医院感染生物被膜铜绿假单胞菌β-内酰胺酶活性检测
【摘要】 目的 检测生物被膜铜绿假单胞菌(PA)产β-内酰胺酶的活性，为临床治疗其引起的院内感染提供参考依据。方法 用平板法培养细菌生物被膜，银染色法快速鉴定。检测浮游PA(A组)、生物被膜PA(B组)及亚胺培南(C组)和头孢西丁(D组)诱导后生物被膜PA产β-内酰胺酶的活性。结果 B、C、D组均有明显的生物被膜形成，其β-内酰胺酶活性[(11.38±3.58)U/ml、(15.76±4.71)U/ml、(14.86±4.19)U/ml]与A组[(0.577±0.159)U/ml]比较差异有非常显著性(F=63.193，P<0.01)。经亚胺培南和头孢西丁诱导后生物被膜PA产β-内酰胺酶活性(C组和D组)与B组比较差异有显著性(q=4.903，3.968，P<0.05)。结论 生物被膜下PA高产β-内酰胺酶，合理用药减少PA生物被膜(BF)形成是预防医院感染(HI)的有效措施。
关键词 医院感染 细菌生物被膜 铜绿假单胞菌 β-内酰胺酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)12-1103-02
, http://www.100md.com
A study onβ-lactamase activity of biofilm pseudomonas aeruginosa
Wang Baohua，Li Hao
Department of Clinical Laboratory，Runan Second People’s Hospital，463300.
【Abstract】 Objective To detectβ-lactamase activity of biofilm pseudomonasaeruginosa(PA)so as to proˉvide a theoretical basis for treatment of bacterial biofilm.Methods Modified plate culture method was used to estabˉlish in vitro bacterial biofilm model，which was identified by silver nitrate staining.Theβ-lactamase activities were quantitated in PA(group A)、biofilm PA(group B)、biofilm PA induced by impenem(group C)or cefoxitin(group D).Results There were biofilm in group B，C，D.Theβ-lactamase activity of group B[(11.38±3.58)U/ml]，group C [(15.76±4.71)U/ml]，group D[(14.86±4.19)U/ml]were significantly higher compared with group A[(0.577±0.159)U/ml](F=63.193，P<0.01).Theβ-lactamase activities of group C，D were significantly higher compared with group B.Conclusion The drug resistance to antibiotics of biofilm PA is related to the production ofβ-lactaˉmase，inhibiting the adherence of mucoid PA maybe a good method to prevent hospital infection.
, 百拇医药
Key words hospital infection pseudomonas aeruginosa bacterial biofilm β-lactamase
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是引起医院感染(hospital infection，HI)重要病原菌，引起医院感染发生率为14.69% [1] ，也是慢性呼吸道感染性疾病反复急性发作和死亡率增高的一个重要原因，其难治性往往与生物被膜形成有关 [2] ，本试验检测PA及生物被膜下PA产β-内酰胺酶的活性，为临床治疗PA引起的感染提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 抗菌药物 亚胺培南、头孢西丁(美国默沙东公司)。
, http://www.100md.com
1.1.2 菌株 临床分离的产β-内酰胺酶PA17株(本院检验科微生物室提供)，形态上菌落肥大，湿润，呈水滴样，边缘不整齐，相互融合，色素分泌不明显(按1999年美国临床实验室标准化委员会推荐的纸片初筛法进行)。质控菌株ATCC27853。
1.1.3 培养基 MH肉汤培养基(华美生物有限公司)，胰酶大豆肉汤(TSB，法国Biomerieux公司产品)，Nitrocefin(英国Oxiod公司)
1.1.4 试剂 硝酸银、对苯二酚(北京化学试剂公司)。
1.1.5 器材 医用硅胶膜(北京医用硅胶研究所)，超声震荡清洗机(北京医疗仪器厂)，酶标仪(BIORAD，3550型)。
1.2 方法
1.2.1 抗菌药物MIC测定 微量稀释法 [3] 测定亚胺培南及头孢西丁对PA的最低抑菌浓度(MIC)，其MIC值分别介于(0.10～0.64)mg/L和(0.25～7.25)mg/L。
, 百拇医药
1.2.2 细菌生物被膜培养 用平板法 [4] 培养细菌生物被膜。取17株PA经37℃孵育24h，比浊仪调至0.5麦氏，将每株菌菌悬液4等份分为4组，吸取50μl加入含有2ml TSB的培养板中，A组为浮游PA组，B、C、D组放有硅胶膜，37℃培养5天。
1.2.3 诱导β-内酰胺酶产生 将1/2MIC亚胺培南和1/2头孢西丁分别加入C组和D组菌悬液中孵育，诱导其产生β-内酰胺酶。
1.2.4 β-内酰胺酶粗酶提取液的制备 A、B、C、D4组菌孵育至第五天，将PA硅胶膜及胰酶大豆肉汤在超声水浴震荡(120W，15min)，将细菌从硅胶膜片上脱下，用戊二醛固定，硝酸银染色，对苯二酚显色—银染色 [5] 快速鉴定，显微镜观察生物被膜。提取的菌悬液于4℃6000r/min离心30min，弃去上清液，以0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次后，将收获的菌体悬液浮在同样适量的缓冲液中，用冻融法 [6] 使菌体破坏，然后以低温2000r/min离心60min，上清液即为粗酶提取液。
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1.2.5 β-内酰胺酶活性测定 用Nitrocefin纸片定性测定。以Nitrocefin为底物，在紫外分光光度计波长482nm处进行时间扫描测定酶活性，粗酶提取液为0.1ml，在Nitroˉcefin中加入酶后每隔1min记录吸光度(A)值变化，按公式酶活性=(A/1.95)×0.3V计算(A为482nm处的A值，V为将酶体积换算到1ml)。
1.2.6 统计学方法 数据用ˉx±s表示，组间比较用F检验和q检验。
2 结果
2.1 银染色法鉴定细菌生物被膜 B、C、D组硅胶膜上可见整个视野被浓厚的黑染BF覆盖，层次多，致密，稀薄处可见杆状细菌。
2.2 β-内酰胺酶活性 17株的β-内酰胺酶定性为阳性。A、B、C、D组活性分别为(0.577±0.159)U/ml、(11.38±3.58)U/ml、(15.76±4.71)U/ml、(14.86±4.19)U/ml，与A组比较差异有非常显著性(F=63.193，P<0.01)。C、D组β-内酰胺酶与B组比较差异有显著性(q=4.903，3.968，P<0.05)。见表1、表2。
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表1 各组β-内酰胺酶活性比较
3 讨论
铜绿假单胞菌在医院环境中广泛分布，常见于医务人员的手、医疗器械、病室空气中，特别是吸氧器、气管插管、呼吸机活瓣与管道。1994～2001年全国32家医院ICU病房分离的革兰阴性菌中，PA占首位(46.9%) [7] ，也是院内获得性，特别是呼吸机相关性肺炎的首位病因 [8] 。PA常粘附于生物医学材料或腔道表面，分泌多糖蛋白复合物，并将自己克隆包裹起来，形成生物被膜 [9] ，本试验也显示了在B、C、D组均有生物被膜的形成。生物被膜有特殊的生理、生化特性，使被膜下的细菌生长缓慢，代谢率降低;被膜下的细菌产生的多种蛋白复合物，一方面吸附一部分抗生素，另一方面吸附于生物被膜的抗菌药物灭活酶如β-内酰胺 酶，灭活一部分抗生素，使直接接触细菌的抗生素大大减少 [10] ，且生物被膜形成后会造成细菌表面抗原位点覆盖，细菌间耐药基因的横向传递频率增高和抗生素不易穿入等后果。由于抗生素不易与细菌直接接触，减低了抗生素的渗透性，从而有利于细菌启动β-内酰胺酶的表达及诱发耐药突变 [11] ，而产生耐药。本试验表明生物被膜下PA产β-内酰胺酶量比浮游PA显著增高(P<0.01);经亚胺培南和头孢西丁诱导后生物被膜PA产β-内酰胺酶量与生物被膜PA比较差异有显著性(P<0.05)，进一步提示PA高产β-内酰胺酶与BF形成密切相关。
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PA为一条件致病菌，本身致病能力较弱，免疫功能正常的宿主很容易将它清除，故往往在宿主免疫功能低下时致病。生物材料可为细菌的附着提供条件，使细菌易于形成BF。BF本身可抑制和阻止机体的免疫反应，产生免疫逃逸，并导致抗原-抗体复合物沉积，引起变态反应，使细菌对机体的损害进一步加重 [12] ，生物被膜形成后，细菌群体共享一个三维空间，且PA对多种药物固有耐药，可供临床选用的药物较少 [13] ，致使院内感染PA患者迁延不愈。因此，经常监测本地区、本单位PA的耐药趋势，选用高度敏感的抗生素，避免细菌长期、反复接触亚抑菌浓度抗生素是治疗PA感染成败的关键，同时应重视支持治疗和重建免疫机制，尽量减少并发症的发生。
参考文献
1 李家泰，Allan Weinstein，杨敏.中国细菌耐药监测研究.中华医学杂志，2001，81:8-15.
2 李彤，庄辉.细菌生物被膜的研究进展.中华微生物和免疫学杂志，2002，22(5):343-346.
, http://www.100md.com
3 戴自英.临床抗菌药物学.北京:人民卫生出版社，1985，7-9.
4 Ashby MJ，Neale JE，Knott，et al.Effect of antibiotics on non-growing planktonic cells and biofilm of Escherichia Coli.J Antimicrobial Chemotherapy，1994，33:443-452.
5 Passariello C，Berlutti F，Selan L，et al.A rapid staining proceduce to demonstrate glycocalyx production and bacterial biofilms.Microbiologiˉca，1994，17:225-230.
6 Giwercman B，Jensen ET，Hoiby N，et al.Induction of beta-lactamase production in pseudomonas aerugionsa biofilm.Antimicrob Agents Chemother，1991，35:1008-1010.
, 百拇医药
7 王辉，陈民均.1994～2001年中国危重监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁.中华医学杂志，2003，83(5):385-390.
8 Jarvis WR，Martone WJ.Predominant pathogens in hospital infections.J Antimicrob Chemother，1992，29(supplA):19-24.
9 Costerton JW，Lewandowski Z，Caldwell DE，et al.Microbial biofilms.Annu Rev Miorbiol，1995，49:711-745.
10 方向群，刘又宁.细菌生物被膜与难治性感染性疾病.中华结核和呼吸杂志，1999，22:186-187.
11 何国钧，王丽.绿脓杆菌肺炎的治疗.中华结核和呼吸杂志，1998，21:522-523.
, http://www.100md.com
12 小林宏行.细菌生物被膜的基础与临床.中国临床药理学杂志，1999，15:299-307.
13 CornagliaG，Mazzariol A，Lauretti L，et al.Hospital outbreak of carˉbapenem-resistant pseudomodas aeruginosa producing VIM-1，a novel transferable metallo-bata-lactamase，Clin Infect Dis，2000，31:1119-1125.
作者单位:463300河南省汝南县第二人民医院检验科
463300河南省汝南县人民医院检验科
(编辑海 涛), 百拇医药
关键词 医院感染 细菌生物被膜 铜绿假单胞菌 β-内酰胺酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)12-1103-02
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A study onβ-lactamase activity of biofilm pseudomonas aeruginosa
Wang Baohua，Li Hao
Department of Clinical Laboratory，Runan Second People’s Hospital，463300.
【Abstract】 Objective To detectβ-lactamase activity of biofilm pseudomonasaeruginosa(PA)so as to proˉvide a theoretical basis for treatment of bacterial biofilm.Methods Modified plate culture method was used to estabˉlish in vitro bacterial biofilm model，which was identified by silver nitrate staining.Theβ-lactamase activities were quantitated in PA(group A)、biofilm PA(group B)、biofilm PA induced by impenem(group C)or cefoxitin(group D).Results There were biofilm in group B，C，D.Theβ-lactamase activity of group B[(11.38±3.58)U/ml]，group C [(15.76±4.71)U/ml]，group D[(14.86±4.19)U/ml]were significantly higher compared with group A[(0.577±0.159)U/ml](F=63.193，P<0.01).Theβ-lactamase activities of group C，D were significantly higher compared with group B.Conclusion The drug resistance to antibiotics of biofilm PA is related to the production ofβ-lactaˉmase，inhibiting the adherence of mucoid PA maybe a good method to prevent hospital infection.
, 百拇医药
Key words hospital infection pseudomonas aeruginosa bacterial biofilm β-lactamase
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是引起医院感染(hospital infection，HI)重要病原菌，引起医院感染发生率为14.69% [1] ，也是慢性呼吸道感染性疾病反复急性发作和死亡率增高的一个重要原因，其难治性往往与生物被膜形成有关 [2] ，本试验检测PA及生物被膜下PA产β-内酰胺酶的活性，为临床治疗PA引起的感染提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 抗菌药物 亚胺培南、头孢西丁(美国默沙东公司)。
, http://www.100md.com
1.1.2 菌株 临床分离的产β-内酰胺酶PA17株(本院检验科微生物室提供)，形态上菌落肥大，湿润，呈水滴样，边缘不整齐，相互融合，色素分泌不明显(按1999年美国临床实验室标准化委员会推荐的纸片初筛法进行)。质控菌株ATCC27853。
1.1.3 培养基 MH肉汤培养基(华美生物有限公司)，胰酶大豆肉汤(TSB，法国Biomerieux公司产品)，Nitrocefin(英国Oxiod公司)
1.1.4 试剂 硝酸银、对苯二酚(北京化学试剂公司)。
1.1.5 器材 医用硅胶膜(北京医用硅胶研究所)，超声震荡清洗机(北京医疗仪器厂)，酶标仪(BIORAD，3550型)。
1.2 方法
1.2.1 抗菌药物MIC测定 微量稀释法 [3] 测定亚胺培南及头孢西丁对PA的最低抑菌浓度(MIC)，其MIC值分别介于(0.10～0.64)mg/L和(0.25～7.25)mg/L。
, 百拇医药
1.2.2 细菌生物被膜培养 用平板法 [4] 培养细菌生物被膜。取17株PA经37℃孵育24h，比浊仪调至0.5麦氏，将每株菌菌悬液4等份分为4组，吸取50μl加入含有2ml TSB的培养板中，A组为浮游PA组，B、C、D组放有硅胶膜，37℃培养5天。
1.2.3 诱导β-内酰胺酶产生 将1/2MIC亚胺培南和1/2头孢西丁分别加入C组和D组菌悬液中孵育，诱导其产生β-内酰胺酶。
1.2.4 β-内酰胺酶粗酶提取液的制备 A、B、C、D4组菌孵育至第五天，将PA硅胶膜及胰酶大豆肉汤在超声水浴震荡(120W，15min)，将细菌从硅胶膜片上脱下，用戊二醛固定，硝酸银染色，对苯二酚显色—银染色 [5] 快速鉴定，显微镜观察生物被膜。提取的菌悬液于4℃6000r/min离心30min，弃去上清液，以0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次后，将收获的菌体悬液浮在同样适量的缓冲液中，用冻融法 [6] 使菌体破坏，然后以低温2000r/min离心60min，上清液即为粗酶提取液。
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1.2.5 β-内酰胺酶活性测定 用Nitrocefin纸片定性测定。以Nitrocefin为底物，在紫外分光光度计波长482nm处进行时间扫描测定酶活性，粗酶提取液为0.1ml，在Nitroˉcefin中加入酶后每隔1min记录吸光度(A)值变化，按公式酶活性=(A/1.95)×0.3V计算(A为482nm处的A值，V为将酶体积换算到1ml)。
1.2.6 统计学方法 数据用ˉx±s表示，组间比较用F检验和q检验。
2 结果
2.1 银染色法鉴定细菌生物被膜 B、C、D组硅胶膜上可见整个视野被浓厚的黑染BF覆盖，层次多，致密，稀薄处可见杆状细菌。
2.2 β-内酰胺酶活性 17株的β-内酰胺酶定性为阳性。A、B、C、D组活性分别为(0.577±0.159)U/ml、(11.38±3.58)U/ml、(15.76±4.71)U/ml、(14.86±4.19)U/ml，与A组比较差异有非常显著性(F=63.193，P<0.01)。C、D组β-内酰胺酶与B组比较差异有显著性(q=4.903，3.968，P<0.05)。见表1、表2。
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表1 各组β-内酰胺酶活性比较
3 讨论
铜绿假单胞菌在医院环境中广泛分布，常见于医务人员的手、医疗器械、病室空气中，特别是吸氧器、气管插管、呼吸机活瓣与管道。1994～2001年全国32家医院ICU病房分离的革兰阴性菌中，PA占首位(46.9%) [7] ，也是院内获得性，特别是呼吸机相关性肺炎的首位病因 [8] 。PA常粘附于生物医学材料或腔道表面，分泌多糖蛋白复合物，并将自己克隆包裹起来，形成生物被膜 [9] ，本试验也显示了在B、C、D组均有生物被膜的形成。生物被膜有特殊的生理、生化特性，使被膜下的细菌生长缓慢，代谢率降低;被膜下的细菌产生的多种蛋白复合物，一方面吸附一部分抗生素，另一方面吸附于生物被膜的抗菌药物灭活酶如β-内酰胺 酶，灭活一部分抗生素，使直接接触细菌的抗生素大大减少 [10] ，且生物被膜形成后会造成细菌表面抗原位点覆盖，细菌间耐药基因的横向传递频率增高和抗生素不易穿入等后果。由于抗生素不易与细菌直接接触，减低了抗生素的渗透性，从而有利于细菌启动β-内酰胺酶的表达及诱发耐药突变 [11] ，而产生耐药。本试验表明生物被膜下PA产β-内酰胺酶量比浮游PA显著增高(P<0.01);经亚胺培南和头孢西丁诱导后生物被膜PA产β-内酰胺酶量与生物被膜PA比较差异有显著性(P<0.05)，进一步提示PA高产β-内酰胺酶与BF形成密切相关。
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PA为一条件致病菌，本身致病能力较弱，免疫功能正常的宿主很容易将它清除，故往往在宿主免疫功能低下时致病。生物材料可为细菌的附着提供条件，使细菌易于形成BF。BF本身可抑制和阻止机体的免疫反应，产生免疫逃逸，并导致抗原-抗体复合物沉积，引起变态反应，使细菌对机体的损害进一步加重 [12] ，生物被膜形成后，细菌群体共享一个三维空间，且PA对多种药物固有耐药，可供临床选用的药物较少 [13] ，致使院内感染PA患者迁延不愈。因此，经常监测本地区、本单位PA的耐药趋势，选用高度敏感的抗生素，避免细菌长期、反复接触亚抑菌浓度抗生素是治疗PA感染成败的关键，同时应重视支持治疗和重建免疫机制，尽量减少并发症的发生。
参考文献
1 李家泰，Allan Weinstein，杨敏.中国细菌耐药监测研究.中华医学杂志，2001，81:8-15.
2 李彤，庄辉.细菌生物被膜的研究进展.中华微生物和免疫学杂志，2002，22(5):343-346.
, http://www.100md.com
3 戴自英.临床抗菌药物学.北京:人民卫生出版社，1985，7-9.
4 Ashby MJ，Neale JE，Knott，et al.Effect of antibiotics on non-growing planktonic cells and biofilm of Escherichia Coli.J Antimicrobial Chemotherapy，1994，33:443-452.
5 Passariello C，Berlutti F，Selan L，et al.A rapid staining proceduce to demonstrate glycocalyx production and bacterial biofilms.Microbiologiˉca，1994，17:225-230.
6 Giwercman B，Jensen ET，Hoiby N，et al.Induction of beta-lactamase production in pseudomonas aerugionsa biofilm.Antimicrob Agents Chemother，1991，35:1008-1010.
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7 王辉，陈民均.1994～2001年中国危重监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁.中华医学杂志，2003，83(5):385-390.
8 Jarvis WR，Martone WJ.Predominant pathogens in hospital infections.J Antimicrob Chemother，1992，29(supplA):19-24.
9 Costerton JW，Lewandowski Z，Caldwell DE，et al.Microbial biofilms.Annu Rev Miorbiol，1995，49:711-745.
10 方向群，刘又宁.细菌生物被膜与难治性感染性疾病.中华结核和呼吸杂志，1999，22:186-187.
11 何国钧，王丽.绿脓杆菌肺炎的治疗.中华结核和呼吸杂志，1998，21:522-523.
, http://www.100md.com
12 小林宏行.细菌生物被膜的基础与临床.中国临床药理学杂志，1999，15:299-307.
13 CornagliaG，Mazzariol A，Lauretti L，et al.Hospital outbreak of carˉbapenem-resistant pseudomodas aeruginosa producing VIM-1，a novel transferable metallo-bata-lactamase，Clin Infect Dis，2000，31:1119-1125.
作者单位:463300河南省汝南县第二人民医院检验科
463300河南省汝南县人民医院检验科
(编辑海 涛), 百拇医药