人指甲氨基酸指纹信息及其药效分析
【摘要】 目的 探讨中药人指甲药效成分及其内在质量指标性成分，为临床疾病诊断提供成年健康人指甲氨基酸指纹图谱信息。方法 选取成年健康人指甲作样本，采用6mol/L盐酸和4mol/L氢氧化锂试液水解角质蛋白，进行高速氨基酸色谱分析测定氨基酸组成。结果 成年健康人指甲中的角蛋白总量达95.37%，为人指甲的主体成分，其中包含了人体必需的8种必需氨基酸、2种半必需氨基酸和8种非必需氨基酸，以谷氨酸、胱氨酸和精氨酸为高，分别为16.82%、10.24%和9%。人指甲中高含量的谷氨酸与人指甲的止血、化腐功效有关;人指甲中纤维性角蛋白中富含的胱氨酸(Cystine)提供了牢固的二硫键，使指甲具有张力和硬度的生物学特性。结论 胱氨酸及其硫是其特征性元素，含量高低可反映坚硬程度和发生疾病的可能性;谷氨酸是人指甲的主要成分之一，这两种氨基酸具有鉴别意义，及临床诊断的价值。
关键词人指甲 角蛋白 谷氨酸 胱氨酸 氨基酸分析
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0387-03
, http://www.100md.com
Analysis of characteristic constitutes of amino acids
in human fingernail keratin
Zhang Jun，Chen Jianwei，Li Xiang，et al.
Huaian Institute for Drug Control，Huaian223200.
【Abstract】 Objective To probe into drug efficacy and internal quality markcomponents of human fingernail(traditional Chinese medicine)and provide the fingerprint information of amino acid of adult health human fingernail for clinicdisease diagnosis.Methods To choose adult health human fingernail as sample，the keratin of the fingerˉnail was hydrolyzed to adopt6mol/L chlorhydric acid and4mol/L lithium hydroxide test solutions.And the constitutes of amino acid were assayed by high-speed amino acid chromatographic analysis.Results The keratin of adult health human fingernail content to95.37%is principal component of human fingernail.There are eight essential amino acid，two semi-essential amino acid and eight non-essential amino acid of human body in one，glutamic acid，cysˉtine andarginine in keratin is16.82%，10.24%and9%respectively.High content glutamic acid of human finger nail relate with efficacy of human ungual hematischesis，cure decay;fibrous keratin of human finger nail contain rich cystine to provide strongdisulfide bond to finger nail which has biology characteristic of tension and rigidity.Concluˉsion Cystine and its sulfur are human ungual characteristic constituents;its content could reflect the rigidity of huˉman ungual and prognosticate to engender morbid possibility.Glutamic acid is one of constituents of human ungual mail;above two amino acids have identification significance and value of clinical diagnosis.
, 百拇医药
Key words human finger nail keratin glutamic acid cystine amino acid analysis
人指甲(Unguis Hominis)名见于《本草衍义》，入药始记于唐代陈藏器·《本草拾遗》，又名手指甲(《日华子本草》)、人退(《眼科龙木论》)、爪甲、筋退(《本草纲目》)。1989年收载于《江苏省中药材标准》 [1] ，为人科(Hominidae)人(Homo sapiens L.)的手指甲。性平，味甘、咸，具有去瘀血，消翳障功效。临床用于鼻衄、尿血、喉蛾、目生翳障、中耳炎 [2] 。人指甲为指端皮肤之衍生物，人指甲虽然起源于皮肤的表皮，但与皮肤表皮的角化有明显的不同，皮肤表皮的角化(Epiˉdermal keratinization)是指角质形成细胞成熟的最后阶段，其表现是表皮细胞转变成较坚韧干燥的鳞片状的死细胞，常称软角蛋白(Soft keratin)，有通透性，保持了体液和电解质的稳定，其所形成的角化层厚度受局部环境因素的影响，摩擦和长期受压的部位常使发生角化垫，如手工工人手掌的胼胝(Callus)。指甲所产生的角蛋白比表皮的角化层更坚硬，故常称硬角蛋白(Hard keratin)，它使得指甲具有相当高的韧性、弹性和高电阻抗，而且相当干燥，能抑制附于指甲表面的微生物的繁殖。关于其角蛋白的组成迄今未见报道。为探讨其角蛋白的含量、结构特征及其氨基酸组成与药效的关系，本研究对其进行了氨基酸组成分析。
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1 仪器与试药
1.1 仪器 日立835-50型高速氨基酸自动分析仪。
1.2 试药 人指甲，采自南京中医药大学23名19～21岁成年健康大学生的手指甲，经南京中医药大学中药鉴定学教研室陈建伟教授鉴定为人(Homo sapiens L.)的手指甲。其它试剂均为AR级。
2 样品液的制备
2.1 样品预处理 取人手指甲加洗涤剂，超声清洗3次，离子水超声清洗3次，低温干燥，研细，过40目筛，加氯仿-甲醇(2:1)脱脂，作为供试品。
2.2 酸水解液的制备 精密称取干燥至恒重样品粉末100 mg，置安瓿底部加6mol/L HCl液15ml，通氮气，迅速在喷灯上封口，置130℃烘箱内水解6h，取出置冷至室温，打开管口，将水解液过滤至1000ml容量瓶中，用0.01mol/L HCl缓冲液洗安瓿及滤纸，并定容至刻度，准确称取此稀释的水解液2.0ml，置小蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用2.0ml蒸馏水溶解并蒸干，如此反复操作2～3次，挥尽HCl气体，然后准确加入0.02mol/L HCl液2.0ml，即得酸水解液。
, 百拇医药
2.3 碱水解液的制备 精密称取干燥至恒重的样品粉末80mg，置安瓿底部，加4mol/L LiOH液10ml，通氮气，迅速在喷灯上封口，置130℃烘箱中水解6h，取出放冷至室温，打开管口，将水解液定量轻移至100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得碱水解液。
3 氨基酸测定
3.1 测定条件 分析柱:内径2.6mm，柱长150mm，日立2619型树脂;去氨柱:内径4mm，柱长50mm，日立2650型树脂;柱温:53℃，缓冲液流速:0.225ml/min;泵压:80～130kg/cm;茚三酮流速:0.3ml/min;泵压:15kg/cm;缓冲液改变次数:5次;分析周期:72min;进样量:50μl;检测器光密度:一通道570nm，二通道440nm(用于脯氨酸测定)。
3.2 测定 准确吸取上述样品液各3ml，加入0.02mol/l HCl液至50.0ml，摇匀后，准确吸取50μl，分别上机测定，测定结果见表1。
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4 讨论与小结
4.1 由表1可见，健康大学生手指甲中的角蛋白总量达95.37%，构成了指甲的主体成分，从蛋白质的组成来看，含有18种氨基酸，包含了人体必需的8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸，其中精氨酸含量占9%;非必需氨基酸8种，以谷氨酸和胱氨酸为高，分别为16.82%和10.24%。值得引起注意的是指甲中高含量的谷氨酸可能与指甲的止血、化腐功效有关，因谷氨酸能治疗功能性子宫出血，能促进消化道粘膜的粘蛋白的生成，是治疗消化道溃疡的药物;胱氨酸有促毛发生长，预防早期衰老和解毒作用，临床上用于先天性高半胱氨酸尿症及各种秃发症 [1] 。
4.2 《灵枢·邪客》曰:“五谷之入于胃也，其糟粕、津液、宗气分为三隧。……营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血，以荣四末，…卫气者，出其悍气之疾，而先行于四末、分肉、皮肤之间”营卫气血循行四肢末端爪甲，此言说明中医早就注意将指甲视为人体健康与否的窗口，指甲中成分的变化可预测疾病发生的可能。本研究提供正常成年人指甲蛋白质氨基酸的组成比，反映了正常人的基本营养状况，这对进一步探讨不同疾病患者的指甲中氨基酸组成规律，进而诊断疾病具有重要意义。现代疾病谱中许多疾病与人体的免疫功能有关，越来越多的研究表明人体必需氨基酸与免疫功能有极其重要的关系 [2] ，归纳起来有以下三点。
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4.2.1 正常量和正常比例的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸(这些氨基酸为支链氨基酸，具有促进蛋白质合成和抑制蛋白质分解作用)是维持免疫功能所必需的。
表1 成年大学生手指甲中氨基酸组成及含量氨基酸
注: ˇ 指含量较多的成分
4.2.2 苯丙氨酸是形成抗体和抗体细胞所必需的。苯丙氨酸(Phenylalanine)也是吞噬细胞吞噬功能所必需的氨基酸。苯丙氨酸不足而产生的原发性或继发性的营养不良，使免疫功能降低，机体对传染病敏感，苯丙酮酸尿症的小儿是最好的临床例证。由于苯丙酮酸代谢不正常，这种患儿很易得传染病。图1 苯丙氨酸代谢图
4.2.3 色氨酸影响体液免疫和细胞免疫。色氨酸(Typtoˉphan)可通过以下两个途径促进抗体合成:其一，色氨酸能调节细胞膜RNA的合成及转运。这种氨基酸能够增加RNA聚合酶I和RNA聚合酶II的活性，促进RNA合成;它还能促进细胞核中的RNA转到细胞质中去。其二，色氨酸促进多核蛋白体聚集。多核蛋白体的重型聚集是合成蛋白质的先决条件。由于色氨酸的这些作用促进了蛋白质合成，即也能促进抗体合成。所以，机体中色氨酸的含量不足必然影响免疫球蛋白合成，使免疫功能降低。色氨酸不足还会降低网状内皮系统的清除功能。临床上患Hartnup’s病(一种先天性疾病)的人由于小肠和肾小管吸收色氨酸功能不足，机体缺乏色氨酸，使得免疫功能低下，极易得传染病。
, 百拇医药
4.3 指甲中的硬角蛋白为一种纤维蛋白，含水量很少。X-射线和电镜观察表明，它由角蛋白丝，亦称张力丝(Tonofilament)组成，与表面平行排列，并与生长方向垂直，这种排列方式有助于指甲不发生纵裂 [3] 。本研究表明，这种纤维性的角蛋白富含胱氨酸(Cystine)，可提供牢固的二硫键，使甲具有张力和硬度。指甲的这种生物化学特点使其具有坚硬性和不脱落性，也说明硫在指甲的生长发育中起着举足轻重作用，是指甲的特征性元素，其含量高低可反映指甲的坚硬程度和发生疾病的可能性，既具有鉴别意义，又具有临床诊断的价值。 图2 胱氨酸(Cystine)分子的结构图
综上所述，正常健康人指甲中氨基酸的组成及含量，既可用作健康人评价的基准，又可作为评价指甲生药的内在质量的指标成分。对中医藏象学说、临床诊断学及中药鉴定学的研究具有重要的参考价值。
参考文献
1 蒋滢.氨基酸的应用，北京:世界图书出版公司，1996，12-13.
, 百拇医药
2 蒋立锐.氨基酸与免疫功能.氨基酸杂志，1981，(2):60-62.
3 成令忠主编.组织学，第2版.北京:人民卫生出版社，1993，1029.
基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助项目(NO:96061)
作者单位:223200江苏淮安淮安市药品检验所
210029南京中医药大学
(收稿日期:2003-11-26)
(编辑黄 杰), 百拇医药
关键词人指甲 角蛋白 谷氨酸 胱氨酸 氨基酸分析
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0387-03
, http://www.100md.com
Analysis of characteristic constitutes of amino acids
in human fingernail keratin
Zhang Jun，Chen Jianwei，Li Xiang，et al.
Huaian Institute for Drug Control，Huaian223200.
【Abstract】 Objective To probe into drug efficacy and internal quality markcomponents of human fingernail(traditional Chinese medicine)and provide the fingerprint information of amino acid of adult health human fingernail for clinicdisease diagnosis.Methods To choose adult health human fingernail as sample，the keratin of the fingerˉnail was hydrolyzed to adopt6mol/L chlorhydric acid and4mol/L lithium hydroxide test solutions.And the constitutes of amino acid were assayed by high-speed amino acid chromatographic analysis.Results The keratin of adult health human fingernail content to95.37%is principal component of human fingernail.There are eight essential amino acid，two semi-essential amino acid and eight non-essential amino acid of human body in one，glutamic acid，cysˉtine andarginine in keratin is16.82%，10.24%and9%respectively.High content glutamic acid of human finger nail relate with efficacy of human ungual hematischesis，cure decay;fibrous keratin of human finger nail contain rich cystine to provide strongdisulfide bond to finger nail which has biology characteristic of tension and rigidity.Concluˉsion Cystine and its sulfur are human ungual characteristic constituents;its content could reflect the rigidity of huˉman ungual and prognosticate to engender morbid possibility.Glutamic acid is one of constituents of human ungual mail;above two amino acids have identification significance and value of clinical diagnosis.
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Key words human finger nail keratin glutamic acid cystine amino acid analysis
人指甲(Unguis Hominis)名见于《本草衍义》，入药始记于唐代陈藏器·《本草拾遗》，又名手指甲(《日华子本草》)、人退(《眼科龙木论》)、爪甲、筋退(《本草纲目》)。1989年收载于《江苏省中药材标准》 [1] ，为人科(Hominidae)人(Homo sapiens L.)的手指甲。性平，味甘、咸，具有去瘀血，消翳障功效。临床用于鼻衄、尿血、喉蛾、目生翳障、中耳炎 [2] 。人指甲为指端皮肤之衍生物，人指甲虽然起源于皮肤的表皮，但与皮肤表皮的角化有明显的不同，皮肤表皮的角化(Epiˉdermal keratinization)是指角质形成细胞成熟的最后阶段，其表现是表皮细胞转变成较坚韧干燥的鳞片状的死细胞，常称软角蛋白(Soft keratin)，有通透性，保持了体液和电解质的稳定，其所形成的角化层厚度受局部环境因素的影响，摩擦和长期受压的部位常使发生角化垫，如手工工人手掌的胼胝(Callus)。指甲所产生的角蛋白比表皮的角化层更坚硬，故常称硬角蛋白(Hard keratin)，它使得指甲具有相当高的韧性、弹性和高电阻抗，而且相当干燥，能抑制附于指甲表面的微生物的繁殖。关于其角蛋白的组成迄今未见报道。为探讨其角蛋白的含量、结构特征及其氨基酸组成与药效的关系，本研究对其进行了氨基酸组成分析。
, http://www.100md.com
1 仪器与试药
1.1 仪器 日立835-50型高速氨基酸自动分析仪。
1.2 试药 人指甲，采自南京中医药大学23名19～21岁成年健康大学生的手指甲，经南京中医药大学中药鉴定学教研室陈建伟教授鉴定为人(Homo sapiens L.)的手指甲。其它试剂均为AR级。
2 样品液的制备
2.1 样品预处理 取人手指甲加洗涤剂，超声清洗3次，离子水超声清洗3次，低温干燥，研细，过40目筛，加氯仿-甲醇(2:1)脱脂，作为供试品。
2.2 酸水解液的制备 精密称取干燥至恒重样品粉末100 mg，置安瓿底部加6mol/L HCl液15ml，通氮气，迅速在喷灯上封口，置130℃烘箱内水解6h，取出置冷至室温，打开管口，将水解液过滤至1000ml容量瓶中，用0.01mol/L HCl缓冲液洗安瓿及滤纸，并定容至刻度，准确称取此稀释的水解液2.0ml，置小蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用2.0ml蒸馏水溶解并蒸干，如此反复操作2～3次，挥尽HCl气体，然后准确加入0.02mol/L HCl液2.0ml，即得酸水解液。
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2.3 碱水解液的制备 精密称取干燥至恒重的样品粉末80mg，置安瓿底部，加4mol/L LiOH液10ml，通氮气，迅速在喷灯上封口，置130℃烘箱中水解6h，取出放冷至室温，打开管口，将水解液定量轻移至100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得碱水解液。
3 氨基酸测定
3.1 测定条件 分析柱:内径2.6mm，柱长150mm，日立2619型树脂;去氨柱:内径4mm，柱长50mm，日立2650型树脂;柱温:53℃，缓冲液流速:0.225ml/min;泵压:80～130kg/cm;茚三酮流速:0.3ml/min;泵压:15kg/cm;缓冲液改变次数:5次;分析周期:72min;进样量:50μl;检测器光密度:一通道570nm，二通道440nm(用于脯氨酸测定)。
3.2 测定 准确吸取上述样品液各3ml，加入0.02mol/l HCl液至50.0ml，摇匀后，准确吸取50μl，分别上机测定，测定结果见表1。
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4 讨论与小结
4.1 由表1可见，健康大学生手指甲中的角蛋白总量达95.37%，构成了指甲的主体成分，从蛋白质的组成来看，含有18种氨基酸，包含了人体必需的8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸，其中精氨酸含量占9%;非必需氨基酸8种，以谷氨酸和胱氨酸为高，分别为16.82%和10.24%。值得引起注意的是指甲中高含量的谷氨酸可能与指甲的止血、化腐功效有关，因谷氨酸能治疗功能性子宫出血，能促进消化道粘膜的粘蛋白的生成，是治疗消化道溃疡的药物;胱氨酸有促毛发生长，预防早期衰老和解毒作用，临床上用于先天性高半胱氨酸尿症及各种秃发症 [1] 。
4.2 《灵枢·邪客》曰:“五谷之入于胃也，其糟粕、津液、宗气分为三隧。……营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血，以荣四末，…卫气者，出其悍气之疾，而先行于四末、分肉、皮肤之间”营卫气血循行四肢末端爪甲，此言说明中医早就注意将指甲视为人体健康与否的窗口，指甲中成分的变化可预测疾病发生的可能。本研究提供正常成年人指甲蛋白质氨基酸的组成比，反映了正常人的基本营养状况，这对进一步探讨不同疾病患者的指甲中氨基酸组成规律，进而诊断疾病具有重要意义。现代疾病谱中许多疾病与人体的免疫功能有关，越来越多的研究表明人体必需氨基酸与免疫功能有极其重要的关系 [2] ，归纳起来有以下三点。
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4.2.1 正常量和正常比例的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸(这些氨基酸为支链氨基酸，具有促进蛋白质合成和抑制蛋白质分解作用)是维持免疫功能所必需的。
表1 成年大学生手指甲中氨基酸组成及含量氨基酸
注: ˇ 指含量较多的成分
4.2.2 苯丙氨酸是形成抗体和抗体细胞所必需的。苯丙氨酸(Phenylalanine)也是吞噬细胞吞噬功能所必需的氨基酸。苯丙氨酸不足而产生的原发性或继发性的营养不良，使免疫功能降低，机体对传染病敏感，苯丙酮酸尿症的小儿是最好的临床例证。由于苯丙酮酸代谢不正常，这种患儿很易得传染病。图1 苯丙氨酸代谢图
4.2.3 色氨酸影响体液免疫和细胞免疫。色氨酸(Typtoˉphan)可通过以下两个途径促进抗体合成:其一，色氨酸能调节细胞膜RNA的合成及转运。这种氨基酸能够增加RNA聚合酶I和RNA聚合酶II的活性，促进RNA合成;它还能促进细胞核中的RNA转到细胞质中去。其二，色氨酸促进多核蛋白体聚集。多核蛋白体的重型聚集是合成蛋白质的先决条件。由于色氨酸的这些作用促进了蛋白质合成，即也能促进抗体合成。所以，机体中色氨酸的含量不足必然影响免疫球蛋白合成，使免疫功能降低。色氨酸不足还会降低网状内皮系统的清除功能。临床上患Hartnup’s病(一种先天性疾病)的人由于小肠和肾小管吸收色氨酸功能不足，机体缺乏色氨酸，使得免疫功能低下，极易得传染病。
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4.3 指甲中的硬角蛋白为一种纤维蛋白，含水量很少。X-射线和电镜观察表明，它由角蛋白丝，亦称张力丝(Tonofilament)组成，与表面平行排列，并与生长方向垂直，这种排列方式有助于指甲不发生纵裂 [3] 。本研究表明，这种纤维性的角蛋白富含胱氨酸(Cystine)，可提供牢固的二硫键，使甲具有张力和硬度。指甲的这种生物化学特点使其具有坚硬性和不脱落性，也说明硫在指甲的生长发育中起着举足轻重作用，是指甲的特征性元素，其含量高低可反映指甲的坚硬程度和发生疾病的可能性，既具有鉴别意义，又具有临床诊断的价值。 图2 胱氨酸(Cystine)分子的结构图
综上所述，正常健康人指甲中氨基酸的组成及含量，既可用作健康人评价的基准，又可作为评价指甲生药的内在质量的指标成分。对中医藏象学说、临床诊断学及中药鉴定学的研究具有重要的参考价值。
参考文献
1 蒋滢.氨基酸的应用，北京:世界图书出版公司，1996，12-13.
, 百拇医药
2 蒋立锐.氨基酸与免疫功能.氨基酸杂志，1981，(2):60-62.
3 成令忠主编.组织学，第2版.北京:人民卫生出版社，1993，1029.
基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助项目(NO:96061)
作者单位:223200江苏淮安淮安市药品检验所
210029南京中医药大学
(收稿日期:2003-11-26)
(编辑黄 杰), 百拇医药