他克莫司对重症急性胰腺炎血清TNF-α、IL-1β含量的影响
【摘要】 目的 探讨他克莫司(FK506)预处理对重症急性胰腺炎血清TNF-α、IL-1β含量的影响及意义。方法 牛磺胆碱酸钠胰胆管逆行注射法建立大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型。实验动物随机分为LPS组、LPS+FK组，分别测定0、3、6、9h两组血清TNF-α、IL-1β含量并观察肺湿重/干重(W/D)比值、肺组织病理学改变。结果 两组血清TNF-α、IL-1β含量均呈先升后降趋势，TNF-α于3h达峰值，IL-1β于6h达峰值，各时间LPS+FK组TNF-α、IL-1β含量均较LPS组低(P均<0.01)。各时间点LPS、LPS+FK组大鼠肺湿重/干重(W/D)比值均较0h相显著升高;LPS+FK组升高幅度低于LPS组(P均<0.01)。肺组织病理显示:LPS组大鼠肺实质及间质广泛性损害，肺间隔明显水肿、增厚，肺泡结构紊乱伴大量炎性渗出及PMN浸润;LPS+FK组肺组织损伤程度减轻。结论 他克莫司干预可减少重症急性胰腺炎时血清TNF-α、IL-1β含量，减轻由炎性介质引起的急性炎症损害。
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关键词 他克莫司 急性胰腺炎
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0865-02
Effect of tacrolimus on serum TNF-αand IL-1βlevels in sever
acute pancreatitis rats
Dou Chunqing，Zhao Qingchuan，Dou Kefeng，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Meditary
Medical University，Xi’an710033.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the effect of Tarcrolimus on serumTNF-αand IL-1βlevels in severe acute pancreatitis rats.Methods SAP model was induced by retrograde injection of sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct.Experimental aminals were randomly assigned to LPS and LPS+FK group.At0，3，6，9h，serum TNF-α、IL-1βand lung wet/dry ratio of the two groups were recorded.The pulmonary histopathological changes were examined simultaneously.Results Serum TNF-αand IL-1βlevels of the two groups both had a tendency of first increasing and then decreasing.3hours after LPS administration，serum TNF-αlevel reached its peak，while IL-1βdid it3hours later.TNF-αand IL-1βlevels of LPS+FK group were lower than that of LPS group at every time point.Lung wet/dry ratios of the two groups both increased，but which of LPS+FK group were lower than that of LPS group at each time point.Histopathologic analysis revealed that lung tissues of LPS group animals showed an inˉtravascular neutrophil agglomerate，perivascular/peribronchial damage，parenchyma edema and thickening of alveolar wall.The extent of tissue lesions were significantly reduced but not abrogated in LPS+FK group.Conclusion Tarˉcrolimus could decrease the serum levels of TNF-α、IL-1βand alleviate the lesion caused by severe acute pancreatiˉtis.
, 百拇医药
Key words tarcrolimus pancreatitis
临床实践发现，他克莫司可显著减轻器官移植器官的缺血———再灌注损伤。目前对缺血———再灌注损伤本质的认识是一非特异性炎症反应，单纯以他克莫司的免疫抑制机制并不能合理解释这一作用。近年的研究发现:红霉素、柔红霉素等大环内酯类药物可抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎性介质产生 [1，2] 。他克莫司是否也可通过减少炎症因子生成而发挥抗炎作用，国内外相关报道甚少。本实验通过观察他克莫司对重症急性胰腺炎所致急性肺损伤大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响，探讨其对于减轻炎性损害的意义。
1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠48只，雄性，体重200～230g，均由第四军医大学实验动物中心提供。他克莫司(Fujisawa公司)，生理盐水配制，终浓度0.025g/L;牛磺胆酸钠(Sigma公司)，生理盐水配制，终浓度50g/L;TNF-α、IL-1β放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)。
, 百拇医药
1.2 模型建立及动物分组 SAP大鼠模型建立采用牛磺胆酸钠(0.8ml/kg)胰胆管逆行注射法 [3] 。SD大鼠48只，随机平均分配到LPS和LPS+FK组。实验前2d始，LPS+FK组动物以他克莫司(20ml/kg)灌胃，每12h给予相同剂量维持;LPS组以生理盐水替代他克莫司作为对照。LPS、LPS+FK组小鼠分别于LPS注射后0、3、6、9h各杀活大鼠6只。
1.3 监测指标 (1)采用开腹门脉取血，玻璃管收集，室温下放置1h，待样本完全凝固后以2500r/min速度离心15min，吸取上清，放免法测定血清TNF-α、IL-1β含量。(2)取左肺，吸水纸迅速吸取表面水分和血液，电子天平称重;置于80℃烘箱内烘干48h至恒重，再次称重并计算肺组织湿重/干重比值(W/D);(3)取右肺同一部位，固定、包埋、切片，HE染色，光镜下观察肺病理组织学改变。
1.4 统计学处理 数据以X±s表示，组间比较采用双因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。
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2 结果
2.1 血清TNF-α、IL-1β含量变化 与0h相比较，各时间 点LPS、LPS+FK组大鼠TNF-α、IL-1β含量增加(P均<0.01);TNF-α、IL-1β的变化均呈先后降趋势，TNF-α先于IL-1β达峰值;相同时间LPS+FK组TNF-α、IL-1β升高幅度低于LPS组(P均<0.01)，见表1。
表1 LPS、LPS+FK组大鼠各时间血清TNF-α、IL-1β含量 (略)
2.2 肺W/D比值变化 与0h相比较，各时间点LPS、LPS+FK组大鼠肺W/D比值升高(P均<0.01);相同时间LPS+FK组肺W/D升高幅度低于LPS组(P均<0.01)，见表2。
表2 LPS、LPS+FK组大鼠各时间肺W/D比值 略
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2.3 肺组织病理学变化 6h、9h相，大体标本可见:LPS组大鼠肺斑片状坏死，整个肺充血;LPS+FK组肺表面充血明显减轻，未发现斑片状坏死。光镜下观察:LPS组肺间质水肿，弥漫性出血，肺泡结构紊乱，可见大量红细胞渗出和中性粒细胞浸润，肺泡隔增厚;LPS+FK组肺组织各种渗出减少，中性粒细胞浸润也显著减轻(见图1)。
3 讨论
他克莫司是目前广泛应用于移植领域的一类免疫抑制剂，分子结构属大环内酯类。大量的临床实践证实，他克莫司可明显降低由于缺血—再灌注损伤而导致的移植术后早期IPF、PNF及DNF的发生 [4] ，而缺血—再灌注损伤的本质是一非特异性炎症反应 [5，6] 。提示免疫抑制剂他克莫司可能具有抗炎特性。文献回顾发现，大环内酯类药物红霉素、罗红霉素可抑制炎性介质的生成。同属于大环内酯类的他克莫司是否也可以通过减少致炎因子而发挥抗炎作用，国内外相关报道甚少。本实验据此作为研究的出发点。重症急性胰腺炎均可引起多器官的损害，其实质是炎症的级联放大过程，包括炎性介质的大量释放及炎症细胞的广泛浸润，可作为抗炎研究的理想模型。本实验两组动物血清TNF-α、IL-1β含量的比较结果提示他克莫司可能减轻急性肺损伤的程度，肺W/D比值及病理改变的显著差异使这一推论得到进一步论证。炎症反应主要由炎性介质和炎发症细胞所介导。TNF-α和IL-1β是两类目前研究较深入的致炎因子，在炎症的发生、发展过程中发挥关键作用。TNF-α是始动因素，IL-1β则起到协同作用 [7，8] 。本实验中血清TNF-α与IL-1β含量于LPS注射后急速增加，且 TNF-α先于IL-1β达到峰值，这都与两者在炎症反应过程中的作用相一致。TNF-α可诱导NO、内皮素、氧自由基、多肽递质、脂质递质和粘附分子等的产生。IL-1β可激活血管内皮细胞，增强血管通透性，增加炎性介质的释放;诱生或上调血管内皮细胞表面粘附分子，吸引PMN聚集。TNF-α、IL-1β含量的减少，无疑会大大降低炎性损害的严重性，这与其他大环内酯类药物，如红霉素、罗红霉素的作用相一致。
, 百拇医药
本研究证实:他克莫司可通过降低血清TNF-α、IL-1β含量，下调炎症反应，减轻重症急性胰腺炎时由炎症因子所介导的炎性损伤。
(本文图片略)
参考文献
1 Schultz MJ，Speelman P，Zaat S，et al.Erythromycin inhibits tumor necrosis factor alpha and interleukin6production induced by heat-killed Streptococcus pneumoniae in whole blood.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(7):1605-1609.
2 Takizawa H，Desaki M，Ohtoshi T，et al.Erythromycin suppresses interˉleukin6expression by human bronchial epithelial cells:apotential mechanism of its anti-inflammatory action.Biochem Biophys Res Comˉmun，1995，210(3):781-786.
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3 许春芳.牛磺胆酸钠诱导大鼠急性胰腺炎系列模型的研究.新消化病杂志，1995，3(3):139-141.
4 Garcia-Criado FJ.Tarcrolimus(FK506)down-regulates free radical tissue levels，serum cytokines and neutrophil infiltration after severe livˉer ischemia.Transplantation，1997，64(4):594-598.
5 Carini R，Albano E.Recent insights on the mechanisms of liver preconˉditioning Gastroenterology.Gastroenterology，2003，125(5):1480-1491.
6 Selzner N，Rudiger H，Graf R，et al.Protective strategies against isˉchemic injury of the liver.Gastroenterology，2003，125(3):917-936.
, http://www.100md.com
7 Xie GQ，Jiang JX，Chen YH，et al.Induction of acute hepatic injury by endotoxin in mice.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2002，1(4):558-564.
8 Kim GY，Roh SI，Park SK，et al.Alleviation of experimental septic shock inmice by acidic polysaccharide isolated from the medicinal mushroom Phellinus linteus.Biol Pharm Bull，2003，26(10):1418-1423.
作者单位:710033西安第四军医大学西京医院肝胆外科
(收稿日期:2004-02-07)
(编辑 一坤), 百拇医药
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关键词 他克莫司 急性胰腺炎
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0865-02
Effect of tacrolimus on serum TNF-αand IL-1βlevels in sever
acute pancreatitis rats
Dou Chunqing，Zhao Qingchuan，Dou Kefeng，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Meditary
Medical University，Xi’an710033.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the effect of Tarcrolimus on serumTNF-αand IL-1βlevels in severe acute pancreatitis rats.Methods SAP model was induced by retrograde injection of sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct.Experimental aminals were randomly assigned to LPS and LPS+FK group.At0，3，6，9h，serum TNF-α、IL-1βand lung wet/dry ratio of the two groups were recorded.The pulmonary histopathological changes were examined simultaneously.Results Serum TNF-αand IL-1βlevels of the two groups both had a tendency of first increasing and then decreasing.3hours after LPS administration，serum TNF-αlevel reached its peak，while IL-1βdid it3hours later.TNF-αand IL-1βlevels of LPS+FK group were lower than that of LPS group at every time point.Lung wet/dry ratios of the two groups both increased，but which of LPS+FK group were lower than that of LPS group at each time point.Histopathologic analysis revealed that lung tissues of LPS group animals showed an inˉtravascular neutrophil agglomerate，perivascular/peribronchial damage，parenchyma edema and thickening of alveolar wall.The extent of tissue lesions were significantly reduced but not abrogated in LPS+FK group.Conclusion Tarˉcrolimus could decrease the serum levels of TNF-α、IL-1βand alleviate the lesion caused by severe acute pancreatiˉtis.
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Key words tarcrolimus pancreatitis
临床实践发现，他克莫司可显著减轻器官移植器官的缺血———再灌注损伤。目前对缺血———再灌注损伤本质的认识是一非特异性炎症反应，单纯以他克莫司的免疫抑制机制并不能合理解释这一作用。近年的研究发现:红霉素、柔红霉素等大环内酯类药物可抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎性介质产生 [1，2] 。他克莫司是否也可通过减少炎症因子生成而发挥抗炎作用，国内外相关报道甚少。本实验通过观察他克莫司对重症急性胰腺炎所致急性肺损伤大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响，探讨其对于减轻炎性损害的意义。
1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠48只，雄性，体重200～230g，均由第四军医大学实验动物中心提供。他克莫司(Fujisawa公司)，生理盐水配制，终浓度0.025g/L;牛磺胆酸钠(Sigma公司)，生理盐水配制，终浓度50g/L;TNF-α、IL-1β放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)。
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1.2 模型建立及动物分组 SAP大鼠模型建立采用牛磺胆酸钠(0.8ml/kg)胰胆管逆行注射法 [3] 。SD大鼠48只，随机平均分配到LPS和LPS+FK组。实验前2d始，LPS+FK组动物以他克莫司(20ml/kg)灌胃，每12h给予相同剂量维持;LPS组以生理盐水替代他克莫司作为对照。LPS、LPS+FK组小鼠分别于LPS注射后0、3、6、9h各杀活大鼠6只。
1.3 监测指标 (1)采用开腹门脉取血，玻璃管收集，室温下放置1h，待样本完全凝固后以2500r/min速度离心15min，吸取上清，放免法测定血清TNF-α、IL-1β含量。(2)取左肺，吸水纸迅速吸取表面水分和血液，电子天平称重;置于80℃烘箱内烘干48h至恒重，再次称重并计算肺组织湿重/干重比值(W/D);(3)取右肺同一部位，固定、包埋、切片，HE染色，光镜下观察肺病理组织学改变。
1.4 统计学处理 数据以X±s表示，组间比较采用双因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。
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2 结果
2.1 血清TNF-α、IL-1β含量变化 与0h相比较，各时间 点LPS、LPS+FK组大鼠TNF-α、IL-1β含量增加(P均<0.01);TNF-α、IL-1β的变化均呈先后降趋势，TNF-α先于IL-1β达峰值;相同时间LPS+FK组TNF-α、IL-1β升高幅度低于LPS组(P均<0.01)，见表1。
表1 LPS、LPS+FK组大鼠各时间血清TNF-α、IL-1β含量 (略)
2.2 肺W/D比值变化 与0h相比较，各时间点LPS、LPS+FK组大鼠肺W/D比值升高(P均<0.01);相同时间LPS+FK组肺W/D升高幅度低于LPS组(P均<0.01)，见表2。
表2 LPS、LPS+FK组大鼠各时间肺W/D比值 略
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2.3 肺组织病理学变化 6h、9h相，大体标本可见:LPS组大鼠肺斑片状坏死，整个肺充血;LPS+FK组肺表面充血明显减轻，未发现斑片状坏死。光镜下观察:LPS组肺间质水肿，弥漫性出血，肺泡结构紊乱，可见大量红细胞渗出和中性粒细胞浸润，肺泡隔增厚;LPS+FK组肺组织各种渗出减少，中性粒细胞浸润也显著减轻(见图1)。
3 讨论
他克莫司是目前广泛应用于移植领域的一类免疫抑制剂，分子结构属大环内酯类。大量的临床实践证实，他克莫司可明显降低由于缺血—再灌注损伤而导致的移植术后早期IPF、PNF及DNF的发生 [4] ，而缺血—再灌注损伤的本质是一非特异性炎症反应 [5，6] 。提示免疫抑制剂他克莫司可能具有抗炎特性。文献回顾发现，大环内酯类药物红霉素、罗红霉素可抑制炎性介质的生成。同属于大环内酯类的他克莫司是否也可以通过减少致炎因子而发挥抗炎作用，国内外相关报道甚少。本实验据此作为研究的出发点。重症急性胰腺炎均可引起多器官的损害，其实质是炎症的级联放大过程，包括炎性介质的大量释放及炎症细胞的广泛浸润，可作为抗炎研究的理想模型。本实验两组动物血清TNF-α、IL-1β含量的比较结果提示他克莫司可能减轻急性肺损伤的程度，肺W/D比值及病理改变的显著差异使这一推论得到进一步论证。炎症反应主要由炎性介质和炎发症细胞所介导。TNF-α和IL-1β是两类目前研究较深入的致炎因子，在炎症的发生、发展过程中发挥关键作用。TNF-α是始动因素，IL-1β则起到协同作用 [7，8] 。本实验中血清TNF-α与IL-1β含量于LPS注射后急速增加，且 TNF-α先于IL-1β达到峰值，这都与两者在炎症反应过程中的作用相一致。TNF-α可诱导NO、内皮素、氧自由基、多肽递质、脂质递质和粘附分子等的产生。IL-1β可激活血管内皮细胞，增强血管通透性，增加炎性介质的释放;诱生或上调血管内皮细胞表面粘附分子，吸引PMN聚集。TNF-α、IL-1β含量的减少，无疑会大大降低炎性损害的严重性，这与其他大环内酯类药物，如红霉素、罗红霉素的作用相一致。
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本研究证实:他克莫司可通过降低血清TNF-α、IL-1β含量，下调炎症反应，减轻重症急性胰腺炎时由炎症因子所介导的炎性损伤。
(本文图片略)
参考文献
1 Schultz MJ，Speelman P，Zaat S，et al.Erythromycin inhibits tumor necrosis factor alpha and interleukin6production induced by heat-killed Streptococcus pneumoniae in whole blood.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(7):1605-1609.
2 Takizawa H，Desaki M，Ohtoshi T，et al.Erythromycin suppresses interˉleukin6expression by human bronchial epithelial cells:apotential mechanism of its anti-inflammatory action.Biochem Biophys Res Comˉmun，1995，210(3):781-786.
, http://www.100md.com
3 许春芳.牛磺胆酸钠诱导大鼠急性胰腺炎系列模型的研究.新消化病杂志，1995，3(3):139-141.
4 Garcia-Criado FJ.Tarcrolimus(FK506)down-regulates free radical tissue levels，serum cytokines and neutrophil infiltration after severe livˉer ischemia.Transplantation，1997，64(4):594-598.
5 Carini R，Albano E.Recent insights on the mechanisms of liver preconˉditioning Gastroenterology.Gastroenterology，2003，125(5):1480-1491.
6 Selzner N，Rudiger H，Graf R，et al.Protective strategies against isˉchemic injury of the liver.Gastroenterology，2003，125(3):917-936.
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7 Xie GQ，Jiang JX，Chen YH，et al.Induction of acute hepatic injury by endotoxin in mice.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2002，1(4):558-564.
8 Kim GY，Roh SI，Park SK，et al.Alleviation of experimental septic shock inmice by acidic polysaccharide isolated from the medicinal mushroom Phellinus linteus.Biol Pharm Bull，2003，26(10):1418-1423.
作者单位:710033西安第四军医大学西京医院肝胆外科
(收稿日期:2004-02-07)
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