠杆菌内毒素(LPS，from E.Coli O 111 :B 4 ，Sigma)，无菌生理盐水配制2mg/ml溶液。PGI 2 的代谢产物6-酮-前列腺素F 1α (6-keto-PGF 1α )、IL-2、TNF、AgⅡ放免试剂盒(中国人民解放军总院开发中心)。γ计数器(GC-1200，中国西安)。
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1.4.1 实验分组及方法 实验动物随机分7组，分别为对照组、模型组、EAG组、EAGO组、EAGL组、EAGB组和EAGG组，每组8只大鼠。大鼠经乙醚麻醉后，加药组分别经股静脉注射以下受试样品。EAG、EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组按每公斤体重予含8g生药的注射液5ml(5ml/kg)。作用 10min后，注射LPS10mg/kg，给药总体积均为10ml/kg。对照组(NS)注射含5%吐温80的等体积生理盐水。模型组(Mod)注射LPS10mg/kg补等体积生理盐水。作用4h后分别采血，按放射免疫试剂盒使用说明书的要求分离血浆、血清，测定各项放免指标。
1.4.2 检测项目 IL-2、TNF、6-keto-PGF 1α 、AgⅡ测定按放免检测试剂盒使用说明书操作，γ计数器测定。
1.5 统计学处理 测定结果以(pg/ml，ˉx±s)表示，数据经SPSS统计软件进行t检验及方差分析。
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2 实验结果
大鼠注射LPS后，血浆中6-keto-PGF 1α 、血清中IL-2、TNF含量均升高。与模型组比较，EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组可以显著降低IL-2和TNF的含量。与EAG组比较:EAGO减少TNF释放的作用显著增强。EAGO、EAGL、EAGB、EAGG组减少IL-2释放的作用显著增强，EAGL增加6-keto-PGF 1α 的作用显著增强，EAGO和EAGL组减少AgⅡ释放的作用显著增强，详见表1。
表1 四逆汤类方提取物对内毒素血症大鼠血浆、血液中AgⅡ、IL-2、TNF和6-keto-PGF 1α 含量的影响
注:与Mod组比较ˇP<0.05，ˇˇP<0.01，ˇˇˇP<0.001;与EAG组比较△P<0.05，△△P<0.01。
3 讨论
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四逆汤是回阳救逆的代表方，主治阳气衰微，阴寒内盛。可见于各种慢性病恶化加重发展到衰竭阶段，亦可是多种急性病病情发展迅速，正不敌邪的危重状态。四逆汤类方均可视为四逆汤之加减方[1] 。近年，有关四逆汤的现代医学研究已取得了许多成果，特别是对心血管系统的作用，以及对血管活性物质释放的影响 [2] 。迄今，尚未见四逆汤类方现代医学实验研究的报道。从以往中医临床研究资料来看，类方之间的用药依据病症有所侧重，似乎多用于调整心血管系统功能和改善免疫系统功能。从药理作用的角度分析，类方之间显然既有共性也各有特点。
内毒素可以造成动物的中毒性休克，并且注射LPS后随着时间的推移，动物的生理指标如血压等会发生变化，4h以后动脉血压与对照组比较发生明显变化 [3] 。研究表明，不同原因引起的休克其炎性细胞因子和介质的分泌不同，内毒素血症时细胞因子分泌增加 [4]。感染性休克患者的血浆TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平明显高于败血症患者。其中TNF-α和IL-2之间，IL-1β和IL-6之间有明显的相关性 [5] 。TNF是在多种因素的刺激诱导下，由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生的。给实验动物注射LPS后，血清中出现TNF。内毒素与TNF及其它细胞因子在感染性休克发病中起协同作用。在本实验中，模型组TNF含量升高，ESNTSD可以显著降低血清中TNF的含量，其中EAGO 减少TNF释放的作用强于EAG组。白细胞介素Ⅱ是一种由T淋巴细胞分泌，促进T淋巴细胞增殖的细胞因子。感染性休克时，其水平与TNF相关。在本实验中，内毒素血症大鼠IL-2释放增加。ESNTSD可以显著降低血清中IL-2的含量，各组降低IL-2含量的作用均强于EAG组。
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血管活性物质的调节在休克的转归中发挥重要作用。AgⅡ由血管内皮细胞血管紧张素转换酶转化生成，是强烈的血管收缩剂。休克时血浆中AgⅡ含量增加。在本实验中，内毒素血症大鼠AgⅡ含量较对照组显著升高，ESNTSD可以显著降低血浆中AgⅡ的含量，其中EAGO和EAGL组减少AgⅡ释放的作用显著强于EAG组。PGI 2 是内皮细胞合成和释放的血管舒张因子，可扩张血管，抑制血小板聚集。因缺氧、酸中毒或内毒素作用，血管内皮可严重受损，PGI 2 产生减少。在本实验中，内毒素血症大鼠PGI 2 含量反应性升高。与模型组比较，ESNTSD可以显著增加血浆中PGI 2 的含量，其中EAGL增加PGI 2 释放的作用强于其他组。本实验结果表明，对内毒素血症大鼠模型免疫系统的调节和血管活性物质的释放，类方之间有其共性。特别是对IL-2含量的影响，类方之间差别不明显。但在其特点上又有差别，葱白、干姜加附子(白通汤)对大鼠内毒素血症中降低TNF的作用似乎强于其他类方。而甘草、干姜加附子(四逆汤)在调节血管活性物质释放方面强于其他类方。也许正是这种药理作用的差别，客观的反映了前人以辨证为核心的遣方用药原则，以及四逆汤类方蕴含丰富的配伍规律。
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参考文献
1 顾勤，汪红，顾武军.探析《伤寒论》以“四逆”命名的治厥方证治特点及现代药理基础.中医药学报，2001，29(1):29-32.
2 吴伟康，周琳，孙慧兰.四逆汤对心肌缺血大鼠心肌内皮素影响的实验研究.中国中西医结合杂志，2002，22(8):610-612.
3 李萍，陆松敏，李著，等.磷脂酶A 2 抑制剂地塞米松对内毒素血症动物的保护效应.创伤外科杂志，2001，3(2):116-118.
4 赵克森，金丽娟.休克的细胞和分子基础，第1版.北京:科学出版社，2002，237-247.
5 Endo S，Inada K，Inoue Y，et al.Two types of septic shock classified by the plasma levels of cytokines and endotoxin.Circ Shock，1992，38(4):264-274.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(NO.39930210)
作者单位:116013辽宁大连市中医研究所
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(收稿日期:2004-02-04)
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