不完全抗体效价快速检测法
【摘要】 目的 探讨两种不完全抗体效价快速检测方法的应用价值。方法 通过凝聚胺法和传统抗人球法在不完全抗体效价测定进行对比试验。结果 凝聚胺法准确性和稳定性均较好，比抗人球法效价高2个滴度。结论 凝聚胺法可应用于抗体效价的快速检测。
关键词 polybrene 抗人球蛋白 新生儿溶血病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0918-02
Rapid examination of the title of IgG Antibody
Zhao Yang，Luo Guangping，Li Shijie，et al.
Guangzhou Blood Center，510095.
, 百拇医药
【Abstract】 Polybrene reagent was employed in the examination of the title of IgG antibody compared with stanˉdard Antihuman globulin(AHG)reagent，theresult of Polybrene showed two titles higher than AHG with satisfactory accuracy and stability.It is indicated that the application of Polybrene reagent in thefield of rapid test IgG antibody’s title is avalibable.
Key word polybrene AHG HDW
孕妇血浆内的高效价IgG抗体可通过胎盘屏障进入胎儿体内，与胎儿红细胞上对应的血型抗原结合，抗原抗体反应导致胎儿红细胞溶血，出生后临床表现为新生儿病理性黄疸。现在证明母体高效价IgG抗体是新生儿溶血病的主要病因，孕妇不完全抗体效价检测已成为围产期检查的常规项目。传统的抗人球法时间长，步骤繁琐，不少实验室开展有困难，有报道凝聚胺试剂盒可用于效价测定 [1] ，我们对这两种方法进行了比较。
, 百拇医药
1 材料
1.1 凝聚胺(polybrene)试剂盒 台湾BASO公司产品，包括低离子介质，凝聚胺，重悬液。
1.2 抗人球蛋白血清 上海血液中心血型参比实验室提供。
1.3 0.1%2-巯基乙醇(2-Me) 自配。
1.4 3%标准A、B型红细胞 自配。
1.5 质控抗D血清 美国Biotest公司产品。
1.6 检测对象 50例医院送检的O型孕妇血清标本。
2 方法
2.1 IgG抗体的制备 标本血清和2-Me按1:2加入玻璃试管中，封口置37℃水浴10min。另外标记四排试管，分别 检测IgG抗A、IgG抗B抗体，每管加入生理盐水2滴，采用倍比稀释法将水浴后已破坏IgM抗体的待检血清分别加入两排试管中，此时稀释度分别是1:4，1:8，余此类推。
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2.2 抗人球法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，37℃水浴1h，生理盐水洗涤3次，加入2滴抗人球试剂，离心看结果。
2.3 凝聚胺法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，加入0.6ml低离子介质，2滴聚凝胺，37℃混合均匀1min，离心15s，倒去上清，加入2滴重悬液，观察结果。
2.4 结果判断 以产生1+反应的血清最高稀释度来确立效价，凝聚胺法减去前两支管4+凝集的评分(2×12分)进行修正，通过凝集强度评分标准对试验结果进行统计学分析，评价两种方法的差异 [2] 。
2.5 质控 两种方法需同时做质控，阳性对照管加入2滴IgG抗D血清，阴性对照管加入2滴AB型血清或生理盐水，阴、阳性管各加入1滴3%O型Rh(D)阳性细胞，两种反应介质的加入同2.2、2.3。
3 结果
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3.1 IgG抗A抗体效价测定 见表1。
表1 50例“O”型孕妇IgG抗A抗体效价测定略
根据表1结果进行配对资料的t检验，以积分值为比较数据，t=1.32，P>0.10，修正后两组积分
值差异无显著性。
3.2 IgG抗B抗体效价测定 见表2。
表2 50例“O”型孕妇IgG抗B抗体效价测定略
4 讨论
抗人球蛋白试验是检测血清中不完全血型抗体的经典方法，用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。广泛应用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，交叉配血试验以及孕妇IgG抗体效价测定。抗人球法干扰少，结果准确，但因为反应需水浴1h，比较费时，因此寻找抗人球法的替代实验一直在研究中。抗入球法的关键是洗涤步骤，红细胞必须被生理盐水全程足量充分洗涤，盐水要用力冲入管底，使积压于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防来自皮肤的蛋白污染。
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国内外加速不完全抗体反应的方法研究已有较长时间，其中由美国学者Lalerazi首先提出的Polybrene法可在3min内完成实验。该方法分致敏、促凝和中和三步进行，BASO公司的Polybrene法操作与它极其类似。Polybrene法的实验原理是:凝聚胺(Polybrene)是带有正电荷的大分子物质，能够中和红细胞膜唾液酸组成的负电荷，减少细胞间静电斥力，使细胞间距缩短，而又不致引起红细胞间的非特异凝集。在生理盐水介质中长度较短的IgG抗体不能造成抗原抗体的凝集反应，但在Polybrene与低离子介质共同作用下细胞距离被缩短，IgG抗体可在细胞间搭成复桥，离心后可见凝集反应，非特异性的凝集可被带负电荷的重悬液(枸橼酸钠)消除，对IgM抗体的作用则是增强凝集反应强度 [3] 。其他的还有LIM(低离子强度)法，PEG(聚乙二醇)法和IRAT法等，但研究均停留在凝集反应的定性实验，缺少 对抗体效价测定研究的半定量实验的资料。本实验50例孕妇血清不完全抗体效价半定量检测结果可见，凝聚胺法相对抗人球法敏感，平均高出2个滴度。通过减少凝聚胺法前两管凝集评分(2×12分)，修正后凝聚胺法与抗人球法的效价积分值统计显示P>0.10或0.05，说明两种方法测定抗体效价结果差异无显著性，建议报告IgG抗A或抗B抗体效价结果时，凝聚胺法降低2个滴度就是经典抗人球法的结果。凝聚胺试剂对冷抗体敏感，实验需在37℃水浴1min，强冷自身凝集素干扰时可置56℃水浴1min下松动细胞扣。室温低时若持续出现高滴度效价结果时应考虑这方面原因。纤维蛋白原会在凝聚胺试剂中凝集成纤维蛋白原块，干扰结果，建议用血清标本 [4] 。另外，鉴于凝聚胺中和红细胞表面负电荷是量的反应，正电荷与负电荷的相对量将影响实验结果，因此每批试剂要作质控，排除假阴性、假阳性结果。凝聚胺方法操作简便，无需1h水浴，准确性和稳定性达到实验要求，所以在IgG抗体效价测定实验中凝聚胺法可替代抗人球法。
, 百拇医药
参考文献
1 Braga GW，Bordin JO，Moreira Junior G，et al.Laboratory diagnosis of auto-immune hemolytic anemia:characteristics of the manual direct test of Polybrene.Rev Assoc Med Bras，1998Jan-Mar，44(1):16-20.
2 吕鹏.最新输血技术学，北京:人民卫生出版社，1994，413-416.
3 Lalerazi P.The manual hexadimethrine bromide(polybrene)test:effects of serum proteins and practical applications.Transfusion1987，27(4):295.
4 赵进生，旷婕萍.不完全抗体快速促凝剂的研制和初步应用报告.中国输血杂志，1992，(1):64.
作者单位:510095广东省广州市血液中心
(收稿日期:2004-02-03)
(编辑 清泉), 百拇医药
关键词 polybrene 抗人球蛋白 新生儿溶血病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0918-02
Rapid examination of the title of IgG Antibody
Zhao Yang，Luo Guangping，Li Shijie，et al.
Guangzhou Blood Center，510095.
, 百拇医药
【Abstract】 Polybrene reagent was employed in the examination of the title of IgG antibody compared with stanˉdard Antihuman globulin(AHG)reagent，theresult of Polybrene showed two titles higher than AHG with satisfactory accuracy and stability.It is indicated that the application of Polybrene reagent in thefield of rapid test IgG antibody’s title is avalibable.
Key word polybrene AHG HDW
孕妇血浆内的高效价IgG抗体可通过胎盘屏障进入胎儿体内，与胎儿红细胞上对应的血型抗原结合，抗原抗体反应导致胎儿红细胞溶血，出生后临床表现为新生儿病理性黄疸。现在证明母体高效价IgG抗体是新生儿溶血病的主要病因，孕妇不完全抗体效价检测已成为围产期检查的常规项目。传统的抗人球法时间长，步骤繁琐，不少实验室开展有困难，有报道凝聚胺试剂盒可用于效价测定 [1] ，我们对这两种方法进行了比较。
, 百拇医药
1 材料
1.1 凝聚胺(polybrene)试剂盒 台湾BASO公司产品，包括低离子介质，凝聚胺，重悬液。
1.2 抗人球蛋白血清 上海血液中心血型参比实验室提供。
1.3 0.1%2-巯基乙醇(2-Me) 自配。
1.4 3%标准A、B型红细胞 自配。
1.5 质控抗D血清 美国Biotest公司产品。
1.6 检测对象 50例医院送检的O型孕妇血清标本。
2 方法
2.1 IgG抗体的制备 标本血清和2-Me按1:2加入玻璃试管中，封口置37℃水浴10min。另外标记四排试管，分别 检测IgG抗A、IgG抗B抗体，每管加入生理盐水2滴，采用倍比稀释法将水浴后已破坏IgM抗体的待检血清分别加入两排试管中，此时稀释度分别是1:4，1:8，余此类推。
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2.2 抗人球法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，37℃水浴1h，生理盐水洗涤3次，加入2滴抗人球试剂，离心看结果。
2.3 凝聚胺法 两排试管中分别加入标准A、B细胞各1滴，加入0.6ml低离子介质，2滴聚凝胺，37℃混合均匀1min，离心15s，倒去上清，加入2滴重悬液，观察结果。
2.4 结果判断 以产生1+反应的血清最高稀释度来确立效价，凝聚胺法减去前两支管4+凝集的评分(2×12分)进行修正，通过凝集强度评分标准对试验结果进行统计学分析，评价两种方法的差异 [2] 。
2.5 质控 两种方法需同时做质控，阳性对照管加入2滴IgG抗D血清，阴性对照管加入2滴AB型血清或生理盐水，阴、阳性管各加入1滴3%O型Rh(D)阳性细胞，两种反应介质的加入同2.2、2.3。
3 结果
, http://www.100md.com
3.1 IgG抗A抗体效价测定 见表1。
表1 50例“O”型孕妇IgG抗A抗体效价测定略
根据表1结果进行配对资料的t检验，以积分值为比较数据，t=1.32，P>0.10，修正后两组积分
值差异无显著性。
3.2 IgG抗B抗体效价测定 见表2。
表2 50例“O”型孕妇IgG抗B抗体效价测定略
4 讨论
抗人球蛋白试验是检测血清中不完全血型抗体的经典方法，用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。广泛应用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，交叉配血试验以及孕妇IgG抗体效价测定。抗人球法干扰少，结果准确，但因为反应需水浴1h，比较费时，因此寻找抗人球法的替代实验一直在研究中。抗入球法的关键是洗涤步骤，红细胞必须被生理盐水全程足量充分洗涤，盐水要用力冲入管底，使积压于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防来自皮肤的蛋白污染。
, http://www.100md.com
国内外加速不完全抗体反应的方法研究已有较长时间，其中由美国学者Lalerazi首先提出的Polybrene法可在3min内完成实验。该方法分致敏、促凝和中和三步进行，BASO公司的Polybrene法操作与它极其类似。Polybrene法的实验原理是:凝聚胺(Polybrene)是带有正电荷的大分子物质，能够中和红细胞膜唾液酸组成的负电荷，减少细胞间静电斥力，使细胞间距缩短，而又不致引起红细胞间的非特异凝集。在生理盐水介质中长度较短的IgG抗体不能造成抗原抗体的凝集反应，但在Polybrene与低离子介质共同作用下细胞距离被缩短，IgG抗体可在细胞间搭成复桥，离心后可见凝集反应，非特异性的凝集可被带负电荷的重悬液(枸橼酸钠)消除，对IgM抗体的作用则是增强凝集反应强度 [3] 。其他的还有LIM(低离子强度)法，PEG(聚乙二醇)法和IRAT法等，但研究均停留在凝集反应的定性实验，缺少 对抗体效价测定研究的半定量实验的资料。本实验50例孕妇血清不完全抗体效价半定量检测结果可见，凝聚胺法相对抗人球法敏感，平均高出2个滴度。通过减少凝聚胺法前两管凝集评分(2×12分)，修正后凝聚胺法与抗人球法的效价积分值统计显示P>0.10或0.05，说明两种方法测定抗体效价结果差异无显著性，建议报告IgG抗A或抗B抗体效价结果时，凝聚胺法降低2个滴度就是经典抗人球法的结果。凝聚胺试剂对冷抗体敏感，实验需在37℃水浴1min，强冷自身凝集素干扰时可置56℃水浴1min下松动细胞扣。室温低时若持续出现高滴度效价结果时应考虑这方面原因。纤维蛋白原会在凝聚胺试剂中凝集成纤维蛋白原块，干扰结果，建议用血清标本 [4] 。另外，鉴于凝聚胺中和红细胞表面负电荷是量的反应，正电荷与负电荷的相对量将影响实验结果，因此每批试剂要作质控，排除假阴性、假阳性结果。凝聚胺方法操作简便，无需1h水浴，准确性和稳定性达到实验要求，所以在IgG抗体效价测定实验中凝聚胺法可替代抗人球法。
, 百拇医药
参考文献
1 Braga GW，Bordin JO，Moreira Junior G，et al.Laboratory diagnosis of auto-immune hemolytic anemia:characteristics of the manual direct test of Polybrene.Rev Assoc Med Bras，1998Jan-Mar，44(1):16-20.
2 吕鹏.最新输血技术学，北京:人民卫生出版社，1994，413-416.
3 Lalerazi P.The manual hexadimethrine bromide(polybrene)test:effects of serum proteins and practical applications.Transfusion1987，27(4):295.
4 赵进生，旷婕萍.不完全抗体快速促凝剂的研制和初步应用报告.中国输血杂志，1992，(1):64.
作者单位:510095广东省广州市血液中心
(收稿日期:2004-02-03)
(编辑 清泉), 百拇医药