CD9及P170在白血病患者中的表达及其临床意义
【摘要】 目的 探讨CD9及P170在白血病患者中的表达与分型、疗效、预后的关系。方法 采用SAP法检测了53例白血病患者CD9及P170的表达。结果 (1)淋系白血病(T-ALL、B-ALL及CLL)CD9表达较高，阳性率达52%，与对照组(5.5%)比较差异有显著性(P<0.01)，其中B-ALL表达CD9(73%)高于T-ALL(28%)及CLL(33%)(P<0.05)。(2)髓系白血病CD9的表达率为59%，特别高表达于M 3 (82%)、M 5 (88%)及CML(67%)，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。(3)白血病NR或复发组P170表达(83%)明显高于CR或PR组(15%)及对照组(11%)(P<0.01)。(4)白血病CD9及P170的表达之间无相关性(r=0.038，P>0.05)。结论 CD9可作为M 3 及B-ALL的一个鉴别诊断指标，了解白血病P170的表达对判断预后及选择化疗方案具有一定指导价值。
关键词 白血病 抗原CD9 蛋白P170 表达
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-0961-02
Clinical significance of CD9antigen and
P170protein expression in leukemia
Yuan Shuyun，Cai Zongyou，Hu Dingbo，et al.
Affiliated Zhanjiang Center Hospital，Guangdong524037.
【Abstract】 Objective To investigate the expression of CD9and protein P170in leukemia patients and its reˉlationship with immunophenotyping and treatment outcome and prognosis.Methods SAP was used to examine the exˉpression of CD9and protein P170in53leukemia patients.Results (1)The expression of CD9enhance in lymˉphoblastic leukemia(T-ALL and B-ALL and CLL)，the positivity percentagereaches to52%.There is significantly different from those of the control group(5.5%)(P<0.01).And the expression of CD9in B-ALL(73%)is signifiˉcantly higher than that in T-ALL(28%)and CLL(33%)(P<0.05).(2)The expression of CD9in myeloid leukemia is59%，in particular，it marked highly in M 3 (82%)and M 5 (88%)and CML(67%)，There is significantly!differˉent from that of the controlgroup(5.5%)(P<0.01).(3)The expression of P170in leukemia NR or relapsed group(83%)is significantly higher than that in CR or PR group(15%)and the control group(11%)(P<0.01).(4)No significant correlation was found between the expression of CD9and P170in leukemia(r=0.038，P>0.05).Conˉclusion We suggest that CD9could be regarded as an effective method to distinguish M 3 and B-ALL.It is valuable to guess the prognosis and choose the chemotherapy method depending on the expression of P170in leukemia.Key words Leukemia Antigens，CD9 Protein，P170 Expression
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CD9是一种广泛分布于血小板、前B细胞、单核细胞等造血细胞及一些非造血组织细胞中的非系性分化抗原。CD9抗原的研究以往多限于正常的造血细胞，在白血病免疫分型中报道较少。多药耐药(MDR)是急性白血病化疗失败的主要原因，其机制较复杂，现认为多药耐药基因(mdr1)编码的P170蛋白过度表达所介导的耐药是其主要的经典途径 [1] 。为了解白血病化疗及其耐药和预后与分型的相关性，我们常规选择了12种单抗对53例白血病患者进行了免疫分型，同时观察了CD9及P170蛋白的表达情况，以期探讨P170蛋白与疗效的关系和CD9抗原在白血病细胞中表达的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 3年来本院收治的53例白血病，其中男34例，女19例，中位年龄40岁(7～75岁)。FAB分型ALL18例;AML26例，包括M 1 2例、M 2 6例、M 3 7例、M 4 3例、M 5 8例;CML6例;CLL3例。除4例复发外，其余均为初诊病例。18例非恶性增生性贫血为对照组。
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1.2 标本处理 骨髓或外周静脉血白血病细胞>0.30，CLL患者外周血淋巴细胞>0.75。取骨髓或外周血标本1ml，肝素抗凝(10～20U/ml)，Ficoll-hypaque密度梯度离心法常规分离单个核细胞，涂片，充分干燥，如当天不进行染色，则密封置4℃保存。
1.3 单克隆抗体(单抗)选择 包括:CD9、P170、CD19、CD20、CD22、CD2、CD7、CD3、CD4、CD8、CD33、CD13、CD14、CD15、CD11、CD41、CD61、HLA-DR，试剂购自美国ZYMED公司及北京中山生物技术有限公司。
2 方法
2.1 实验方法 采用SAP法，按试剂盒说明书，固定，加入单抗37℃孵育60min或4℃过夜，再依次加入二抗(IgG/Bio)、三抗(S-A/AP)分别孵育30～45min，显色、复染、封片。每次实验均进行阴性对照染色。
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2.2 结果判定 细胞膜着红色为阳性细胞，不着色者为阴性细胞。计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。阳性判断标准:CD9及淋系相关抗原阳性细胞≥30%，髓系相关抗原阳性细胞≥20%，P170≥5% [2] 。
2.3 统计学处理 采用X 2 检验及直线相关分析。
3 结果
3.1 21例淋巴细胞白血病CD9的表达 18例ALL中，经免疫分型分为B-ALL11例，T-ALL7例，3例CLL表达B细胞表型。CD9在B-ALL的表达为73%、T-ALL为28%、CLL为33%，B-ALL与T-ALL及CLL之间CD9的表达率差异有显著性(P<0.05)，而T-ALL与B-CLL之间则无统计学意义(P>0.05)。对照组CD9的阳性率为5.5%(1/18例)，与淋巴细胞白血病(52%)及各型之间差异有显著性(P<0.01)。
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3.2 32例髓系白血病CD9的表达 髓系白血病CD9的表达率为59%，M 1 为0(0/2)，M 2 为17%(1/6)，M 4 为33%(1/3)，M 3 为86%(6/7)，M 5 为88%(7/8)，CML为67%(4/6)，CD9高表达于M 3 、M 5 及CML，对照组CD9表达率为5.5%，之间差异有显著性(P<0.01)。
3.3 53例白血病P170的表达 P170在NR(未缓解)或复发组的表达率为84%(16/19)，阳性细胞率为37.7±27.2%;CR(完全缓解)或PR(部分缓解)组为15%(5/34)，阳性细胞率为2.85±2.83%。两者之间表达差异有显著性(P<0.01)。对照组表达率为11%(2/18)，阳性细胞率为1.67±2.03%，与NR或复发组之间差异有非常显著性(P<0.01)，而与CR或PR组间差异无显著性(P>0.05)。
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3.4 白血病P170与CD9的表达之间无相关性(r=0.038，P>0.05)。
4 讨论
单抗在白血病免疫分型中的应用，不仅提高了白血病诊断准确率，还可了解白血病细胞的起源和分化阶段，为临床制定治疗策略和评估预后提供较为可靠的依据。但随着对白细胞分化抗原(CD)的深入研究，发现多数CD都缺乏严格的系列特异性。用于白血病免疫分型的单抗大多与不同细胞呈交叉反应，因此，发现和选择白血病细胞相关标志，联合使用多种单抗观察在白血病细胞上的反应，将会进一步提高白血病的诊断准确率及其特性的认识。
本文分析了18例ALL和3例B-CLL细胞CD9的表达，发现不同类型淋巴细胞白血病之间CD9的表达率存在差异，B-ALL的CD9表达较高，提示在淋巴细胞白血病分型中，应用CD9对鉴别诊断B-ALL和T-ALL具有参考意义。单抗的应用使ALL的分型取得了很大进展，但由于髓系相关抗原缺乏阶段特异性，至今未发现AML FAB各亚型 的特异性标志，因此AML免疫分型与FAB亚型之间的关系仍不十分明确。目前，只有少数几种抗原与AML亚型有相关性。本文结果表明M 3 、M 5 及CML细胞CD9表达高于M 1 、M 2 、M 4 ，两组之间表达率存在明显差异，与Ferrero等和De Rossi等报道相似，但还发现M 5 及CML的CD9表达率也很高，尚未见报道，是否与M 3 和M 5 之间形态分型易混淆有关，还是二者均系阳性表达，尚不能确定。AML-M 3 的临床治疗和预后不同于其它AML亚型，正确的分型诊断直接关系到选择合理的治疗方案，实验结果提示CD9对M 3 的鉴别诊断有较重要价值。形态学典型M 3 通常容易诊断，然而形态上难以确认的M 3 联合应用CD9抗原及其它免疫学标记，为临床诊断提供一个有用的依据。
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多药耐药(MDR)是白血病细胞对多种化疗药物产生耐药，导致白血病化疗失败的主要原因，是常规化疗难以使白血病获长期缓解的重要障碍。P170是MDR的表达产物，以往研究表明，白血病过度表达P170，是预后不良的原因之一。近来报道认为其耐药机制是P170作为细胞膜上的一个溢出泵，能将细胞内药物泵出细胞外，降低细胞内化疗药物浓度，进而免遭杀伤。过去认为P170高表达为获得性，是反复化疗的结果，但一些研究发现，许多患者初诊时即存在P170的高表达，提示MDR存在原发性。实验结果显示NR或复发组中存在P170高表达(83%)，而CR或PR组低表达(15%)，两组差异有非常显著性(P<0.01)，说明P170高表达可导致CR率明显下降，是预后不良因素之一。P170低表达者有2例未缓解，提示可能还有其它机制影响化疗效果 [3] 。本文结果提示CD9对M 3 及B-ALL白血病分型可作为一个鉴别诊断指标，检测P170对判断白血病预后，合理选择化疗方案具有一定指导价值。
参考文献
, 百拇医药
1 Nooter K，Sonneveld P.Clinical relevance of P-glycoprotein expression in hematologic malignancies.Leuk Res，1994，18:233-243.
2 陈为民，宋团月，伍延安，等.急性髓系白血病患者外周血CD34、Fas及P170的表达及其临床意义.中华血液学杂志，1999，8:437-438.
3 赵瑜，于力，楼方定，等.急性白病患者MRP、P26和P170表达与多药耐药关系的分析.中华血液学杂志，2000，1:40-41.
作者单位:524037广东省湛江市中心人民医院
(收稿日期:2004-03-22)
(编辑黄 杰), 百拇医药
关键词 白血病 抗原CD9 蛋白P170 表达
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-0961-02
Clinical significance of CD9antigen and
P170protein expression in leukemia
Yuan Shuyun，Cai Zongyou，Hu Dingbo，et al.
Affiliated Zhanjiang Center Hospital，Guangdong524037.
【Abstract】 Objective To investigate the expression of CD9and protein P170in leukemia patients and its reˉlationship with immunophenotyping and treatment outcome and prognosis.Methods SAP was used to examine the exˉpression of CD9and protein P170in53leukemia patients.Results (1)The expression of CD9enhance in lymˉphoblastic leukemia(T-ALL and B-ALL and CLL)，the positivity percentagereaches to52%.There is significantly different from those of the control group(5.5%)(P<0.01).And the expression of CD9in B-ALL(73%)is signifiˉcantly higher than that in T-ALL(28%)and CLL(33%)(P<0.05).(2)The expression of CD9in myeloid leukemia is59%，in particular，it marked highly in M 3 (82%)and M 5 (88%)and CML(67%)，There is significantly!differˉent from that of the controlgroup(5.5%)(P<0.01).(3)The expression of P170in leukemia NR or relapsed group(83%)is significantly higher than that in CR or PR group(15%)and the control group(11%)(P<0.01).(4)No significant correlation was found between the expression of CD9and P170in leukemia(r=0.038，P>0.05).Conˉclusion We suggest that CD9could be regarded as an effective method to distinguish M 3 and B-ALL.It is valuable to guess the prognosis and choose the chemotherapy method depending on the expression of P170in leukemia.Key words Leukemia Antigens，CD9 Protein，P170 Expression
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CD9是一种广泛分布于血小板、前B细胞、单核细胞等造血细胞及一些非造血组织细胞中的非系性分化抗原。CD9抗原的研究以往多限于正常的造血细胞，在白血病免疫分型中报道较少。多药耐药(MDR)是急性白血病化疗失败的主要原因，其机制较复杂，现认为多药耐药基因(mdr1)编码的P170蛋白过度表达所介导的耐药是其主要的经典途径 [1] 。为了解白血病化疗及其耐药和预后与分型的相关性，我们常规选择了12种单抗对53例白血病患者进行了免疫分型，同时观察了CD9及P170蛋白的表达情况，以期探讨P170蛋白与疗效的关系和CD9抗原在白血病细胞中表达的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 3年来本院收治的53例白血病，其中男34例，女19例，中位年龄40岁(7～75岁)。FAB分型ALL18例;AML26例，包括M 1 2例、M 2 6例、M 3 7例、M 4 3例、M 5 8例;CML6例;CLL3例。除4例复发外，其余均为初诊病例。18例非恶性增生性贫血为对照组。
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1.2 标本处理 骨髓或外周静脉血白血病细胞>0.30，CLL患者外周血淋巴细胞>0.75。取骨髓或外周血标本1ml，肝素抗凝(10～20U/ml)，Ficoll-hypaque密度梯度离心法常规分离单个核细胞，涂片，充分干燥，如当天不进行染色，则密封置4℃保存。
1.3 单克隆抗体(单抗)选择 包括:CD9、P170、CD19、CD20、CD22、CD2、CD7、CD3、CD4、CD8、CD33、CD13、CD14、CD15、CD11、CD41、CD61、HLA-DR，试剂购自美国ZYMED公司及北京中山生物技术有限公司。
2 方法
2.1 实验方法 采用SAP法，按试剂盒说明书，固定，加入单抗37℃孵育60min或4℃过夜，再依次加入二抗(IgG/Bio)、三抗(S-A/AP)分别孵育30～45min，显色、复染、封片。每次实验均进行阴性对照染色。
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2.2 结果判定 细胞膜着红色为阳性细胞，不着色者为阴性细胞。计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。阳性判断标准:CD9及淋系相关抗原阳性细胞≥30%，髓系相关抗原阳性细胞≥20%，P170≥5% [2] 。
2.3 统计学处理 采用X 2 检验及直线相关分析。
3 结果
3.1 21例淋巴细胞白血病CD9的表达 18例ALL中，经免疫分型分为B-ALL11例，T-ALL7例，3例CLL表达B细胞表型。CD9在B-ALL的表达为73%、T-ALL为28%、CLL为33%，B-ALL与T-ALL及CLL之间CD9的表达率差异有显著性(P<0.05)，而T-ALL与B-CLL之间则无统计学意义(P>0.05)。对照组CD9的阳性率为5.5%(1/18例)，与淋巴细胞白血病(52%)及各型之间差异有显著性(P<0.01)。
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3.2 32例髓系白血病CD9的表达 髓系白血病CD9的表达率为59%，M 1 为0(0/2)，M 2 为17%(1/6)，M 4 为33%(1/3)，M 3 为86%(6/7)，M 5 为88%(7/8)，CML为67%(4/6)，CD9高表达于M 3 、M 5 及CML，对照组CD9表达率为5.5%，之间差异有显著性(P<0.01)。
3.3 53例白血病P170的表达 P170在NR(未缓解)或复发组的表达率为84%(16/19)，阳性细胞率为37.7±27.2%;CR(完全缓解)或PR(部分缓解)组为15%(5/34)，阳性细胞率为2.85±2.83%。两者之间表达差异有显著性(P<0.01)。对照组表达率为11%(2/18)，阳性细胞率为1.67±2.03%，与NR或复发组之间差异有非常显著性(P<0.01)，而与CR或PR组间差异无显著性(P>0.05)。
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3.4 白血病P170与CD9的表达之间无相关性(r=0.038，P>0.05)。
4 讨论
单抗在白血病免疫分型中的应用，不仅提高了白血病诊断准确率，还可了解白血病细胞的起源和分化阶段，为临床制定治疗策略和评估预后提供较为可靠的依据。但随着对白细胞分化抗原(CD)的深入研究，发现多数CD都缺乏严格的系列特异性。用于白血病免疫分型的单抗大多与不同细胞呈交叉反应，因此，发现和选择白血病细胞相关标志，联合使用多种单抗观察在白血病细胞上的反应，将会进一步提高白血病的诊断准确率及其特性的认识。
本文分析了18例ALL和3例B-CLL细胞CD9的表达，发现不同类型淋巴细胞白血病之间CD9的表达率存在差异，B-ALL的CD9表达较高，提示在淋巴细胞白血病分型中，应用CD9对鉴别诊断B-ALL和T-ALL具有参考意义。单抗的应用使ALL的分型取得了很大进展，但由于髓系相关抗原缺乏阶段特异性，至今未发现AML FAB各亚型 的特异性标志，因此AML免疫分型与FAB亚型之间的关系仍不十分明确。目前，只有少数几种抗原与AML亚型有相关性。本文结果表明M 3 、M 5 及CML细胞CD9表达高于M 1 、M 2 、M 4 ，两组之间表达率存在明显差异，与Ferrero等和De Rossi等报道相似，但还发现M 5 及CML的CD9表达率也很高，尚未见报道，是否与M 3 和M 5 之间形态分型易混淆有关，还是二者均系阳性表达，尚不能确定。AML-M 3 的临床治疗和预后不同于其它AML亚型，正确的分型诊断直接关系到选择合理的治疗方案，实验结果提示CD9对M 3 的鉴别诊断有较重要价值。形态学典型M 3 通常容易诊断，然而形态上难以确认的M 3 联合应用CD9抗原及其它免疫学标记，为临床诊断提供一个有用的依据。
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多药耐药(MDR)是白血病细胞对多种化疗药物产生耐药，导致白血病化疗失败的主要原因，是常规化疗难以使白血病获长期缓解的重要障碍。P170是MDR的表达产物，以往研究表明，白血病过度表达P170，是预后不良的原因之一。近来报道认为其耐药机制是P170作为细胞膜上的一个溢出泵，能将细胞内药物泵出细胞外，降低细胞内化疗药物浓度，进而免遭杀伤。过去认为P170高表达为获得性，是反复化疗的结果，但一些研究发现，许多患者初诊时即存在P170的高表达，提示MDR存在原发性。实验结果显示NR或复发组中存在P170高表达(83%)，而CR或PR组低表达(15%)，两组差异有非常显著性(P<0.01)，说明P170高表达可导致CR率明显下降，是预后不良因素之一。P170低表达者有2例未缓解，提示可能还有其它机制影响化疗效果 [3] 。本文结果提示CD9对M 3 及B-ALL白血病分型可作为一个鉴别诊断指标，检测P170对判断白血病预后，合理选择化疗方案具有一定指导价值。
参考文献
, 百拇医药
1 Nooter K，Sonneveld P.Clinical relevance of P-glycoprotein expression in hematologic malignancies.Leuk Res，1994，18:233-243.
2 陈为民，宋团月，伍延安，等.急性髓系白血病患者外周血CD34、Fas及P170的表达及其临床意义.中华血液学杂志，1999，8:437-438.
3 赵瑜，于力，楼方定，等.急性白病患者MRP、P26和P170表达与多药耐药关系的分析.中华血液学杂志，2000，1:40-41.
作者单位:524037广东省湛江市中心人民医院
(收稿日期:2004-03-22)
(编辑黄 杰), 百拇医药