中华眼镜蛇毒活性组分FP7抑制内皮细胞生长的选择性 ˇ
http://www.100md.com
ˇ 基金项目:广东省自然科学基金项目980463、卫生部科技基金项目98-2-349共同资助
【摘要】 目的 观察中华眼镜蛇毒活性组分FP7(Naja naja Atra venom active factor P7，FP7)抑制内皮细胞生长的选择性特点。方法 采用倒置显微镜、酶标仪分析不同浓度FP7作用下人脐静脉内皮细胞系ECV304、SD大鼠平滑肌细胞(SMC)、人胚肺成纤维细胞(HLF)以及人支气管上皮细胞(HBE)生长增殖的变化。结果 FP7抑制内皮细胞生长具有一定的选择性，作用24h后，抑制ECV304生长的作用明显高于其它三种细胞(P<0.05)。结论 本研究首次证实FP7抑制内皮细胞的生长增殖明显优于对构成血管的其它细胞的抑制作用，具有一定的选择性，这在抗血管生成的靶向治疗中有重要的意义。
关键词 眼镜蛇毒 内皮细胞 血管生成 选择性 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)07-0580-04
, http://www.100md.com
Selectivity of anti-endothelial cells proliferation of Naja naja Atra venom active factor P7
Liu Xinyan，Yu Qingshen，Yu Hong’e，et al.
Guangzhou Snake Venom Institute，Guangdong510182.
【Abstract】 Objective To investigate selectivity of inhibition of endothelail cells after Naja naja Atra venom active factor P7(FP7)，an element from Naja naja Atra venom，treatment in vitro. Methods An effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)cellline ECV 304，SD rats smooth muscle cells(SMC)，human embryonic lung fibroblast(HLF)and human bronchial epithelium cells(HBE)proliferation were observed with invert microscope，enzyme symbolize meter after FP7 treatment at different concentrations. Results FP7 could inhibit growth and proliferation of ECV304，which had selectivity，after interaction of FP7 and cells，anti-proliferation of ECV304significant powerful than other cells. Conclusion FP7 can selectively inhibit the growth and proliferation of endothelial cells，which might be important to target therapy of anti-angiogenesis.
, 百拇医药
Key words Naja naja Atra venom endothelial cells angiogenesis selectivity neoplasms
目前，肿瘤的治疗主要是化疗、放疗和手术，化疗又是肿瘤治疗的主要手段之一，约有10%的癌症可以用药物治愈或部分治愈，一些肿瘤晚期或转移癌以及白血病等也主要依赖化疗解决，因此，寻找根治肿瘤的关键在于发现新药和新的治疗方法。大部分的化疗药物的靶点都是肿瘤细胞，对肿瘤细胞起到杀伤作用的同时，使正常组织也受到较强的损害，而且肿瘤细胞基因的不稳定性、异质性和高突变率等都使得肿瘤极易产生耐药性，另一方面，有研究[1]指出肿瘤的生长是血管生成(angiogenesis)依赖性的，抑制血管生成可以达到治疗肿瘤的目的，血管内皮细胞参与了血管生成的多步骤过程，以血管内皮细胞为靶点的肿瘤开始浮出水面，这种治疗方法有许多优点比如比肿瘤细胞容易逆转、基因稳定等，现已成为寻找抗癌药的重要方向之一。我们从中华眼镜蛇(Naja naja Atra)毒原毒中提取并筛选出一种活性组分P7(Naja naja Atra Factor P7，以下简称FP7)，经初步实验已经证实其具有抑制内皮细胞生长的活性，本实验选取人脐静脉内皮细胞系ECV304、SD大鼠平滑肌细胞(SMC)、人胚肺成纤维细胞HLF以及人支气管上皮细胞HBE，采用MTT的方法着重探讨FP7在体外影响内皮细胞生长是否具有特异的选择性，为FP7应用于血管生成的治疗提供科学的实验基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞培养
1.1.1 SD大鼠平滑肌细胞(smooth muscle cells，smc)的原代及传代培养SD大鼠(广州医学院实验动物中心提供)2只，雄性，重150～200g，颈椎脱臼致死。腹部向上固定于平板上，心脏对应位置向上扩大至下颌，向下扩大至上腹碘酊消毒3遍，打开胸腔，无菌条件下迅速取出胸主动脉，置于盛有D-hanks缓冲液(含青、链霉素)的10mm培养皿中，排净管腔内残留血液，剥去血管外层纤维脂肪膜，剪开血管，弯镊轻轻刮去内皮层，眼科剪将其剪成约1mm3左右大小，均匀贴于培养瓶底，大约1块组织/cm2，翻转培养瓶，加入5ml DMEM(Gibco)培养基(含20%FBS、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，4h后待组织块已贴紧瓶底，将瓶翻转正放[2]。用倒置显微镜观察细胞生长情况。大约5～7天后组织块边缘爬出梭状的平滑肌细胞，2周后细胞长满瓶底，呈波峰波谷状(见图1A)。α肌动蛋白染色证实为平滑肌细胞(见图1B)。细胞生长良好后，即进行传代，用0.25%胰蛋白酶消化2min作用，待细胞皱缩变圆，间隙增大时加入培养基终止消化，轻轻吹打，按1:2比例分装至2瓶。取3～10代生长良好的细胞备用。
, 百拇医药
图1 SD大鼠平滑肌细胞光镜及α肌动蛋白染色鉴定(略)
1.1.2 ECV304、HLF、HBE的培养 人脐静脉内皮细胞系ECV304、人胚肺成纤维细胞系HLF购自中山大学北校区实验动物中心细胞库，人支气管上皮细胞系HBE由广州医学院冉丕鑫教授赠送。细胞培养于含10%胎牛血清(FBS，杭州四季青)、双抗(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的RPMI1640培养基(Gibco)中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2～3天传代1次，并随时观察细胞形态。
1.2 主要试剂 中华眼镜蛇毒活性组分P7，中国科技大学生物科学院腾脉坤教授提供。MTT，Sigma产品。二甲基亚砜(DMSO)。α肌动蛋白SP试剂盒，武汉博士德产品。
1.3 仪器 倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品。二氧化碳培养箱，美国Quene产品。SM-3型自动酶标仪，北京圣健东风医疗仪器厂产品。
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1.4 FP7对ECV304、SMC、HLF、HBE的抑制作用对比 参考MTT法[3]，取对数生长期的ECV304、SMC、HLF、HBE细胞，D-Hanks冲洗，经0.25%胰蛋白酶(Trypsin)、0.02%EDTA消化(其中SMC用0.25%胰蛋白酶消化)，用RPMI1640(含10%FBS)终止消化制备单细胞悬液(SMC用20%FBSDMEM)，按5×104/ml密度接种于96孔培养板，每孔200μl，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24h，弃去孔内原培养液，分实验组和对照组加入以培养基1640或DMEM配制的不同浓度的FP7180μl(终浓度为0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)及等体积的不含组分的RPMI1640或DMEM，培养箱中孵育一定时间后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃孵育4h(FP7与细胞共作用24h)，弃孔内液体，加入200μl DMSO，置水平摇床20min后，酶标仪490nm波长测定其OD值，进行统计学处理。并按下式求得FP7对细胞生长的平均抑制率:
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生长抑制率=(1-实验组平均OD值/阴性对照组平均OD值)×100%
1.5 不同浓度的FP7对ECV304、SMC、HLF、HBE抑制作用的IC50实验 采用MTT[3]法，并且根据上述实验结果选择适当的浓度分配，分实验组和对照组加入以培养基配制的不同浓度的FP7180μl及等体积的不含组分的RPMI1640或 DMEM，ECV304各个终浓度为0.8μg/ml、1.6μg/ml、2.4μg/ml、3.2μg/ml、4.0μg/ml、4.8μg/ml、5.6μg/ml、6.4μg/ml、7.2μg/ml、8.0μg/ml、8.8μg/ml、9.6μg/ml，SMC是10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml，HLF是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml，HBE为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml。与各种细胞共作用24h后酶标仪测得OD值，按上述公式求得FP7各浓度对细胞生长的抑制率。应用SPSS软件分析浓度-抑制率相关性，并求出FP7对上述四种细胞作用的IC50值。
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2 结果
2.1 FP7对ECV304的抑制优于对SMC、HLF、HBE作用 FP7与各细胞作用24h后，对内皮细胞在0.625μg/ml即表现出一定的抑制作用，抑制率为4.41%，随后随浓度的逐渐增大，抑制率逐渐升高，1.25μg/ml～20μg/ml，抑制率分别是30.94%、61.81%、86.17%、96.05%、98.68%，从图2中可以看出10μg/ml时抑制率已基本达到最高峰，以后即开始进入一个平台。对HLF的抑制作用从0.625μg/ml～5μg/ml时，抑制作用维持在10%左右，从10μg/ml～80μg/ml，抑制率逐步升高至最高，80μg/ml后抑制率持续在一个水平。对HBE则是从10μg/ml开始出现抑制作用，以后逐步加强，而对SMC是从20μg/ml开始才出现抑制作用，随浓度增加逐渐增高。由此可以看出对四种细胞的抑制作用是明显不同的，对ECV304的抑制同对SMC、HLF、HBE的作用相比存在显著差异。
2.2 FP7对ECV304、HLF、HBE、SMC抑制作用24h的IC50结果 根据表1、2、3、4中的数据，求得的抑制率应用SPSS软件作直线回归及曲线相关分析，得出FP7对ECV304、HLF、HBE、SMC24h抑制作用的回归方程为:抑制率 ECV304 (%)=25.551+8.456×浓度(r=0.901，P<0.01);抑制率 HLF (%)=11.642+0.968×浓度(r=0.969，P<0.01);抑制率 HBE (%)=10.835+0.619×浓度(r=0.921，P<0.01);抑制率 SMC (%)=90.995-999.524/浓度(r=0.981，P<0.01)，将抑制率=50代入方程求出IC50分别为:2.891μg/ml、39.626μg/ml、63.271μg/ml、24.382μg/ml，由此可以看出，FP7对ECV304的抑制生长作用最强，达到相同的效应时，需要的浓度最小。
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图2 不同浓度FP7对不同细胞抑制作用的剂量-效应曲线(略)
表1 FP7与ECV304作用24h各浓度抑制率(略)注: ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01， ˇˇˇ P<0.001，下同
表2 FP7与HLF作用24h各浓度抑制率(略)
表3 FP7与SMC作用24h各浓度抑制率(略)
表4 FP7与HBE作用24h各浓度抑制率(略)
3 讨论
由于实体瘤的生长需要血管生成(angiogenesis)提供营养物质和氧气，而且血管生成又是其发生转移的必要途径[4，5]。因此通过抑制血管生成切断肿瘤血供及转移途径已经成为寻找抗癌药的重要方向之一，特别是寻找高效低毒的血管生成抑制剂已成为研制新抗癌药的重要途径，能选择性的抑制肿瘤血管新生，而对原血管内皮细胞、平滑肌细胞等正常细胞和肿瘤细胞并无毒副作用的新药才是开发的重点，具有广阔的应用前景。
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血管生成(angiogenesis)参与肿瘤的发生发展过程，血管生成的过程也相当复杂，包括寂静的血管内皮细胞受到血管新生促进因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的刺激而活化;接着活化的内皮细胞分泌许多蛋白酶来分解基底膜，进而内皮细胞发生增生和移动作用;最后促进新的微血管的生成与细胞分化，完成血管新生。可见内皮细胞在此过程中起着关键的作用，抑制内皮细胞的生长就可能在一定程度上抑制血管的生成。我们也已经有实验证实，我们从中华眼镜蛇毒中提取的活性组分FP7能够抑制内皮细胞的生长，并且呈现一定的时间以及剂量的依赖性。但是，构成血管的成分除了内皮细胞外，也还有成纤维细胞以及平滑肌细胞等，另一方面机体内其他部位也存在内皮细胞即各种组织器官表面的上皮细胞，所以FP7在作用于内皮细胞的同时是否对这些细胞也有抑制作用，是特异性的抑制血管内皮细胞还是广谱抑制各种细胞，我们在本研究中进行了实验探讨。
实验结果表明FP7对内皮细胞的抑制作用明显高于对其余三种细胞，其中从0.625μg/ml起就表现出了一定的抑制生长作用，10μg/ml即已达高峰，而其余三种细胞则均在5～10μg/ml才开始出现了抑制生长作用，到达高峰的浓度也都延迟到了80μg/ml后，24h IC50结果也证实了这一点，ECV304的IC50为2.891μg/ml，而SMC、HLF、HBE的IC50分别是39.626μg/ml、63.271μg/ml、34.382μg/ml，这就说明FP7能够时间剂量依赖性的抑制内皮细胞生长增殖，并对血管的内皮细胞呈现出一定的特异选择性，提示内皮细胞可能是FP7的专一作用靶点，其可能通过抑制内皮细胞来阻断肿瘤的血管生成，对于未来开发具有特异作用靶点的抗肿瘤血管生成药物具有广阔的应用前景。而FP7对肿瘤细胞是否也存在抑制生长的作用，对内皮细胞除了有抑制生长的作用外，是否还可以抑制内皮细胞的侵袭、运动、粘附以及自分泌等功能以及对内皮细胞作用的机制等，都有待于我们进一步的实验证实。
, 百拇医药
参考文献
1 Folkman J.Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med，1971，285(21):1182-1186.
2 徐叔云.药理实验方法学，第3版.北京:人民卫生出版社，2002，1023.
3 张均田.现代药理学实验方法，北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998，8，19.
4 Folkman J，Shing Y.Angiogenesis. J Biol Chem，1992，267(16):10931-10934.
5 FolkmanJ.Anti-angiogenesis:new concept for therapy of solid tumors. Ann.Surg，1972，175:409-416.
作者单位: 1 510182 广州医学院广州蛇毒研究所
2 230001 安徽合肥中国科技大学生物科学学院
(收稿日期:2004-02-25) (编辑 一坤), 百拇医药
【摘要】 目的 观察中华眼镜蛇毒活性组分FP7(Naja naja Atra venom active factor P7，FP7)抑制内皮细胞生长的选择性特点。方法 采用倒置显微镜、酶标仪分析不同浓度FP7作用下人脐静脉内皮细胞系ECV304、SD大鼠平滑肌细胞(SMC)、人胚肺成纤维细胞(HLF)以及人支气管上皮细胞(HBE)生长增殖的变化。结果 FP7抑制内皮细胞生长具有一定的选择性，作用24h后，抑制ECV304生长的作用明显高于其它三种细胞(P<0.05)。结论 本研究首次证实FP7抑制内皮细胞的生长增殖明显优于对构成血管的其它细胞的抑制作用，具有一定的选择性，这在抗血管生成的靶向治疗中有重要的意义。
关键词 眼镜蛇毒 内皮细胞 血管生成 选择性 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)07-0580-04
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Selectivity of anti-endothelial cells proliferation of Naja naja Atra venom active factor P7
Liu Xinyan，Yu Qingshen，Yu Hong’e，et al.
Guangzhou Snake Venom Institute，Guangdong510182.
【Abstract】 Objective To investigate selectivity of inhibition of endothelail cells after Naja naja Atra venom active factor P7(FP7)，an element from Naja naja Atra venom，treatment in vitro. Methods An effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)cellline ECV 304，SD rats smooth muscle cells(SMC)，human embryonic lung fibroblast(HLF)and human bronchial epithelium cells(HBE)proliferation were observed with invert microscope，enzyme symbolize meter after FP7 treatment at different concentrations. Results FP7 could inhibit growth and proliferation of ECV304，which had selectivity，after interaction of FP7 and cells，anti-proliferation of ECV304significant powerful than other cells. Conclusion FP7 can selectively inhibit the growth and proliferation of endothelial cells，which might be important to target therapy of anti-angiogenesis.
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Key words Naja naja Atra venom endothelial cells angiogenesis selectivity neoplasms
目前，肿瘤的治疗主要是化疗、放疗和手术，化疗又是肿瘤治疗的主要手段之一，约有10%的癌症可以用药物治愈或部分治愈，一些肿瘤晚期或转移癌以及白血病等也主要依赖化疗解决，因此，寻找根治肿瘤的关键在于发现新药和新的治疗方法。大部分的化疗药物的靶点都是肿瘤细胞，对肿瘤细胞起到杀伤作用的同时，使正常组织也受到较强的损害，而且肿瘤细胞基因的不稳定性、异质性和高突变率等都使得肿瘤极易产生耐药性，另一方面，有研究[1]指出肿瘤的生长是血管生成(angiogenesis)依赖性的，抑制血管生成可以达到治疗肿瘤的目的，血管内皮细胞参与了血管生成的多步骤过程，以血管内皮细胞为靶点的肿瘤开始浮出水面，这种治疗方法有许多优点比如比肿瘤细胞容易逆转、基因稳定等，现已成为寻找抗癌药的重要方向之一。我们从中华眼镜蛇(Naja naja Atra)毒原毒中提取并筛选出一种活性组分P7(Naja naja Atra Factor P7，以下简称FP7)，经初步实验已经证实其具有抑制内皮细胞生长的活性，本实验选取人脐静脉内皮细胞系ECV304、SD大鼠平滑肌细胞(SMC)、人胚肺成纤维细胞HLF以及人支气管上皮细胞HBE，采用MTT的方法着重探讨FP7在体外影响内皮细胞生长是否具有特异的选择性，为FP7应用于血管生成的治疗提供科学的实验基础。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
1.1.1 SD大鼠平滑肌细胞(smooth muscle cells，smc)的原代及传代培养SD大鼠(广州医学院实验动物中心提供)2只，雄性，重150～200g，颈椎脱臼致死。腹部向上固定于平板上，心脏对应位置向上扩大至下颌，向下扩大至上腹碘酊消毒3遍，打开胸腔，无菌条件下迅速取出胸主动脉，置于盛有D-hanks缓冲液(含青、链霉素)的10mm培养皿中，排净管腔内残留血液，剥去血管外层纤维脂肪膜，剪开血管，弯镊轻轻刮去内皮层，眼科剪将其剪成约1mm3左右大小，均匀贴于培养瓶底，大约1块组织/cm2，翻转培养瓶，加入5ml DMEM(Gibco)培养基(含20%FBS、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，4h后待组织块已贴紧瓶底，将瓶翻转正放[2]。用倒置显微镜观察细胞生长情况。大约5～7天后组织块边缘爬出梭状的平滑肌细胞，2周后细胞长满瓶底，呈波峰波谷状(见图1A)。α肌动蛋白染色证实为平滑肌细胞(见图1B)。细胞生长良好后，即进行传代，用0.25%胰蛋白酶消化2min作用，待细胞皱缩变圆，间隙增大时加入培养基终止消化，轻轻吹打，按1:2比例分装至2瓶。取3～10代生长良好的细胞备用。
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图1 SD大鼠平滑肌细胞光镜及α肌动蛋白染色鉴定(略)
1.1.2 ECV304、HLF、HBE的培养 人脐静脉内皮细胞系ECV304、人胚肺成纤维细胞系HLF购自中山大学北校区实验动物中心细胞库，人支气管上皮细胞系HBE由广州医学院冉丕鑫教授赠送。细胞培养于含10%胎牛血清(FBS，杭州四季青)、双抗(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的RPMI1640培养基(Gibco)中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2～3天传代1次，并随时观察细胞形态。
1.2 主要试剂 中华眼镜蛇毒活性组分P7，中国科技大学生物科学院腾脉坤教授提供。MTT，Sigma产品。二甲基亚砜(DMSO)。α肌动蛋白SP试剂盒，武汉博士德产品。
1.3 仪器 倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品。二氧化碳培养箱，美国Quene产品。SM-3型自动酶标仪，北京圣健东风医疗仪器厂产品。
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1.4 FP7对ECV304、SMC、HLF、HBE的抑制作用对比 参考MTT法[3]，取对数生长期的ECV304、SMC、HLF、HBE细胞，D-Hanks冲洗，经0.25%胰蛋白酶(Trypsin)、0.02%EDTA消化(其中SMC用0.25%胰蛋白酶消化)，用RPMI1640(含10%FBS)终止消化制备单细胞悬液(SMC用20%FBSDMEM)，按5×104/ml密度接种于96孔培养板，每孔200μl，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24h，弃去孔内原培养液，分实验组和对照组加入以培养基1640或DMEM配制的不同浓度的FP7180μl(终浓度为0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)及等体积的不含组分的RPMI1640或DMEM，培养箱中孵育一定时间后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃孵育4h(FP7与细胞共作用24h)，弃孔内液体，加入200μl DMSO，置水平摇床20min后，酶标仪490nm波长测定其OD值，进行统计学处理。并按下式求得FP7对细胞生长的平均抑制率:
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生长抑制率=(1-实验组平均OD值/阴性对照组平均OD值)×100%
1.5 不同浓度的FP7对ECV304、SMC、HLF、HBE抑制作用的IC50实验 采用MTT[3]法，并且根据上述实验结果选择适当的浓度分配，分实验组和对照组加入以培养基配制的不同浓度的FP7180μl及等体积的不含组分的RPMI1640或 DMEM，ECV304各个终浓度为0.8μg/ml、1.6μg/ml、2.4μg/ml、3.2μg/ml、4.0μg/ml、4.8μg/ml、5.6μg/ml、6.4μg/ml、7.2μg/ml、8.0μg/ml、8.8μg/ml、9.6μg/ml，SMC是10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml，HLF是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml，HBE为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml。与各种细胞共作用24h后酶标仪测得OD值，按上述公式求得FP7各浓度对细胞生长的抑制率。应用SPSS软件分析浓度-抑制率相关性，并求出FP7对上述四种细胞作用的IC50值。
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2 结果
2.1 FP7对ECV304的抑制优于对SMC、HLF、HBE作用 FP7与各细胞作用24h后，对内皮细胞在0.625μg/ml即表现出一定的抑制作用，抑制率为4.41%，随后随浓度的逐渐增大，抑制率逐渐升高，1.25μg/ml～20μg/ml，抑制率分别是30.94%、61.81%、86.17%、96.05%、98.68%，从图2中可以看出10μg/ml时抑制率已基本达到最高峰，以后即开始进入一个平台。对HLF的抑制作用从0.625μg/ml～5μg/ml时，抑制作用维持在10%左右，从10μg/ml～80μg/ml，抑制率逐步升高至最高，80μg/ml后抑制率持续在一个水平。对HBE则是从10μg/ml开始出现抑制作用，以后逐步加强，而对SMC是从20μg/ml开始才出现抑制作用，随浓度增加逐渐增高。由此可以看出对四种细胞的抑制作用是明显不同的，对ECV304的抑制同对SMC、HLF、HBE的作用相比存在显著差异。
2.2 FP7对ECV304、HLF、HBE、SMC抑制作用24h的IC50结果 根据表1、2、3、4中的数据，求得的抑制率应用SPSS软件作直线回归及曲线相关分析，得出FP7对ECV304、HLF、HBE、SMC24h抑制作用的回归方程为:抑制率 ECV304 (%)=25.551+8.456×浓度(r=0.901，P<0.01);抑制率 HLF (%)=11.642+0.968×浓度(r=0.969，P<0.01);抑制率 HBE (%)=10.835+0.619×浓度(r=0.921，P<0.01);抑制率 SMC (%)=90.995-999.524/浓度(r=0.981，P<0.01)，将抑制率=50代入方程求出IC50分别为:2.891μg/ml、39.626μg/ml、63.271μg/ml、24.382μg/ml，由此可以看出，FP7对ECV304的抑制生长作用最强，达到相同的效应时，需要的浓度最小。
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图2 不同浓度FP7对不同细胞抑制作用的剂量-效应曲线(略)
表1 FP7与ECV304作用24h各浓度抑制率(略)注: ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01， ˇˇˇ P<0.001，下同
表2 FP7与HLF作用24h各浓度抑制率(略)
表3 FP7与SMC作用24h各浓度抑制率(略)
表4 FP7与HBE作用24h各浓度抑制率(略)
3 讨论
由于实体瘤的生长需要血管生成(angiogenesis)提供营养物质和氧气，而且血管生成又是其发生转移的必要途径[4，5]。因此通过抑制血管生成切断肿瘤血供及转移途径已经成为寻找抗癌药的重要方向之一，特别是寻找高效低毒的血管生成抑制剂已成为研制新抗癌药的重要途径，能选择性的抑制肿瘤血管新生，而对原血管内皮细胞、平滑肌细胞等正常细胞和肿瘤细胞并无毒副作用的新药才是开发的重点，具有广阔的应用前景。
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血管生成(angiogenesis)参与肿瘤的发生发展过程，血管生成的过程也相当复杂，包括寂静的血管内皮细胞受到血管新生促进因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的刺激而活化;接着活化的内皮细胞分泌许多蛋白酶来分解基底膜，进而内皮细胞发生增生和移动作用;最后促进新的微血管的生成与细胞分化，完成血管新生。可见内皮细胞在此过程中起着关键的作用，抑制内皮细胞的生长就可能在一定程度上抑制血管的生成。我们也已经有实验证实，我们从中华眼镜蛇毒中提取的活性组分FP7能够抑制内皮细胞的生长，并且呈现一定的时间以及剂量的依赖性。但是，构成血管的成分除了内皮细胞外，也还有成纤维细胞以及平滑肌细胞等，另一方面机体内其他部位也存在内皮细胞即各种组织器官表面的上皮细胞，所以FP7在作用于内皮细胞的同时是否对这些细胞也有抑制作用，是特异性的抑制血管内皮细胞还是广谱抑制各种细胞，我们在本研究中进行了实验探讨。
实验结果表明FP7对内皮细胞的抑制作用明显高于对其余三种细胞，其中从0.625μg/ml起就表现出了一定的抑制生长作用，10μg/ml即已达高峰，而其余三种细胞则均在5～10μg/ml才开始出现了抑制生长作用，到达高峰的浓度也都延迟到了80μg/ml后，24h IC50结果也证实了这一点，ECV304的IC50为2.891μg/ml，而SMC、HLF、HBE的IC50分别是39.626μg/ml、63.271μg/ml、34.382μg/ml，这就说明FP7能够时间剂量依赖性的抑制内皮细胞生长增殖，并对血管的内皮细胞呈现出一定的特异选择性，提示内皮细胞可能是FP7的专一作用靶点，其可能通过抑制内皮细胞来阻断肿瘤的血管生成，对于未来开发具有特异作用靶点的抗肿瘤血管生成药物具有广阔的应用前景。而FP7对肿瘤细胞是否也存在抑制生长的作用，对内皮细胞除了有抑制生长的作用外，是否还可以抑制内皮细胞的侵袭、运动、粘附以及自分泌等功能以及对内皮细胞作用的机制等，都有待于我们进一步的实验证实。
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参考文献
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作者单位: 1 510182 广州医学院广州蛇毒研究所
2 230001 安徽合肥中国科技大学生物科学学院
(收稿日期:2004-02-25) (编辑 一坤), 百拇医药