促血管生成素在原位种植肝癌组织中的表达及其意义
【摘要】 目的 研究促血管生成素基因在大鼠原位种植肝癌模型中的表达及其与肝癌新生血管之间的关系。方法 采用Walker256癌肉瘤接种40只Wistar大鼠制作原位种植肝癌模型，用微血管计数以标志肿瘤新生血管。采用原位杂交法检测促血管生成素基因的表达。结果 Walker256癌肉瘤接种后1、2、3周肿瘤微血管密度分别为(15±4.3)/HP、(17±3.6)/HP和(45±7.8)/HP。接种后3周较前两周有显著性增加。正常肝脏组织和肝癌组织中都有大量促血管生成素-1(Ang-1)mRNA表达，二者差异无显著性(T=3.214，P=0.126)。正常肝脏组织中无促血管生成素-2(Ang-2)mRNA表达，而肝癌组织中有大量Ang-2mRNA表达且与肿瘤微血管密度呈正相关。结论 Ang-2可能与原位接种肝癌中新生血管的形成有一定关系。
关键词 肝肿瘤 癌 新生血管形成 促血管生成素 原位种植肝癌模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)09-0777-02
, http://www.100md.com
Significance of angiopoietin mRNA expression in the
tissue of in-situ implanted hepatoma
Peng Lin，Wang Weidong，Sun Jian
Depatment of Hepatobiliary Surgery of Guangdong Provincial People’s Hospital，
Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To study the relationship of the expression of angiopoietin gene and angiogenesis in the in-situ implanted hepatoma in rats.MethodsForty Wistar rats were used to establish the in-situ implanted hepˉatoma modelby implanting Walker256hepatoma cell line.The number of newborn vessel in hepatoma was calculated with direct count.The expression of angiopoietin mRNA was observed by in-situ hybridization method.Results The density of microvessel in the implanted hepatoma were15±4.3/HP、17±3.6/HP、45±7.8/HP separately in the firstday of1，2and3week postimplantatively.The amount of the microvessel density andthe expression of Ang-2mRNA were increased significantly in the implanted hepatoma compared with the normal hepatic tissue.Conclusion Angiopoietin-2mRNA may play a role in the angiogenesis of the in-situ implanted hepatoma.
, 百拇医药
Key words hepatoma cancer angiogenesis angiopoietin implanted hepatoma modelin situ
最近发现促血管生成素(angiopoietin)及其酪氨酸受体Tie2在机体和肿瘤血管生成中发挥着重要的作用，目前已发现Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四种配体 [1，2] 。但对于Angiopoietin/Tie2系统在肝癌血管生成中的作用尚缺乏报道。在本实验中，我们采用原位种植肝癌模型，用原位杂交染色法检测肝癌组织中促血管生成素基因的表达，分析其表达和肝癌新生血管形成的关系。
1 材料与方法
1.1 原位种植肝癌模型的建立及标本收集 取Wistar大鼠40只，体重160～180g，平均172g，雌雄兼用。取生长旺盛的Walker256癌肉瘤大鼠(上海医药工业研究院提供)，无菌条件下分离出癌组织，切成1mm×1mm×1mm大小的小块，置于DMEM培养液中备用。按照我们以前的方法建立原位种植肝癌模型 [3] 。随机将大鼠分为4组，其中10只为正常对照，另3组为实验组。分别于接种后1、2、3周各取10只开腹取肝脏及肝癌组织，立即以10%福尔马林固定，24h内石蜡包埋。连续切片厚6μm，分别行HE染色和免疫组织化学染色。原位杂交切片以4%多聚甲醛固定，24h内包埋切片，切片厚度4μm。
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1.2 血管密度测定 HE染色切片200倍光镜下计数3个视野微血管数目取平均值作为微血管密度。另计数免疫组织化学染色切片强阳性、弱阳性及阴性血管的数目，取平均值。
1.3 原位杂交染色步骤 切片常规脱蜡至水，用0.5%H 2 O 2 /甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化1min，0.5M PBS溶液洗涤3次，每次5min。蒸馏水洗1次。在切片组织中加入20μl经变性处理的地高辛标记的Anˉgiopoietin-1和Angiopoietin-2杂交探针，盖上预先硅化好的盖玻片。置于湿盒中39℃杂交16～18h。杂交反应后，用37℃左右水温的2×SSC溶液洗涤3次，每次5min。滴加杂交后稳定液，37℃，4～6h。以0.5M PBS溶液洗涤5min×3次。滴加封闭液，室温20min，不洗。滴加兔抗地高辛，20℃～37℃反应60min，0.5M PBS洗涤2min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG20℃～37℃反应20min，0.5M PBS洗涤2min×3次。滴加SABC，20℃～37℃反应20min，0.5MPBS洗涤5min×4次。DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察。
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1.4 统计学方法 实验结果以均数±标准差记录，采用SAS统计分析软件行t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 大体及组织学观察 肝脏组织中接种Walker256癌肉瘤后1周即可在接种部位出现大小不等的肝癌肿块，2周、3周肿瘤逐渐变大，少数出现肿瘤周围肝组织的转移和腹水形成。HE染色可证实肝癌的形成和大量血管形成。
2.2 微血管密度测定 Walker256癌肉瘤接种后1、2、3周肿瘤微血管密度分别为(15±4.3)/HP、(17±3.6)/HP和(45±7.8)/HP，第1、2周相比差异无显著性(P>0.05)，第3周和前2周相比微血管数目显著增多(P<0.05)。
2.3 原位杂交检测结果 正常肝组织和肝癌组织中都有大量促血管生成素-1(Ang-1)mRNA表达，肝癌组织[(56±6)/HP]和正常肝脏[(48±4)/HP]之间差异无显著性(T=3.214，P=0.126)。正常肝脏组织中无促血管生成素-2(Ang-2)mRNA的表达，而肝癌组织中有大量Ang-2mRˉNA[(32±8)/HP]表达，主要集中于癌灶边缘与正常肝脏交界处，在血管密集处表达较强，肝脏窦状间隙的内皮细胞胞浆中可有少量表达。肝癌组织中的Ang-2的表达较正常肝脏组织明显增加(T=3.087，P<0.01)。
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3 讨论
促血管生成素Ang-1和Ang-2是近年来发现的Tie2受体的配体。Ang-1和受体结合后通过调节内皮细胞与周围间质细胞的相互作用而发挥维持血管稳定、促进新生血管成熟化的作用。Angiopoietin/Tie2系统在胚胎时期是血管形成的另一信息通道，其在成熟机体和病理况下的作用尚有待阐明。
关于Angiopoietin在肝癌血管生成中的作用目前尚很少报道，日本学者Tanaka用半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)法研究了肝癌组织和正常肝脏组织中的Anˉgiopoietin表达，发现Ang-1在肝癌组织和正常肝脏组织差异无显著性，Ang-2则主要集中在肝组织中 [4] 。但RT-PCR无法对肝脏组织中的Angiopoietin进行定位研究，因此我们采用原位杂交的方法观察了大鼠原位种植肝癌组织和正常肝脏中的表达。在本实验中，我们用原位杂交的方法检测了Angiopoietin基因在肝癌组织和正常肝脏中的表达。发现Ang-1在正常肝脏和肝癌组织中的表达没有明显区别，Ang-2在正常肝组织中极少表达，却在肝癌组织中有 较多表达，二者相比差异有显著性。原位种植肝癌是研究原发性肝癌较好的模型，由于肝脏本身具有很强的免疫性，大多采用组织移植的方法。接种1～2周即能形成明显的肝癌，第3周时可见到肿瘤向周围的转移和腹水形成。从肿瘤微血管密度的检测来看，肝癌的长大和发展伴有微血管密度的增加，说明血管形成和肝癌发展有密切关系。本研究结果发现:Ang-1在正常肝脏和肝癌组织中均有较强表达，Ang-2mRNA在正常肝脏组织中几乎不表达，但在肝癌组织中却呈强阳性表达，与RT-PCR检测的结果一致。但Ang-2的表达主要集中于癌灶边缘与正常肝脏交界处，在血管密集处表达较强，肝脏窦状间隙的内皮细胞胞浆中可有少量表达。说明Angiopoietin在肝癌的转移过程中可能起到一定作用。结合我们以前的研究，Ang-1在体外对血管内皮细胞具有趋化作用而Ang-2则在体内血管活跃的地方表达较强，因此我们认为Ang-2可能参与了肝癌新生血管形成
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的启动环节 [5] 。进一步研究Angiopoietin/Tie2系统在肝癌血管生成及转移中的作用，将有助于了解肝癌新生血管形成的机制，为开发以肝癌新生血管为目标的抗血管生成疗法奠定基础。
参考文献
1 Maisonpierre P，Suri C，Jones F，et al.Angiopoietin-2，a natural antagˉonist for Tie2that disrupts in vivo angiogenesis.Science，1997，277(5):55-60.
2 Valenzuela DM，Griffiths JA，Rojas J，et al.Angiopoietins3and4:Diˉverginggene counterparts in mice and humans.PNAS，1999，96(5):1904-1909.
, 百拇医药
3 彭林，区金锐，王卫东，等.原位种植肝癌新生血管的检测及血管内皮细胞生长因子mRMA的表达.世界华人消化杂志，2002，10(6):717-718.
4 Tanaka S，Mori M，Sakamoto Y，et al.Biologic significance of Angiopoiˉetin-2expression in human hepatocellular carcinoma.J Clin Invest，1999，103(2):341-345.
5 Peng L，Sun J，Wang WD，et al.Biological effect of ectopic expression of Angiopoietin in hepatocellular carcinoma cell line.HBPD Int，2003，2(1):94-97.
作者单位:510080广州广东省人民医院肝胆外科
(编辑 曲全), 百拇医药
关键词 肝肿瘤 癌 新生血管形成 促血管生成素 原位种植肝癌模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)09-0777-02
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Significance of angiopoietin mRNA expression in the
tissue of in-situ implanted hepatoma
Peng Lin，Wang Weidong，Sun Jian
Depatment of Hepatobiliary Surgery of Guangdong Provincial People’s Hospital，
Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To study the relationship of the expression of angiopoietin gene and angiogenesis in the in-situ implanted hepatoma in rats.MethodsForty Wistar rats were used to establish the in-situ implanted hepˉatoma modelby implanting Walker256hepatoma cell line.The number of newborn vessel in hepatoma was calculated with direct count.The expression of angiopoietin mRNA was observed by in-situ hybridization method.Results The density of microvessel in the implanted hepatoma were15±4.3/HP、17±3.6/HP、45±7.8/HP separately in the firstday of1，2and3week postimplantatively.The amount of the microvessel density andthe expression of Ang-2mRNA were increased significantly in the implanted hepatoma compared with the normal hepatic tissue.Conclusion Angiopoietin-2mRNA may play a role in the angiogenesis of the in-situ implanted hepatoma.
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Key words hepatoma cancer angiogenesis angiopoietin implanted hepatoma modelin situ
最近发现促血管生成素(angiopoietin)及其酪氨酸受体Tie2在机体和肿瘤血管生成中发挥着重要的作用，目前已发现Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四种配体 [1，2] 。但对于Angiopoietin/Tie2系统在肝癌血管生成中的作用尚缺乏报道。在本实验中，我们采用原位种植肝癌模型，用原位杂交染色法检测肝癌组织中促血管生成素基因的表达，分析其表达和肝癌新生血管形成的关系。
1 材料与方法
1.1 原位种植肝癌模型的建立及标本收集 取Wistar大鼠40只，体重160～180g，平均172g，雌雄兼用。取生长旺盛的Walker256癌肉瘤大鼠(上海医药工业研究院提供)，无菌条件下分离出癌组织，切成1mm×1mm×1mm大小的小块，置于DMEM培养液中备用。按照我们以前的方法建立原位种植肝癌模型 [3] 。随机将大鼠分为4组，其中10只为正常对照，另3组为实验组。分别于接种后1、2、3周各取10只开腹取肝脏及肝癌组织，立即以10%福尔马林固定，24h内石蜡包埋。连续切片厚6μm，分别行HE染色和免疫组织化学染色。原位杂交切片以4%多聚甲醛固定，24h内包埋切片，切片厚度4μm。
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1.2 血管密度测定 HE染色切片200倍光镜下计数3个视野微血管数目取平均值作为微血管密度。另计数免疫组织化学染色切片强阳性、弱阳性及阴性血管的数目，取平均值。
1.3 原位杂交染色步骤 切片常规脱蜡至水，用0.5%H 2 O 2 /甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化1min，0.5M PBS溶液洗涤3次，每次5min。蒸馏水洗1次。在切片组织中加入20μl经变性处理的地高辛标记的Anˉgiopoietin-1和Angiopoietin-2杂交探针，盖上预先硅化好的盖玻片。置于湿盒中39℃杂交16～18h。杂交反应后，用37℃左右水温的2×SSC溶液洗涤3次，每次5min。滴加杂交后稳定液，37℃，4～6h。以0.5M PBS溶液洗涤5min×3次。滴加封闭液，室温20min，不洗。滴加兔抗地高辛，20℃～37℃反应60min，0.5M PBS洗涤2min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG20℃～37℃反应20min，0.5M PBS洗涤2min×3次。滴加SABC，20℃～37℃反应20min，0.5MPBS洗涤5min×4次。DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察。
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1.4 统计学方法 实验结果以均数±标准差记录，采用SAS统计分析软件行t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 大体及组织学观察 肝脏组织中接种Walker256癌肉瘤后1周即可在接种部位出现大小不等的肝癌肿块，2周、3周肿瘤逐渐变大，少数出现肿瘤周围肝组织的转移和腹水形成。HE染色可证实肝癌的形成和大量血管形成。
2.2 微血管密度测定 Walker256癌肉瘤接种后1、2、3周肿瘤微血管密度分别为(15±4.3)/HP、(17±3.6)/HP和(45±7.8)/HP，第1、2周相比差异无显著性(P>0.05)，第3周和前2周相比微血管数目显著增多(P<0.05)。
2.3 原位杂交检测结果 正常肝组织和肝癌组织中都有大量促血管生成素-1(Ang-1)mRNA表达，肝癌组织[(56±6)/HP]和正常肝脏[(48±4)/HP]之间差异无显著性(T=3.214，P=0.126)。正常肝脏组织中无促血管生成素-2(Ang-2)mRNA的表达，而肝癌组织中有大量Ang-2mRˉNA[(32±8)/HP]表达，主要集中于癌灶边缘与正常肝脏交界处，在血管密集处表达较强，肝脏窦状间隙的内皮细胞胞浆中可有少量表达。肝癌组织中的Ang-2的表达较正常肝脏组织明显增加(T=3.087，P<0.01)。
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3 讨论
促血管生成素Ang-1和Ang-2是近年来发现的Tie2受体的配体。Ang-1和受体结合后通过调节内皮细胞与周围间质细胞的相互作用而发挥维持血管稳定、促进新生血管成熟化的作用。Angiopoietin/Tie2系统在胚胎时期是血管形成的另一信息通道，其在成熟机体和病理况下的作用尚有待阐明。
关于Angiopoietin在肝癌血管生成中的作用目前尚很少报道，日本学者Tanaka用半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)法研究了肝癌组织和正常肝脏组织中的Anˉgiopoietin表达，发现Ang-1在肝癌组织和正常肝脏组织差异无显著性，Ang-2则主要集中在肝组织中 [4] 。但RT-PCR无法对肝脏组织中的Angiopoietin进行定位研究，因此我们采用原位杂交的方法观察了大鼠原位种植肝癌组织和正常肝脏中的表达。在本实验中，我们用原位杂交的方法检测了Angiopoietin基因在肝癌组织和正常肝脏中的表达。发现Ang-1在正常肝脏和肝癌组织中的表达没有明显区别，Ang-2在正常肝组织中极少表达，却在肝癌组织中有 较多表达，二者相比差异有显著性。原位种植肝癌是研究原发性肝癌较好的模型，由于肝脏本身具有很强的免疫性，大多采用组织移植的方法。接种1～2周即能形成明显的肝癌，第3周时可见到肿瘤向周围的转移和腹水形成。从肿瘤微血管密度的检测来看，肝癌的长大和发展伴有微血管密度的增加，说明血管形成和肝癌发展有密切关系。本研究结果发现:Ang-1在正常肝脏和肝癌组织中均有较强表达，Ang-2mRNA在正常肝脏组织中几乎不表达，但在肝癌组织中却呈强阳性表达，与RT-PCR检测的结果一致。但Ang-2的表达主要集中于癌灶边缘与正常肝脏交界处，在血管密集处表达较强，肝脏窦状间隙的内皮细胞胞浆中可有少量表达。说明Angiopoietin在肝癌的转移过程中可能起到一定作用。结合我们以前的研究，Ang-1在体外对血管内皮细胞具有趋化作用而Ang-2则在体内血管活跃的地方表达较强，因此我们认为Ang-2可能参与了肝癌新生血管形成
, http://www.100md.com
的启动环节 [5] 。进一步研究Angiopoietin/Tie2系统在肝癌血管生成及转移中的作用，将有助于了解肝癌新生血管形成的机制，为开发以肝癌新生血管为目标的抗血管生成疗法奠定基础。
参考文献
1 Maisonpierre P，Suri C，Jones F，et al.Angiopoietin-2，a natural antagˉonist for Tie2that disrupts in vivo angiogenesis.Science，1997，277(5):55-60.
2 Valenzuela DM，Griffiths JA，Rojas J，et al.Angiopoietins3and4:Diˉverginggene counterparts in mice and humans.PNAS，1999，96(5):1904-1909.
, 百拇医药
3 彭林，区金锐，王卫东，等.原位种植肝癌新生血管的检测及血管内皮细胞生长因子mRMA的表达.世界华人消化杂志，2002，10(6):717-718.
4 Tanaka S，Mori M，Sakamoto Y，et al.Biologic significance of Angiopoiˉetin-2expression in human hepatocellular carcinoma.J Clin Invest，1999，103(2):341-345.
5 Peng L，Sun J，Wang WD，et al.Biological effect of ectopic expression of Angiopoietin in hepatocellular carcinoma cell line.HBPD Int，2003，2(1):94-97.
作者单位:510080广州广东省人民医院肝胆外科
(编辑 曲全), 百拇医药