高强度聚焦超声治疗前后恶性肿瘤患者外周血免疫功能的变化
基金项目:国家“九五”科技重点攻关资助项目(96-905-02-01)
【摘要】 目的 观察高强度聚集超声(HIFU)治疗前后恶性肿瘤病人外周血免疫功能的变化。方法 采用流式细胞技术，测定16例恶性肿瘤病人HIFU治疗前及治疗后1～2周外周血CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 、CD19 + 及CD(16 + +56 + )细胞数量的变化。自身配对t检验分析检测结果。结果 与治疗前比较，HIFU治疗后肿瘤病人外周血CD4 + 数(P=0.009)和CD4/CD8(P=0.012)明显增加;治疗后外周血CD3 + 数轻度增加，CD8 + 、CD19 + 和CD(16 + +56 + )数轻度下降，但与治疗前比较差异无显著性。结论 经HIFU治疗后，恶性肿瘤病人外周血细胞免疫功能明显增强。
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关键词 高强度聚焦超声 肿瘤 免疫 流式细胞术
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)12-1057-02
Changes of peripheral immune function in patients
with solid malignancies treated by high-intensity focused ultrasound
Lu Pei，Wu Feng，Xu Zhonglin，et al.
Clinical Center for Tumor Therapy of2 nd Affiliated Hospital，Institute of Ultrasonic
, 百拇医药
Engineering in Medicine，Chongqing University of Medical Science，Chongqing400010.
【Abstract】 Objective To observe the changes of peripheral immune function in patients with solid malignanˉcies treated by high-intensity focused ultrasound(HIFU).Methods Using flow cytometry technique，the percentˉage of CD3 + ，CD4 + ，CD8 + ，CD19 + ，CD(16 + +56 + )in peripheral blood was assessed in16patients with solid malignancies before and1～2week after HIFU treatment.Measurements were analyzed by Student t test.Results Peripheral CD4 + (P=0.009)and theratio of CD4/CD8(P=0.012)were significantly increased postoperatively.Slight elevation of CD3 + and slight diminish of CD8 + ，CD19 + ，CD(16 + +56 + )were detected after HIFU treatment But no statistical differences were found pre-and postoperatively(P>0.05).Conclusion Peripheral cellular imˉmune function could be significantly enhanced in patients with solid malignancies after HIFU treatment.
, 百拇医药
Key words high-intensity focused ultrasound neoplasm immune flow cytometry
高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)是近年来开始在临床应用的一种热凝固治疗实体肿瘤的方法。本研究从2001年9月～2002年3月观察了16例恶性肿瘤病人HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化，初步结果如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 病理学确诊的恶性肿瘤病人16例(男8例，女8例)，年龄9～74岁，平均40.75±20.9岁。其中，骨肉瘤6例，原发性肝癌5例，肾癌5例。
1.2 HIFU治疗情况 JC型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统由重庆海扶技术有限公司生产。治疗参数:频率0.8MHz，焦距135mm，焦域1.1mm×9.8mm×9.8mm，声强5000～20000W/cm 2 。治疗在全麻或硬膜外麻醉下进行，利用逐层适形扫描技术，根据治疗层面治疗前后声像图形态和组织回声变化，实时反馈控制治疗方案中预置的超声剂量，保证完全破坏靶区肿瘤组织。
, 百拇医药
1.3 研究方法
1.3.1 主要试剂及仪器 FACScalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司);Simultest IMK-Lymphocyte淋巴细胞 检测试剂盒(鼠源性直接荧光单抗，美国Becton Dickinson公司)。检测指标包括CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 、CD(16 + +56 + )、CD19 + 。
1.3.2 标本采取 病人入院当日及HIFU后1～2周，晨起自肘静脉抽取空腹血2ml，加入专用试管，即时送检。
1.3.3 操作程序 取100μl肝素抗凝全血加于试管底部，分别加入20μl荧光素标记的抗单克隆抗体，混匀，室温孵育30min，0.01MPBS缓冲液冲洗2遍，加红细胞溶解液2ml，充分混匀，10min后待红细胞完全溶解上流式细胞仪检测。激光波长488nm，计数10000个细胞，用Simulsetv3.0软件分析，以百分率报告。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用自身配对t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
恶性肿瘤病人HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化见表1。与治疗前比较，HIFU治疗后肿瘤病人外周血CD4 + 数(P=0.009)和CD4/CD8(P=0.012)明显增加;治疗后外周血CD3 + 数轻度增加，CD8 + 、CD19 + 和CD(16 + +56 + )数轻度下降，但与治疗前比较差异无显著性。详见表1。
表1 HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化
, 百拇医药
注:与治疗前比较， ˇ P<0.05;与治疗前比较， ˇˇ P<0.01
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫的主要承担者 [1] 。T细胞中的CD4 + 细胞为Th亚群，其表面的糖蛋白是Th识别抗原和活化所必需的分子，CD4 + 细胞数量减少，免疫反应降低。研究证实CD4 + 细胞、CD8 + 细胞亚群在抗肿瘤免疫反应中起重要作用，肿瘤病人在进行有效的免疫治疗后，CD4 + 细胞常大量激活，数量增多 [2，3] 。CD4/CD8比值是反映细胞免疫平衡与否的敏感指标，当免疫功能受到抑制时，CD4 + 细胞下降CD8 + 细胞上升，CD4/CD8比值减小 [4] 。肿瘤发生、发展常导致CD4/CD8比值降低，得到有效治疗后CD4/CD8比值可升高，一旦肿瘤复发，CD4/CD8比值会再度下降，因而该比值可用于评估肿瘤病人免疫功能变化。
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本研究发现，HIFU治疗后外周血CD4 + 细胞数量增多，提示免疫网络中Th细胞活性增强，HIFU治疗具有改善病人细胞免疫功能的作用。类似的研究认为，HIFU治疗中瞬时灭活、固化的肿瘤组织，可能具有刺激机体抗肿瘤免疫的能力 [5] 。同时，HIFU治疗后肿瘤病人CD4/CD8较治疗前显著增高，说明HIFU治疗后肿瘤病人全身免疫功能发生了变化，自体细胞免疫调节网络出现增强优势，使机体免疫处于正向调节状态。
大手术可造成免疫功能紊乱，导致暂时性免疫抑制 [6] 。化疗和放疗杀伤恶性肿瘤细胞时，均抑制以淋巴细胞为轴心的机体免疫 [7] ，致淋巴细胞数量减少和功能低下。上述治疗方法在治疗后的早期，可能加重病人原有的免疫缺陷，使肿瘤复发和转移的机率增加。而HIFU治疗后早期病人细胞免疫功能免疫得到明显改善，提示该治疗手段具有不同于肿瘤常规治疗方式的优点。
机体免疫功能的改善需要自身的调节才能实现，治疗 前病人的肿瘤类型、肿瘤分级和免疫抑制程度对治疗后免疫功能恢复有较大的影响。尽管本研究初步观察到肿瘤病人HIFU治疗后CD4 + 细胞比例增高，CD4/CD8比值升高，但本研究观察的时间尚短，观察的肿瘤类型和病人的数量有限。应在今后的研究中进一步扩大病种和数量，多时间点动态观察，才能有利于得出更全面、可靠的结论。
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参考文献
1 Lotze MT，Finn OJ.Recent advances in cellular immunology:implicaˉtions for immunity to cancer.Immunol Today，1990，11(6):190.
2 Hernberg M.Lymphocyte subsets as prognostic markers for cancer paˉtients receiving immunomodulative therapy.Med Oncol，1999，16(3):145-153.
3 Li Q，Furman SA，Bradford CR，et al.Expanded tumor-reactive CD4 + T-cell response to human cancers induced by secondary anti-CD3/anti-CD28activation.Clin Cancer Res，1999，5(2):461-469.
, 百拇医药
4 Muhonen T，Marjo HK，Pakkala S，et al.Decreasing CD4/CD8ration during prolonged four-drug chemotherapy plus intrefrain treatment for metastatic melanoma.J Immunother，1994，15(1):67-73.
5 Van leenders GJ，Beerlage HP，Ruijter ET，et al.Histopathological changes associated with high intensity focused ultrasoud(HIFU)treatˉment for localisedadenocarcinoma of the prostates.J Clin Pathol，2000，53(5):391-394.
6 Jablonska E，Kozlowski M，Pietruska Z，et al.Soluble interleukin-2receptorin serum of patients with esophageal carcinoma.Neoplasm，1994，41:315-316.
, http://www.100md.com
7 Soygur T，Beduk Y，Baltaci S，et al.The prognostic value of peripherˉal blood lymphocyte subsets in patients with bladder carcinoma treated using neoadjuvant M-VEC chemotherapy.BJU Int，1999，84:1069-1072.
作者单位:400010重庆医科大学第二临床医院肿瘤治疗中心，医学超声工程研究所
(现通信地址:郑州大学第一附属医院肿瘤科)
(收稿日期:2004-03-09)
(编辑使 臻), 百拇医药
【摘要】 目的 观察高强度聚集超声(HIFU)治疗前后恶性肿瘤病人外周血免疫功能的变化。方法 采用流式细胞技术，测定16例恶性肿瘤病人HIFU治疗前及治疗后1～2周外周血CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 、CD19 + 及CD(16 + +56 + )细胞数量的变化。自身配对t检验分析检测结果。结果 与治疗前比较，HIFU治疗后肿瘤病人外周血CD4 + 数(P=0.009)和CD4/CD8(P=0.012)明显增加;治疗后外周血CD3 + 数轻度增加，CD8 + 、CD19 + 和CD(16 + +56 + )数轻度下降，但与治疗前比较差异无显著性。结论 经HIFU治疗后，恶性肿瘤病人外周血细胞免疫功能明显增强。
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关键词 高强度聚焦超声 肿瘤 免疫 流式细胞术
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)12-1057-02
Changes of peripheral immune function in patients
with solid malignancies treated by high-intensity focused ultrasound
Lu Pei，Wu Feng，Xu Zhonglin，et al.
Clinical Center for Tumor Therapy of2 nd Affiliated Hospital，Institute of Ultrasonic
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Engineering in Medicine，Chongqing University of Medical Science，Chongqing400010.
【Abstract】 Objective To observe the changes of peripheral immune function in patients with solid malignanˉcies treated by high-intensity focused ultrasound(HIFU).Methods Using flow cytometry technique，the percentˉage of CD3 + ，CD4 + ，CD8 + ，CD19 + ，CD(16 + +56 + )in peripheral blood was assessed in16patients with solid malignancies before and1～2week after HIFU treatment.Measurements were analyzed by Student t test.Results Peripheral CD4 + (P=0.009)and theratio of CD4/CD8(P=0.012)were significantly increased postoperatively.Slight elevation of CD3 + and slight diminish of CD8 + ，CD19 + ，CD(16 + +56 + )were detected after HIFU treatment But no statistical differences were found pre-and postoperatively(P>0.05).Conclusion Peripheral cellular imˉmune function could be significantly enhanced in patients with solid malignancies after HIFU treatment.
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Key words high-intensity focused ultrasound neoplasm immune flow cytometry
高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)是近年来开始在临床应用的一种热凝固治疗实体肿瘤的方法。本研究从2001年9月～2002年3月观察了16例恶性肿瘤病人HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化，初步结果如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 病理学确诊的恶性肿瘤病人16例(男8例，女8例)，年龄9～74岁，平均40.75±20.9岁。其中，骨肉瘤6例，原发性肝癌5例，肾癌5例。
1.2 HIFU治疗情况 JC型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统由重庆海扶技术有限公司生产。治疗参数:频率0.8MHz，焦距135mm，焦域1.1mm×9.8mm×9.8mm，声强5000～20000W/cm 2 。治疗在全麻或硬膜外麻醉下进行，利用逐层适形扫描技术，根据治疗层面治疗前后声像图形态和组织回声变化，实时反馈控制治疗方案中预置的超声剂量，保证完全破坏靶区肿瘤组织。
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1.3 研究方法
1.3.1 主要试剂及仪器 FACScalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司);Simultest IMK-Lymphocyte淋巴细胞 检测试剂盒(鼠源性直接荧光单抗，美国Becton Dickinson公司)。检测指标包括CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 、CD(16 + +56 + )、CD19 + 。
1.3.2 标本采取 病人入院当日及HIFU后1～2周，晨起自肘静脉抽取空腹血2ml，加入专用试管，即时送检。
1.3.3 操作程序 取100μl肝素抗凝全血加于试管底部，分别加入20μl荧光素标记的抗单克隆抗体，混匀，室温孵育30min，0.01MPBS缓冲液冲洗2遍，加红细胞溶解液2ml，充分混匀，10min后待红细胞完全溶解上流式细胞仪检测。激光波长488nm，计数10000个细胞，用Simulsetv3.0软件分析，以百分率报告。
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1.4 统计学方法 采用自身配对t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
恶性肿瘤病人HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化见表1。与治疗前比较，HIFU治疗后肿瘤病人外周血CD4 + 数(P=0.009)和CD4/CD8(P=0.012)明显增加;治疗后外周血CD3 + 数轻度增加，CD8 + 、CD19 + 和CD(16 + +56 + )数轻度下降，但与治疗前比较差异无显著性。详见表1。
表1 HIFU治疗前后外周血免疫功能的变化
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注:与治疗前比较， ˇ P<0.05;与治疗前比较， ˇˇ P<0.01
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫的主要承担者 [1] 。T细胞中的CD4 + 细胞为Th亚群，其表面的糖蛋白是Th识别抗原和活化所必需的分子，CD4 + 细胞数量减少，免疫反应降低。研究证实CD4 + 细胞、CD8 + 细胞亚群在抗肿瘤免疫反应中起重要作用，肿瘤病人在进行有效的免疫治疗后，CD4 + 细胞常大量激活，数量增多 [2，3] 。CD4/CD8比值是反映细胞免疫平衡与否的敏感指标，当免疫功能受到抑制时，CD4 + 细胞下降CD8 + 细胞上升，CD4/CD8比值减小 [4] 。肿瘤发生、发展常导致CD4/CD8比值降低，得到有效治疗后CD4/CD8比值可升高，一旦肿瘤复发，CD4/CD8比值会再度下降，因而该比值可用于评估肿瘤病人免疫功能变化。
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本研究发现，HIFU治疗后外周血CD4 + 细胞数量增多，提示免疫网络中Th细胞活性增强，HIFU治疗具有改善病人细胞免疫功能的作用。类似的研究认为，HIFU治疗中瞬时灭活、固化的肿瘤组织，可能具有刺激机体抗肿瘤免疫的能力 [5] 。同时，HIFU治疗后肿瘤病人CD4/CD8较治疗前显著增高，说明HIFU治疗后肿瘤病人全身免疫功能发生了变化，自体细胞免疫调节网络出现增强优势，使机体免疫处于正向调节状态。
大手术可造成免疫功能紊乱，导致暂时性免疫抑制 [6] 。化疗和放疗杀伤恶性肿瘤细胞时，均抑制以淋巴细胞为轴心的机体免疫 [7] ，致淋巴细胞数量减少和功能低下。上述治疗方法在治疗后的早期，可能加重病人原有的免疫缺陷，使肿瘤复发和转移的机率增加。而HIFU治疗后早期病人细胞免疫功能免疫得到明显改善，提示该治疗手段具有不同于肿瘤常规治疗方式的优点。
机体免疫功能的改善需要自身的调节才能实现，治疗 前病人的肿瘤类型、肿瘤分级和免疫抑制程度对治疗后免疫功能恢复有较大的影响。尽管本研究初步观察到肿瘤病人HIFU治疗后CD4 + 细胞比例增高，CD4/CD8比值升高，但本研究观察的时间尚短，观察的肿瘤类型和病人的数量有限。应在今后的研究中进一步扩大病种和数量，多时间点动态观察，才能有利于得出更全面、可靠的结论。
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参考文献
1 Lotze MT，Finn OJ.Recent advances in cellular immunology:implicaˉtions for immunity to cancer.Immunol Today，1990，11(6):190.
2 Hernberg M.Lymphocyte subsets as prognostic markers for cancer paˉtients receiving immunomodulative therapy.Med Oncol，1999，16(3):145-153.
3 Li Q，Furman SA，Bradford CR，et al.Expanded tumor-reactive CD4 + T-cell response to human cancers induced by secondary anti-CD3/anti-CD28activation.Clin Cancer Res，1999，5(2):461-469.
, 百拇医药
4 Muhonen T，Marjo HK，Pakkala S，et al.Decreasing CD4/CD8ration during prolonged four-drug chemotherapy plus intrefrain treatment for metastatic melanoma.J Immunother，1994，15(1):67-73.
5 Van leenders GJ，Beerlage HP，Ruijter ET，et al.Histopathological changes associated with high intensity focused ultrasoud(HIFU)treatˉment for localisedadenocarcinoma of the prostates.J Clin Pathol，2000，53(5):391-394.
6 Jablonska E，Kozlowski M，Pietruska Z，et al.Soluble interleukin-2receptorin serum of patients with esophageal carcinoma.Neoplasm，1994，41:315-316.
, http://www.100md.com
7 Soygur T，Beduk Y，Baltaci S，et al.The prognostic value of peripherˉal blood lymphocyte subsets in patients with bladder carcinoma treated using neoadjuvant M-VEC chemotherapy.BJU Int，1999，84:1069-1072.
作者单位:400010重庆医科大学第二临床医院肿瘤治疗中心，医学超声工程研究所
(现通信地址:郑州大学第一附属医院肿瘤科)
(收稿日期:2004-03-09)
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