胃癌患者外周血肿瘤细胞的检测及其临床意义
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)06-0509-03
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤。术后常出现肿瘤的复发和转移。复发和转移除与肿瘤本身的大小、分期、组织学类型及治疗方法有关外，有人设想这些患者可能在术前其外周血、骨髓或淋巴结就存在少量的肿瘤细胞 [1] 或者手术期间由于手术操作挤压出现肿瘤细胞的播散。由此提出了许多不同新名词 [2] ，例如:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)，潜伏肿瘤细胞(occult tumor cell)，微小残存灶(minimalresidual diseas)，播散肿瘤细胞(disseminated tumor cell)，尽管 命名不同，这些名词大都指用常规的临床诊断手段如CT、MRI、普通病理检查都很难发现，而用免疫学方法、分子生物学方法才能发现的少量肿瘤细胞。这些肿瘤细胞既可以是疾病早期或治疗前就存在的，也可以是疾病晚期出现或治疗后残存。广义的循环肿瘤细胞指恶性肿瘤在发展的过程中播散并存活于外周血、骨髓、淋巴管以及各组织器官中的肿瘤细胞，这些细胞尚未形成转移结节，当结节直径≤2mm时称微转移 [3] ，所以是指侵袭过程中的不同阶段 [4] 。本文对胃癌患者外周血肿瘤细胞的检测及其临床意义作一综述。
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1 胃癌患者外周血中肿瘤细胞的检测方法
1.1 免疫学方法 检测的基本原理是抗原抗体结合反应，利用单克隆抗体与肿瘤标志物相关蛋白或相关抗原结合，并通过显色剂显色或其他显色方法来判断肿瘤细胞的存在，其敏感性为10-5-10-6。主要检测的肿瘤标志物分4类:(1)上皮细胞角蛋白:如CK19，CK20。(2)上皮细胞膜特异性抗原:如粘蛋白EMA。(3)肿瘤相关糖蛋白:如CA72-4，CA19-9。(4)癌胚抗原类:如血清CEA抗原。由于免疫学方法敏感性及特异性较低，故有被RT-PCR法取代趋势。免疫学方法引起假阳性的因素:(1)良性疾病:炎症性疾病一些肿瘤标志物表达增加。肝脏良性疾病时AFP、CA19-9、CEA及肾功能衰竭时CA15-3、CA19-9、CEA水平均会升高。(2)生理变化:妊娠和月经时CA125也会升高。(3)肿瘤手术、放疗、化疗过程中:由于肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时某些肿瘤标志物产生增加，从而影响肿瘤标志物的测定，造成假阳性。(4)样本中非肿瘤标志物的表达。引起假阴性的因素:(1)产生肿瘤标志物的肿瘤细胞数目少。(2)细胞或细胞表面被封闭。(3)机体体液中一些抗体与肿瘤标志物(肿瘤抗原)形成免疫复合物。
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1.2 分子生物学方法 基本原理是通过引物扩增并检测特异性mRNA表达，其敏感性可达10-6-10-7。肿瘤细胞标志物包括 [5] :(1)某些基因改变，如点突变p53，Ras缺失BRAC，异构(CD44)，扩增erbB-2。(2)组织特异性mRˉNA，如CK20mRNA。(3)肿瘤特异性标志mRNA如CEAmRˉNA。(4)转移特异性基因，如CD44mRNA，MMP基因。由于方法过度敏感，有时也出现假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、正常组织或造血细胞中某些基因表达及假基因扩增等。解决方法是在实验中设立的阴性对照，如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。选择合适的标志物，正确设计引物，工作区隔离，在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。假阴性:实验技术或条件不当不能扩增出目的基因，肿瘤分化差异导致的某些基因的低表达或不表达，RNA降解等。解决方法是在实验中设置的阳性对照，如未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。做预试验摸出实验条件等。另外设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能不准确。
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2 外周血中检测到循环肿瘤细胞的意义
检测外周血中肿瘤细胞的依据是:由于血浆中富有大量的RNA酶，一旦血浆中出现RNA即会被降解，故血浆中不会有游离的mRNA，因此通过RT-PCR技术检测到的mRNA显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素。获取肿瘤细胞的方法:(1)静脉取血去除红细胞，收集有核细胞。(2)用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞，癌细胞与单核细胞在同一密度层。(3)采用免疫磁株标记抗体与肿瘤细胞表面标志物结合，通过磁柱富集肿瘤细胞 [6] 。1993年国际抗癌联盟(UICC)出版的肿瘤分期补充材料中指出 [3] :在淋巴和血液中(包括骨髓穿刺液)中发现的单个肿瘤细胞或少量瘤细胞群并不是微转移，只是个别或少量游离肿瘤细胞 的播散(dissemination)。建议对这种情况在TNM分期中可写作N(i)或M(i)(i是isolated tumor cell之意)。这些肿瘤细胞要成为真正的转移灶还必须经历瘤细胞先被扣留在血管内(intravasation)，再穿过血管壁(extravasation)并在血管外增殖称作种植(implantation)的过程。该过程中同时伴随基质反应和新生血管形成，当增殖，生长到1～2mm时才能称作微转移。国内邬宇飞等用CK19mRNA为指标检测60例胃癌患者外周血，发现其微转移阳性率为30% [7] ，而胃癌患者术中门静脉血阳性率为60% [8] ，虽然阳性率较高，但这种方法只能在术中采样。且肿瘤分期越晚，阳性率越高，III+IV期胃癌的阳性率显著高于I+II期胃癌 [7，9] ，检测外周血微转移有助于提高胃癌临床分期的准确性，并帮助判断患者预后和提高综合治疗效果 [10] 。国内江苏南京医科大学第一附属医院章希炜等 [11] 研究胃癌、大肠癌患者外周血CK20mRNA的表达，外周血重复采样阳性率高于单次采样(P<0.05)，重复采样阳性率接近于单次门静脉血采样阳性率(P>0.05)。Duke C期患者CK20mRNA阳性表达率高于Duke A、B期(P<0.05)。1年局部或远处复发率CK20mRNA外周血阳性表达患者高于阴性者(P<0.05)。山东卢俊等 [12] 以癌胚抗原(CEA)及角化蛋白20(CK20)为标志物，应用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested，RT-PCR)检测50例胃癌患者术前、后外周静脉血微转移，结果显示术后外周血阳性率比术前高，CEAmRNA阳性率比CK20mRNA高，统计学分析差别有显著性，说明胃癌患者术前外周静脉血就已存在肿瘤细胞，手术操作过程对癌细胞入血有直接影响，CEAmRNA有更好的表达率，阳性率更高。外周血CEAmRNA和CK20mRNA阳性表达率与胃癌的侵袭性特征有一定的相关性，建议两者的联合检测对估计胃癌侵袭深度，淋巴结转移状况，以及预后有较重要的临床意义。日本学者Miyazono F研究52例胃癌患者术前、术后外周血表达，发现术后阳性率增加，推测可能与手术有关，并且术后阳性病人其骨转移的可能性增加 [13] 。英国学者Wharton和Jonas也认为联合检测CEAmRNA，CK20mRNA可提高微转移的阳性率 [14]。江苏周广军等 [15] 以CK20mRNA为指标研究30例胃癌患者外周血，结果显示CK20mRNA阳性表达率与病理分化程度无关，胃癌伴肝转移者外周血CK20mRNA阳性表达明显高于无肝转移者 [16] ，晚期胃癌患者阳性表达率高，提示预后差，胃癌患者术后48h外周血CK20mRNA阳性率高于术前，说明手术操作使肿瘤细胞进入外周血，建议重视手术时癌细胞的播散问题，手术过程中严格执行“不接触肿瘤的游离技术”，以最大限度的减少医源性癌细胞播散的可能。Peck的定量RT-PCR实验结果显示，抗肿瘤治疗效果的好坏与肿瘤患者外周血CK19mRNA表达量的多少有良好的一致性 [17] 。当然也有相反意见，英国学者Wyld[18] 在试验中发现.正常血标本中有CK20mRNA表达，从而怀疑它的特异性。德国学者Jung发现.正常粒细胞中也可以有CK20mRNA表达 [19] 。日本学者Majima认为许多实验用同一种标志物却得出不同的阳性率，可能的原因为肿瘤细胞间歇入血，不同的时间点采血所得结果不同[20] ，所用的方法无统一标准。也可能由于肿瘤标志物在不同肿瘤细胞中表达差异或低表达
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引起 [21] 。
3 讨论
综上所述RT-PCR方法是目前最成熟，最敏感的方法，有广阔的发展前景，但也有不足之处就是可能出现假阳性及假阴性。下一步的工作就是要找到一种方法进一步提高敏感性，寻找高特异性的肿瘤标志物，检测到循环肿瘤细胞，它是否能够存活，生长以及与病人的预后关系还需要大量样本进一步研究并进行随访。动物实验表明 [22] 仅0.01%的循环肿瘤细胞能达到下一器官并发展成显性转移，而大部分肿瘤细胞则被机体的免疫系统所杀灭，因此能否发展成临床意义的肿瘤团块存在争议。要通过体外培养分离得到的肿瘤细胞，通过体内体外实验分析其侵袭潜能，测试其对不同药物的敏感性，期望用基因治疗、化疗、手术等多种方法来达到治愈肿瘤的目的。
参考文献
1 Zippelius A，Pantel K，et al.RT-PCR-based detection of occult disˉseminated tumor cells in peripheral blood and bone marrow of patients with solid tumors.Ann N Y Acad Sci，2000，906:110-123.
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2 Ghossein RA，Rosai J，et al.Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells.Cancer，1996，78(1):10-16.
3 Hermanek P.Disseminated tumor cells versus micrometastasis:definiˉtions and problems.Anticancer Res，1999，19(4A):2771-2774.
4 Hermanek P，Hutter RV，Sobin LH，et al.Classification of isolated tumor cells and micrometastasis.Cancer，1999，86:2668.
5 Raj GV，Moreno JG，Gomella LG，et al.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.Cancer，1998，82:1419-1442.
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6 Martin VM，Siewert C，Scharl A，et al.Immunomagnetic enrichment of disseminated epithelial tumor cells from peripheral blood by MACS.Exp Hematol，1998，26:252.
7 邬宇飞，夏加增，李辉，等.胃肠道癌患者外周血和骨髓中微转移检测的意义.中国肿瘤临床，2002，29(7):489-491.
8 赵增顺，王少文，焦喜林，等.胃癌根治术对单细胞入血转移的影响.世界化人消化杂志，1998，6(7):610-612.
9 方刚，藏净，刘复坤，等.法检测胃癌组织基因的表达及临床意义.中国肿瘤临床，1997，24(3):169-171.
10 Allgayer H，Heiss MM，Schildberg FW.Prognostic factors in gastric cancer.Br J Surg，1997，84(12):1651-1664.
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11 章希炜，范萍，杨宏宇，等.胃肠恶性肿瘤外周血微转移的检测及其临床意义.中华肿瘤杂志，2003，25(1):66-68.
12 卢俊，吴亚光，穆庆岭，等.胃癌手术前后外周静脉血微转移的研究.山东医药，2002，42(24):1-3.
13 Miyazono F，Natsugoe S，Takao S，et al.Surgical maneuvers enhance molecular detection of circulating tumor cells during gastric cancer surgery.Ann Surg，2001，233(2):189-194.
14 Wharton RQ，Jonas SK，Glover C，et al.Increased detection of circuˉlating tumor cells in the blood of colorectal carcinoma patients using two reverse transcription-PCR assays and multiple blood samples.Clin Cancer Res，1999，5(12):4158-4163.
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15 周广军，沈洪薰，王志伟，等.CK20mRNA在胃癌患者外周血中的表达及其临床意义.南通医学院学报，2001，21(1):9-11.
16 Chausovsky G，Luchansky M，Figer A，et al.Expression of cytokeratin20in the blood of patients with disseminated carcinoma ofthe panˉcrease，colon，stomach and lung.Cancer，1999，86(11):2398.
17 Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of circulatˉing cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patients.Cancer Res，1998，58:2761-2765.
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18 Wyld DK，Selby P，Perren TJ，et al.Detection of colorectal cancer cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin20.Int J Cancer，1998，79(3):288-293.
19 Jung R，Petersen K，Kruger W，et al.Detection of micrometastasis by cytok
eratin20RT-PCR is limited due to stable background transcripˉtion in granulocytes.Br J Cancer，1999，81(5):870-873.
20 Majima T，Ichikura T，Mochizuki H.Clinical significance of detecting circulating cancer cells in patients with solid malignancies.GanTo Kaˉgaku Ryoho，2001，28(6):769-775.
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21 Zippelius A，Pantel K.RT-PCR-based detection of occult dissemiˉnated tumor cells in peripheral blood and bone marrow of patients with solid tumors.Ann NY Acad Sci，2000，906:110-123.
22 Noguchi S，Hiratsuka M，Furukawa H，et al.Detection of gastric cancer micrometastases in lymph nodes by amplification of Keratin19mRNA with reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Jpn Jcancer Res，1996，87(6):650-654.
作者单位:830000新疆医科大学第一附属医院外六科
(收稿日期:2004-01-12)
(编辑 依依), 百拇医药
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤。术后常出现肿瘤的复发和转移。复发和转移除与肿瘤本身的大小、分期、组织学类型及治疗方法有关外，有人设想这些患者可能在术前其外周血、骨髓或淋巴结就存在少量的肿瘤细胞 [1] 或者手术期间由于手术操作挤压出现肿瘤细胞的播散。由此提出了许多不同新名词 [2] ，例如:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)，潜伏肿瘤细胞(occult tumor cell)，微小残存灶(minimalresidual diseas)，播散肿瘤细胞(disseminated tumor cell)，尽管 命名不同，这些名词大都指用常规的临床诊断手段如CT、MRI、普通病理检查都很难发现，而用免疫学方法、分子生物学方法才能发现的少量肿瘤细胞。这些肿瘤细胞既可以是疾病早期或治疗前就存在的，也可以是疾病晚期出现或治疗后残存。广义的循环肿瘤细胞指恶性肿瘤在发展的过程中播散并存活于外周血、骨髓、淋巴管以及各组织器官中的肿瘤细胞，这些细胞尚未形成转移结节，当结节直径≤2mm时称微转移 [3] ，所以是指侵袭过程中的不同阶段 [4] 。本文对胃癌患者外周血肿瘤细胞的检测及其临床意义作一综述。
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1 胃癌患者外周血中肿瘤细胞的检测方法
1.1 免疫学方法 检测的基本原理是抗原抗体结合反应，利用单克隆抗体与肿瘤标志物相关蛋白或相关抗原结合，并通过显色剂显色或其他显色方法来判断肿瘤细胞的存在，其敏感性为10-5-10-6。主要检测的肿瘤标志物分4类:(1)上皮细胞角蛋白:如CK19，CK20。(2)上皮细胞膜特异性抗原:如粘蛋白EMA。(3)肿瘤相关糖蛋白:如CA72-4，CA19-9。(4)癌胚抗原类:如血清CEA抗原。由于免疫学方法敏感性及特异性较低，故有被RT-PCR法取代趋势。免疫学方法引起假阳性的因素:(1)良性疾病:炎症性疾病一些肿瘤标志物表达增加。肝脏良性疾病时AFP、CA19-9、CEA及肾功能衰竭时CA15-3、CA19-9、CEA水平均会升高。(2)生理变化:妊娠和月经时CA125也会升高。(3)肿瘤手术、放疗、化疗过程中:由于肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时某些肿瘤标志物产生增加，从而影响肿瘤标志物的测定，造成假阳性。(4)样本中非肿瘤标志物的表达。引起假阴性的因素:(1)产生肿瘤标志物的肿瘤细胞数目少。(2)细胞或细胞表面被封闭。(3)机体体液中一些抗体与肿瘤标志物(肿瘤抗原)形成免疫复合物。
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1.2 分子生物学方法 基本原理是通过引物扩增并检测特异性mRNA表达，其敏感性可达10-6-10-7。肿瘤细胞标志物包括 [5] :(1)某些基因改变，如点突变p53，Ras缺失BRAC，异构(CD44)，扩增erbB-2。(2)组织特异性mRˉNA，如CK20mRNA。(3)肿瘤特异性标志mRNA如CEAmRˉNA。(4)转移特异性基因，如CD44mRNA，MMP基因。由于方法过度敏感，有时也出现假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、正常组织或造血细胞中某些基因表达及假基因扩增等。解决方法是在实验中设立的阴性对照，如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。选择合适的标志物，正确设计引物，工作区隔离，在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。假阴性:实验技术或条件不当不能扩增出目的基因，肿瘤分化差异导致的某些基因的低表达或不表达，RNA降解等。解决方法是在实验中设置的阳性对照，如未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。做预试验摸出实验条件等。另外设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能不准确。
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2 外周血中检测到循环肿瘤细胞的意义
检测外周血中肿瘤细胞的依据是:由于血浆中富有大量的RNA酶，一旦血浆中出现RNA即会被降解，故血浆中不会有游离的mRNA，因此通过RT-PCR技术检测到的mRNA显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素。获取肿瘤细胞的方法:(1)静脉取血去除红细胞，收集有核细胞。(2)用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞，癌细胞与单核细胞在同一密度层。(3)采用免疫磁株标记抗体与肿瘤细胞表面标志物结合，通过磁柱富集肿瘤细胞 [6] 。1993年国际抗癌联盟(UICC)出版的肿瘤分期补充材料中指出 [3] :在淋巴和血液中(包括骨髓穿刺液)中发现的单个肿瘤细胞或少量瘤细胞群并不是微转移，只是个别或少量游离肿瘤细胞 的播散(dissemination)。建议对这种情况在TNM分期中可写作N(i)或M(i)(i是isolated tumor cell之意)。这些肿瘤细胞要成为真正的转移灶还必须经历瘤细胞先被扣留在血管内(intravasation)，再穿过血管壁(extravasation)并在血管外增殖称作种植(implantation)的过程。该过程中同时伴随基质反应和新生血管形成，当增殖，生长到1～2mm时才能称作微转移。国内邬宇飞等用CK19mRNA为指标检测60例胃癌患者外周血，发现其微转移阳性率为30% [7] ，而胃癌患者术中门静脉血阳性率为60% [8] ，虽然阳性率较高，但这种方法只能在术中采样。且肿瘤分期越晚，阳性率越高，III+IV期胃癌的阳性率显著高于I+II期胃癌 [7，9] ，检测外周血微转移有助于提高胃癌临床分期的准确性，并帮助判断患者预后和提高综合治疗效果 [10] 。国内江苏南京医科大学第一附属医院章希炜等 [11] 研究胃癌、大肠癌患者外周血CK20mRNA的表达，外周血重复采样阳性率高于单次采样(P<0.05)，重复采样阳性率接近于单次门静脉血采样阳性率(P>0.05)。Duke C期患者CK20mRNA阳性表达率高于Duke A、B期(P<0.05)。1年局部或远处复发率CK20mRNA外周血阳性表达患者高于阴性者(P<0.05)。山东卢俊等 [12] 以癌胚抗原(CEA)及角化蛋白20(CK20)为标志物，应用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested，RT-PCR)检测50例胃癌患者术前、后外周静脉血微转移，结果显示术后外周血阳性率比术前高，CEAmRNA阳性率比CK20mRNA高，统计学分析差别有显著性，说明胃癌患者术前外周静脉血就已存在肿瘤细胞，手术操作过程对癌细胞入血有直接影响，CEAmRNA有更好的表达率，阳性率更高。外周血CEAmRNA和CK20mRNA阳性表达率与胃癌的侵袭性特征有一定的相关性，建议两者的联合检测对估计胃癌侵袭深度，淋巴结转移状况，以及预后有较重要的临床意义。日本学者Miyazono F研究52例胃癌患者术前、术后外周血表达，发现术后阳性率增加，推测可能与手术有关，并且术后阳性病人其骨转移的可能性增加 [13] 。英国学者Wharton和Jonas也认为联合检测CEAmRNA，CK20mRNA可提高微转移的阳性率 [14]。江苏周广军等 [15] 以CK20mRNA为指标研究30例胃癌患者外周血，结果显示CK20mRNA阳性表达率与病理分化程度无关，胃癌伴肝转移者外周血CK20mRNA阳性表达明显高于无肝转移者 [16] ，晚期胃癌患者阳性表达率高，提示预后差，胃癌患者术后48h外周血CK20mRNA阳性率高于术前，说明手术操作使肿瘤细胞进入外周血，建议重视手术时癌细胞的播散问题，手术过程中严格执行“不接触肿瘤的游离技术”，以最大限度的减少医源性癌细胞播散的可能。Peck的定量RT-PCR实验结果显示，抗肿瘤治疗效果的好坏与肿瘤患者外周血CK19mRNA表达量的多少有良好的一致性 [17] 。当然也有相反意见，英国学者Wyld[18] 在试验中发现.正常血标本中有CK20mRNA表达，从而怀疑它的特异性。德国学者Jung发现.正常粒细胞中也可以有CK20mRNA表达 [19] 。日本学者Majima认为许多实验用同一种标志物却得出不同的阳性率，可能的原因为肿瘤细胞间歇入血，不同的时间点采血所得结果不同[20] ，所用的方法无统一标准。也可能由于肿瘤标志物在不同肿瘤细胞中表达差异或低表达
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引起 [21] 。
3 讨论
综上所述RT-PCR方法是目前最成熟，最敏感的方法，有广阔的发展前景，但也有不足之处就是可能出现假阳性及假阴性。下一步的工作就是要找到一种方法进一步提高敏感性，寻找高特异性的肿瘤标志物，检测到循环肿瘤细胞，它是否能够存活，生长以及与病人的预后关系还需要大量样本进一步研究并进行随访。动物实验表明 [22] 仅0.01%的循环肿瘤细胞能达到下一器官并发展成显性转移，而大部分肿瘤细胞则被机体的免疫系统所杀灭，因此能否发展成临床意义的肿瘤团块存在争议。要通过体外培养分离得到的肿瘤细胞，通过体内体外实验分析其侵袭潜能，测试其对不同药物的敏感性，期望用基因治疗、化疗、手术等多种方法来达到治愈肿瘤的目的。
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19 Jung R，Petersen K，Kruger W，et al.Detection of micrometastasis by cytok
eratin20RT-PCR is limited due to stable background transcripˉtion in granulocytes.Br J Cancer，1999，81(5):870-873.
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22 Noguchi S，Hiratsuka M，Furukawa H，et al.Detection of gastric cancer micrometastases in lymph nodes by amplification of Keratin19mRNA with reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Jpn Jcancer Res，1996，87(6):650-654.
作者单位:830000新疆医科大学第一附属医院外六科
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(编辑 依依), 百拇医药