胃癌发生过程中微卫星不稳定性的研究(基金项目)
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基金项目:江苏省科委社会发展项目资助，编号:BS98028
【摘要】 目的 检测胃癌及癌前病变组织中微卫星不稳定性(MSI)的存在及发生频率，探讨其在胃癌发生过程中可能的作用。方法 对30例胃癌、30例异型增生、40例肠上皮化生组织标本分别提取病变及相应正常组织的DNA，应用银染PCR-SSCP技术检测5个微卫星位点的不稳定性。结果 胃癌组织MSI的发生率为23.3%，胃窦癌MSI的发生率显著高于贲门癌(P=0.044)。异型增生组织的MSI发生率为30%，肠上皮化生组织MSI发生率为20%，且全部出现在中度以上肠化生组织中。结论 MSI是胃癌多步骤发生过程中早期的异常分子事件，可能有助于胃粘膜细胞恶性转化表型的获得，在胃癌的形成过程中具有重要作用。
关键词 胃肿瘤 异型增生 肠化生 微卫星不稳定性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)05-0392-03
Microsatellite instability in the development of gastric cancer
Liu Ping，Zhang Xiaoyong，Shao Yun，et al.
Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing210029.
【Abstract】 Objective To investigate the existence of microsatellite instability(MSI)in precancerous lesions and gastric cancer(GC)and the role of MSI during gastric cancerogenesis.Methods Silver staining single strand conformation polymorphis-polymerize chain reaction(PCR-SSCP)was used to screen MSI markers at5loci in forˉmalin-fixed，paraffin-embeded tissues of GC(n=30)，dysplasia(n=30)，intestinal metaplasia(IM)(n=40)，and corresponding normal gastricmucosa.Results The abnormal shifting of the single-strand DNA was identified in7GC(23.3%)，9dysplasia(30%)and8IM(20%)samples respectively.Three tumors，2dysplasia and1IM displayed high-level MSI.Low-level MSIwas detected in13.3%of GC，23.3%of dysplasia and17.5%of IM respectively.GC with MSI was associated with distal location of the tumor(P=0.044).MSI was not detected in low-grade IMtisˉsues.Conclusion MSI may be of an early abnormal event during gastric carcinogenesis.It contributes probably to the acquisition of a transformed cell phenotype and to the development of gastric cancer.
Key words stomach neoplasm gastric dysplasia intestinal metaplasia microsatellite instability
胃癌的发生是一个多因素参与的多阶段过程，胃粘膜肠上皮化生和异型增生被认为是胃癌的癌前病变。自1993年在遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)中发现微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)现象以来，在多处恶性肿瘤包括胃癌中均检测到MSI的存在，提示其在胃癌的发生过程中可能具有重要意义 [1] 。对于胃癌癌前病变组织中MSI的情况，国内外报道均很少。我们采用PCR-SSCP技术，检测胃粘膜肠上皮化生和异型增生及胃癌三种组织中MSI的发生情况和特点，探讨了MSI在胃癌发生发展中的可能作用。
1 材料和方法
1.1 实验材料 (1)30例胃癌组织标本来自我院2001年1～10月因胃癌行手术切除者，40例胃粘膜肠上皮化生、30例异型增生组织来自我院内窥镜室胃镜活检标本。胃癌按1987年全国肿瘤会议PTNM分期标准分期，肠上皮化生及异型增生组织按WHO标准分轻、中、重度。挑选分别包括病变及正常组织标本的蜡块，连续以5μm厚度切片，用于DNA提取。所有被检测标本的病变均经病理医师确认无误。(2)主要试剂:①PCR引物、脱氧核苷酸(dNTPs)购自上海生工公司。②Taq酶购自大连宝生物公司。(3)主要仪器:采用美国PTC-200PCR仪和北京六一仪器厂的三恒电泳仪。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取 石蜡切片经二甲苯脱蜡、无水乙醇洗脱后烘干。加入95μl TE(Tris-EDTA，pH8.0)及5μl10mg/ml的蛋白酶K(终浓度500μg/ml)，37℃过夜，离心后97℃7min灭活蛋白酶K，取上清-20℃贮存备用。
1.2.2 PCR-SSCP PCR反应总体积25μl，含50～200ng DNA，反应条件:95℃5min，94℃30s，55～58℃30s，72℃15s，35个循环，72℃延伸1min。取PCR产物12μl加12μl变性缓冲液(980ml/L去离子甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.1g/L溴酚蓝，0.1g/L二甲苯青)97℃变性7min，迅速置于乙醇碎冰中，双链对照杯本用6μl PCR产物加2μl上样缓冲液(2.5g/L溴酚蓝-400g/L蔗糖)。采用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶(19:1)电泳，1×TBE缓冲液，室温下180V恒压电泳3.0h，银染制成干胶。MSI存在的判断标准:肿瘤组织与正常组织相比，出现异常条带或迁移。具阳性结果的标本重复操作一次以确定无误。
1.2.3 引物序列 参照相关文献报道的序列合成 [2，3] ，见表1。
表1 研究选用的引物序列
1.3 统计学方法 各组之间年龄的比较采用单因素方差分极及t检验;各组MSI发生率的比较采用Fisher’s精密检验，以P<0.05为差异有统计学显著性意义。
2 结果
2.1 胃癌组织中MSI的检出情况 本组患者均无胃癌家族史。30例胃癌中有7例表现1个或1个以上位点的不稳定性(图1)，MSI发生率为23.3%。其中3例表现为2个位点(≥30%～40%位点数)出现不稳定性，以MSI-H表示;4例仅在一个位点表现不稳定性，记作MSI-L;其余23例未检测到MSI的存在，以MSS表示。MSI + 胃癌与MSI - 胃癌在性别、年龄、细胞分化程度、淋巴结转移及TNM分期方面无统计学差异，但胃窦癌较贲门癌更易出现MSI + (P=0.044)。详见表2。
表2 胃癌组织MSI及其与临床病理的关系特点
注:胃窦癌与贲门癌MSI发生率比较， ˇ P=0.044
2.2 异型增生组织中MSI的检出情况 30例中检出9例出现MSI(图2)，阳性率30%，其中7例为MSI-L，2例为MSI-H。中度以上异型增生组织中MSI阳性率33.3%(6/18)，稍高于轻度异型增生为25%(3/12)。但两者之间的差异无统计学意义(见表3)。MSI + 与MSI - 的异型增生在性 别、年龄方面差异无显著性。
表3 异型增生组织中MSI检出情况
2.3 肠上皮化生组织中MSI的检出情况 40例肠上皮化生标本8例出现MSI，阳性率为20%，除1例MSI-H外，余7例均为MSI-L(图3)。其中男性MSI发生率2.5%(1/40)，女性MSI发生率17.5%(7/40)，性别差异有统计学意义，17例轻度肠化生均表现MSS，中度肠化生MSI阳性率达34.8%(8/23)，两组之间MSI发生率差异具有显著性(P=0.013)。见表4。
表4 肠化生组织的MSI特点
注:女性与男性MSI发生率比较，中度与轻度肠化生组比较， ˇ P<0.05
3 讨论
微卫星(Microsatellite，MS)是基因组DNA中1～6个核苷酸组成的具有高度多态性的简单串联重复序列，其重复可达10～50次。MS序列的多态性由等位基因间重复单位数目变化所引起，重复序列的产生是由于遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂或减数分裂期染色体的不对称交换所致。MSI是指由于DNA复制错误引起的简单重复序列的改变，表现为病变组织与其对应的正常组织相比，DNA结构性等位因基的大小发生改变。其发生原因可能与DNA错配修复基因存在缺陷有关。自1993年在遗传性非息肉病性结、直肠癌中发现MSI以来，MSI在包括胃癌的多种恶性肿瘤中检测到，以胃癌中MSI的发生率较高，个别报道达76.7% [4，5] 。由于不同研究所选择的微卫星位点种类及数量不同，因此所报道结果的可比性不强。随着位点检测数量的增加，MSI检出的机会也会增加。
我们采用美国国家癌症学会(NCI)推荐用于胃癌MSI检测的5个位点 [2] ，即2个单核苷酸、3个二核苷酸重复序列，检测出MSI的发生率为23.3%。与一些学者报道的结果略有差异 [4～7] ，这种差异的发生可能与所选位点的种类和数目、样本数量、MSI阳性的判断标准、遗传背景以及地理区域等不同有关 [8] 。本组资料发现在BAT-26位点发生MSI的阳性率最高，这与部分研究结果类似 [6] 。MSI + 胃癌与临床病理的关系目前尚未明确，Wu等 [9] 发现，MSI-H与MSI-L的胃癌具有不同的临床病理特征，MSI-H胃癌多发生在胃窦部，淋巴转移少，预后较好。而Writz等[10] 研究表明，MSI与性别、年龄、肿瘤浸润深度、细胞分化程度、淋巴结转移、Lauren分型以及预后无关，这一点与本组结果相似。由于本组资料病例数较少，所得到的结果尚需更多样本的研究加以证实。胃粘膜肠上皮化生和异型增生被认为是胃癌的癌前病变。部分胃癌的发生可能是癌前病变过程中一系列基因变异累积的结果 [1] ，从肠上皮化生到胃癌的发展过程中也发现了基因不稳定的证据 [4] 。本研究结果表明，肠化生组织MSI发生率为20%，与文献报道的结果 [1，4，12] (30%～44.5%)相比，本组MSI阳性率偏低。其原因可能与所取标本的肠化生程度偏轻以及采用微卫星位点的种类、数目不同有关。本研究异型增生组织中的MSI阳性率为30%，且与异型增生的程度无关，这与Lee [11] 报道的结果相似。
研究胃癌和癌前病变组织MSI的存在情况，可以从基因组不稳定的角度探讨胃癌可能的发生机制。MSI在胃癌癌前病变组织中均有相当比例的存在，提示在癌前病变阶段已出现基因不稳定的现象，这是胃癌发生前的异常分子事件，可能会成为胃癌多步骤发生过程中的起点。Kashiwaˉgi等 [13] 对6例MSI + 的高分化型胃癌或胃腺瘤标本回顾性研究，取其1～7年前的标本，结果发现该6例标本在慢性胃炎阶段MSI就已经存在。作者同时报告1例肠化生伴MSI的患者，经过3年随访，在与肠化生相同的部位发现高分化腺癌。这些结果均提示MSI的出现在胃癌发生过程中发挥了重要作用，可能是胃癌发生中的重要环节。因此，胃粘膜癌前病变组织MSI的检测和分析将有助于胃癌发病机制的探讨以及胃癌发生危险性的预测。(本文图片见封三)
参考文献
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作者单位:210029南京医科大学第一附属医院消化科
(收稿日期:2003-09-12)
(编辑使 臻)