庆大霉素对豚鼠耳蜗一氧化氮合酶异构体表达的影响(基金项目)
http://www.100md.com
基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(编号:9810500201)
【摘要】 目的 研究庆大霉素(GM)对豚鼠耳蜗一氧化氮合酶(NOS)异构体表达的影响，探讨GM耳毒性的可能机制。方法 应用SABC免疫组化方法及显微图像分析技术，并结合听脑干反应(ABR)测试。结果 GM注射后，诱导型NOS(iNˉOS/NOSⅡ)在耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带和螺旋神经节的表达明显增强(P<0.01)，同时ABR阈值显著增高，且iNOS表达变化与ABR阈值变化高度相关(|r|>0.7，P<0.01);而神经元型NOS(nNOS/NOSⅠ)和内皮型NOS(eNOS/NOSⅢ)在两组的表达差异均无显著性。结论 GM可能通过使iNOS表达显著增强，以产生过量的NO，从而引起耳蜗损害。
关键词 庆大霉素 一氧化氮合酶 一氧化氮 耳蜗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)12-1062-03
, http://www.100md.com
Effects of gentamicin on the expression of nitric oxide
synthase isoforms in the guinea pig cochlea
Wang Aimei，Tang Hao，Ni Yueqiu
Department of Physiology，Jinzhou Medical College，Jinzhou121001.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of gentamicin(GM)on the expression of nitric oxide synˉthase(NOS)isoforms in the guinea pig cochlea，and to explore the possible mechanism of GM-induced ototoxicity.Methods We used SABC method of immunohistochemistry and microscope image analysis technique，combining with auditory brainstem response(ABR)measurement.Results After GM injection，expression of inducible NOS(iNOS/NOSⅡ)in the organ of Corti，stria vascular，spiral ligament and spiral ganglion was significantly enhanced(P<0.01);ABR threshold was significantly elevated at the same time，and iNOS expression wasin high correlation with ABR threshold(|r|>0.7，P<0.01).However，expression of neuronal NOS(nNOS/NOSⅠ)and endothelia NOS(eNOS/NOSⅢ)showed no significant differences in both experimental groups.Conclusion GMmay significantly enˉhance iNOS expression so as to generate high amounts of NO，thus cause cochlear injury.
, http://www.100md.com
Key words gentamicin nitric oxide synthase nitric oxide cochlea
一氧化氮(NO)作为一种重要的信使分子，可参与哺乳类动物耳蜗的血流调节、听觉传导及神经传递等重要过程。已知催化合成NO的一氧化氮合酶(NOS)的三型异构体，即神经元型(nNOS/NOSⅠ)、诱导型(iNOS/NOSⅡ)和内皮型(eNOS/NOSⅢ)均存在于豚鼠耳蜗结构中，并且可在生理和病理状态下表达其活性 [1，2] ，而病理状态下iNOS的诱导表达而产生的大量NO可能与内耳疾病的发病机理有关 [3～7] 。据此，本研究应用冰冻切片，通过SABC免疫组化染色及显微图像分析技术，结合听脑干反应(ABR)测试，观察庆大霉素(GM)对豚鼠耳蜗NOS三型异构体表达的影响，探讨GM耳毒性的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及耳毒性模型的制备 健康白毛红目豚鼠，耳廓反射正常，体重250～300g，雌雄不限(中国医科大学第二临床学院动物室提供)，随机分成对照组和GM组(n=10)。GM组每日腹腔注射硫酸庆大霉素100mg/kg(辽宁朝阳制药厂生产);对照组每日腹腔注射等量生理盐水。两组皆连续用药10d。用药期间每天监测体重以调整药量。
, http://www.100md.com
1.2 ABR测试 各组动物于用药前及停药后第2d分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠经1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，屏蔽耳机距测试豚鼠外耳道口0.5cm。用ABR诱发记录系统给予以2000Hz为主的短声(click)刺激，间隔90ms，带通滤波50～3000Hz，叠加200次，扫描时间20ms。测试声响从95dB SPL开始，以5dB逐次递减，观察P 3 波以判定两侧耳的ABR阈值。
1.3 耳蜗标本制备 停药第2d测试完ABR后，将豚鼠立即断头处死，速取听泡。充分暴露耳蜗后，在解剖显微镜下刺破前庭窗及蜗窗，蜗尖钻孔并缓慢灌流含4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS(pH7.4)，再将标本浸入该溶液4℃下固定2h。经PBS冲洗后放入10%的EDTA中，4℃下脱钙7d。然后移入25%蔗糖溶液中4℃过夜沉淀。用OCT包埋耳蜗，行20μm恒冷冰冻切片。
, http://www.100md.com
1.4 免疫组化染色 SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。切片干燥后，蒸馏水冲洗。0.5%H 2 O 2 室温孵育切片30min，蒸馏水冲洗。抗原修复液处理10min，蒸馏水冲洗。以正常血清封闭液室温下孵育切片20min。加抗NOSⅠ～Ⅲ抗体(抗nNOS/NOSⅠ1:400;抗iˉNOS/NOSⅡ1:4000;抗eNOS/NOSⅢ1:100)，4℃过夜，PBS液冲洗。加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS液冲洗。加SABC试剂，37℃孵育30min，PBS液冲洗。DAB显色，脱水，透明，封片，显微镜下观察。
1.5 显微图像分析 每组随机取10张切片，应用Luzex-F图像分析仪测定耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节处三型NOS阳性反应产物的平均灰度值。灰度值越小，表明阳性反应越强。
1.6 统计学方法 实验数据以均值±标准差(ˉx±s)表示，应用SPSS统计软件进行t检验及相关分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 GM对ABR阈值的影响 GM组用药后，其ABR阈值比用药前明显升高，并且与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 GM对NOS异构体表达的影响
2.2.1 光镜观察 对照组iNOS阳性反应产物呈棕黄色颗粒，分布于耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带及螺旋神经节细胞内(图1～2之A)。GM组iNOS阳性反应产物的分布与对照组相似，但各相应区域的染色均明显增强，阳性颗粒显著增多(图1～2之B)。阴性对照染色切片上未见iNOS阳 性免疫反应。
表1 各组豚鼠用药前后ABR阈值
注: ˇˇ P<0.01，与给药前比较; ## P<0.01，与对照组比较 各组豚鼠耳蜗中均见nNOS和eNOS阳性反应产物，为棕黄色颗粒，并且二者的分布均与iNOS相似，也见于耳蜗的各上述部位。但镜下未观察到两组之间nNOS和eNOS阳性免疫染色差异存在显著性。
, 百拇医药
2.2.2 显微图像分析 GM组豚鼠耳蜗各部位iNOS阳性反应的平均灰度值均较对照组明显减少，两者差异有非常显著性(P<0.01)，即GM组耳蜗iNOS表达显著强于对照组(表2)。然而，GM组nNOS和eNOS阳性反应的平均灰度值与对照组比较差异无显著性。
表2 各组豚鼠耳蜗iNOS阳性反应的平均灰度值
注: ˇˇ P<0.01，与对照组比较
2.3 耳蜗NOS阳性反应的平均灰度值与ABR阈值的关系 直线相关分析证明，GM组豚鼠耳蜗各部位iNOS阳性反应的平均灰度值变化与ABR阈值变化高度相关(r 血管纹 =-0.878;r 螺旋神经节 =-0.802;r 螺旋韧带 =-0.900;r 螺旋器 =-0.861);表明iNOS表达越强，ABR阈值越高。而nNOS和eNOS表达变化与ABR阈值改变没有关系。
3 讨论
, 百拇医药
nNOS和eNOS又合称为结构型NOS(cNOS)，其在生理状态下即有表达，可生成少量的NO，参与调节机体的各种生理过程。在某些病理性因素刺激下，cNOS的表达可明显增强，如脊髓腹侧根撕脱可明显增加脊髓前角神经元中nNOS免疫活性和mRNA表达 [8] ，高血糖可刺激大鼠胰岛毛细血管内皮细胞eNOS表达 [9] ，脑缺血期间脑血管内皮eNOS免疫活性明显上调等 [10] 。Tabuchi等 [3] 亦观察到，短暂缺血可刺激豚鼠耳蜗nNOS表达显著增强，同时伴有耳蜗复合动作电位(CAP)阈值增大，提示nNOS在短暂缺血引发的耳蜗损伤中发挥了毒性作用。然而，Hess等 [4] 发现，将细菌性脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的混合物注入豚鼠鼓室腔后，耳蜗cNOS表达并未改变。我们的研究结果表明，GM耳中毒后，豚鼠耳蜗各部位cNOS的表达与对照组相比差异无显著性，提示GM可能也不影响cNOS的表达。对此我们目前尚无确切的解释，推测可能与下列因素有关:(1)实验动物种属、器官的不同可能会导致结果的差异;(2)本实验所用GM耳毒模型为一慢性模型，有可能没有观察到cNOS表达在急性期的变化。这一点我们将 在以后的工作中继续深入探讨。近年来的研究表明，iNOS的诱导表达及其产生的大量NO可能参与了内耳疾病的发病过程。Shi等 [5] 发现噪声可诱导豚鼠耳蜗螺旋器毛细胞及血管纹边缘细胞内iNOS的高表达，提示iNOS参与了噪声所致的听力丧失。Watanabe等 [6] 报道iNOS表达见于LPS处理后豚鼠耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带和螺旋神经节，同时伴有CAP阈值明显增大，提示iNOS通过合成大量NO引起炎症性耳蜗功能障碍。随后，他们又观察到耳毒性药物Cisplatin也可使豚鼠耳蜗iNOS表达增强，同时伴有ABR阈值增大，提示iNOS介导了Cisplatin的耳毒性 [7] ，导致听力丧失。我们的研究结果显示，GM注射后，豚鼠耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带及螺旋神经节细胞中iNOS表达明显增强，且与ABR阈值升高高度相关，表明iNOS及其产生的大量NO也参与了GM耳中毒过程，从而进一步证实了本研究室的前期工作结果。
, 百拇医药
综上，本研究证明GM可能并不影响cNOS的表达，而是通过使iNOS表达显著增强，进而产生过量的NO，引起耳蜗损害，导致听力丧失。这可能也是氨基苷类抗生素的耳毒性机制之一。至于GM诱导iNOS表达增强的具体途径，尚有待深入研究。(本文图片见封三)
参考文献
1 Gosepath K，Gath I，Maurer J，et al.Characterization of nitric oxide synˉhase isoforms expressed in different structures of the guinea pig cochlea.BrainRes，1997，747(1):26-33.
2 王爱梅，姜恩魁，高东明，等.一氧化氮合酶异构体在豚鼠耳蜗的定位表达.锦州医学院学报，2004，25(1):9-11.
, 百拇医药
3 Tabuchi K，Tsuji S，Kusakari J，et al.Ischemia-reperfusion injury of the cochlea:effects of an iron chelator and nitric oxide synthase inˉhibitors.Hear Res，2001，160(1-2):31-36.
4 Hess A，Bloch W，Huverstuh1J.Expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS/NOSⅡ)in the cochlea of guinea pigs after intratympaniˉcal endotoxin treatment.Brain Res，1999，830(1):113-122.
5 Shi X，Dai C，Nuttall AL.Altered expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)in the cochlea.Hear Res，2003，177(1-2):43-52.
, 百拇医药
6 Watanabe K，Hessb A，Zumegenb C，et al.Changes of the compound acˉtion potential(CAP)and the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS/NOSⅡ)in the cochlea under thein flammatory condition(1).Hear Res，2000，145(1-2):149-155.
7 Watanabe K，Hess A，Bloch W，et al.Nitric oxide synthase inhibitor suppresses the ototoxic side effect of cisplatin in guinea pigs.Anticancer Drugs，2000，11(5):401-406.
8 Wu W，Liuzzi FJ，Schinco FP，et al.Neuronal nitric oxide synthase is inˉduced in spinal neurons by traumatic injury.Neuroscience，1994，61:719-726.
, http://www.100md.com
9 Suschek C，Fehsel K，Kroncke KD，et al.Primary cultures of rat islet capillary endothelial cells:constitutive and cytokine-inducible macrophage-like nitric oxide synthase are expressed and activities regˉulated by glucose concentration.Am J Pathol，1994，145:685-695.
10 Zhang ZG，Chopp M，Zaloga C，et al.Cerebralendothelial nitric oxide synthase expression after focal cerebral ischemia in rats.Stroke，1993，24:2016-2021.
作者单位:121001辽宁锦州医学院生理教研室
110001沈阳中国医科大学听力研究室
110031沈阳医学院生理教研室
(编辑秋 实), 百拇医药
【摘要】 目的 研究庆大霉素(GM)对豚鼠耳蜗一氧化氮合酶(NOS)异构体表达的影响，探讨GM耳毒性的可能机制。方法 应用SABC免疫组化方法及显微图像分析技术，并结合听脑干反应(ABR)测试。结果 GM注射后，诱导型NOS(iNˉOS/NOSⅡ)在耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带和螺旋神经节的表达明显增强(P<0.01)，同时ABR阈值显著增高，且iNOS表达变化与ABR阈值变化高度相关(|r|>0.7，P<0.01);而神经元型NOS(nNOS/NOSⅠ)和内皮型NOS(eNOS/NOSⅢ)在两组的表达差异均无显著性。结论 GM可能通过使iNOS表达显著增强，以产生过量的NO，从而引起耳蜗损害。
关键词 庆大霉素 一氧化氮合酶 一氧化氮 耳蜗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)12-1062-03
, http://www.100md.com
Effects of gentamicin on the expression of nitric oxide
synthase isoforms in the guinea pig cochlea
Wang Aimei，Tang Hao，Ni Yueqiu
Department of Physiology，Jinzhou Medical College，Jinzhou121001.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of gentamicin(GM)on the expression of nitric oxide synˉthase(NOS)isoforms in the guinea pig cochlea，and to explore the possible mechanism of GM-induced ototoxicity.Methods We used SABC method of immunohistochemistry and microscope image analysis technique，combining with auditory brainstem response(ABR)measurement.Results After GM injection，expression of inducible NOS(iNOS/NOSⅡ)in the organ of Corti，stria vascular，spiral ligament and spiral ganglion was significantly enhanced(P<0.01);ABR threshold was significantly elevated at the same time，and iNOS expression wasin high correlation with ABR threshold(|r|>0.7，P<0.01).However，expression of neuronal NOS(nNOS/NOSⅠ)and endothelia NOS(eNOS/NOSⅢ)showed no significant differences in both experimental groups.Conclusion GMmay significantly enˉhance iNOS expression so as to generate high amounts of NO，thus cause cochlear injury.
, http://www.100md.com
Key words gentamicin nitric oxide synthase nitric oxide cochlea
一氧化氮(NO)作为一种重要的信使分子，可参与哺乳类动物耳蜗的血流调节、听觉传导及神经传递等重要过程。已知催化合成NO的一氧化氮合酶(NOS)的三型异构体，即神经元型(nNOS/NOSⅠ)、诱导型(iNOS/NOSⅡ)和内皮型(eNOS/NOSⅢ)均存在于豚鼠耳蜗结构中，并且可在生理和病理状态下表达其活性 [1，2] ，而病理状态下iNOS的诱导表达而产生的大量NO可能与内耳疾病的发病机理有关 [3～7] 。据此，本研究应用冰冻切片，通过SABC免疫组化染色及显微图像分析技术，结合听脑干反应(ABR)测试，观察庆大霉素(GM)对豚鼠耳蜗NOS三型异构体表达的影响，探讨GM耳毒性的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及耳毒性模型的制备 健康白毛红目豚鼠，耳廓反射正常，体重250～300g，雌雄不限(中国医科大学第二临床学院动物室提供)，随机分成对照组和GM组(n=10)。GM组每日腹腔注射硫酸庆大霉素100mg/kg(辽宁朝阳制药厂生产);对照组每日腹腔注射等量生理盐水。两组皆连续用药10d。用药期间每天监测体重以调整药量。
, http://www.100md.com
1.2 ABR测试 各组动物于用药前及停药后第2d分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠经1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，屏蔽耳机距测试豚鼠外耳道口0.5cm。用ABR诱发记录系统给予以2000Hz为主的短声(click)刺激，间隔90ms，带通滤波50～3000Hz，叠加200次，扫描时间20ms。测试声响从95dB SPL开始，以5dB逐次递减，观察P 3 波以判定两侧耳的ABR阈值。
1.3 耳蜗标本制备 停药第2d测试完ABR后，将豚鼠立即断头处死，速取听泡。充分暴露耳蜗后，在解剖显微镜下刺破前庭窗及蜗窗，蜗尖钻孔并缓慢灌流含4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS(pH7.4)，再将标本浸入该溶液4℃下固定2h。经PBS冲洗后放入10%的EDTA中，4℃下脱钙7d。然后移入25%蔗糖溶液中4℃过夜沉淀。用OCT包埋耳蜗，行20μm恒冷冰冻切片。
, http://www.100md.com
1.4 免疫组化染色 SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。切片干燥后，蒸馏水冲洗。0.5%H 2 O 2 室温孵育切片30min，蒸馏水冲洗。抗原修复液处理10min，蒸馏水冲洗。以正常血清封闭液室温下孵育切片20min。加抗NOSⅠ～Ⅲ抗体(抗nNOS/NOSⅠ1:400;抗iˉNOS/NOSⅡ1:4000;抗eNOS/NOSⅢ1:100)，4℃过夜，PBS液冲洗。加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS液冲洗。加SABC试剂，37℃孵育30min，PBS液冲洗。DAB显色，脱水，透明，封片，显微镜下观察。
1.5 显微图像分析 每组随机取10张切片，应用Luzex-F图像分析仪测定耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节处三型NOS阳性反应产物的平均灰度值。灰度值越小，表明阳性反应越强。
1.6 统计学方法 实验数据以均值±标准差(ˉx±s)表示，应用SPSS统计软件进行t检验及相关分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 GM对ABR阈值的影响 GM组用药后，其ABR阈值比用药前明显升高，并且与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 GM对NOS异构体表达的影响
2.2.1 光镜观察 对照组iNOS阳性反应产物呈棕黄色颗粒，分布于耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带及螺旋神经节细胞内(图1～2之A)。GM组iNOS阳性反应产物的分布与对照组相似，但各相应区域的染色均明显增强，阳性颗粒显著增多(图1～2之B)。阴性对照染色切片上未见iNOS阳 性免疫反应。
表1 各组豚鼠用药前后ABR阈值
注: ˇˇ P<0.01，与给药前比较; ## P<0.01，与对照组比较 各组豚鼠耳蜗中均见nNOS和eNOS阳性反应产物，为棕黄色颗粒，并且二者的分布均与iNOS相似，也见于耳蜗的各上述部位。但镜下未观察到两组之间nNOS和eNOS阳性免疫染色差异存在显著性。
, 百拇医药
2.2.2 显微图像分析 GM组豚鼠耳蜗各部位iNOS阳性反应的平均灰度值均较对照组明显减少，两者差异有非常显著性(P<0.01)，即GM组耳蜗iNOS表达显著强于对照组(表2)。然而，GM组nNOS和eNOS阳性反应的平均灰度值与对照组比较差异无显著性。
表2 各组豚鼠耳蜗iNOS阳性反应的平均灰度值
注: ˇˇ P<0.01，与对照组比较
2.3 耳蜗NOS阳性反应的平均灰度值与ABR阈值的关系 直线相关分析证明，GM组豚鼠耳蜗各部位iNOS阳性反应的平均灰度值变化与ABR阈值变化高度相关(r 血管纹 =-0.878;r 螺旋神经节 =-0.802;r 螺旋韧带 =-0.900;r 螺旋器 =-0.861);表明iNOS表达越强，ABR阈值越高。而nNOS和eNOS表达变化与ABR阈值改变没有关系。
3 讨论
, 百拇医药
nNOS和eNOS又合称为结构型NOS(cNOS)，其在生理状态下即有表达，可生成少量的NO，参与调节机体的各种生理过程。在某些病理性因素刺激下，cNOS的表达可明显增强，如脊髓腹侧根撕脱可明显增加脊髓前角神经元中nNOS免疫活性和mRNA表达 [8] ，高血糖可刺激大鼠胰岛毛细血管内皮细胞eNOS表达 [9] ，脑缺血期间脑血管内皮eNOS免疫活性明显上调等 [10] 。Tabuchi等 [3] 亦观察到，短暂缺血可刺激豚鼠耳蜗nNOS表达显著增强，同时伴有耳蜗复合动作电位(CAP)阈值增大，提示nNOS在短暂缺血引发的耳蜗损伤中发挥了毒性作用。然而，Hess等 [4] 发现，将细菌性脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的混合物注入豚鼠鼓室腔后，耳蜗cNOS表达并未改变。我们的研究结果表明，GM耳中毒后，豚鼠耳蜗各部位cNOS的表达与对照组相比差异无显著性，提示GM可能也不影响cNOS的表达。对此我们目前尚无确切的解释，推测可能与下列因素有关:(1)实验动物种属、器官的不同可能会导致结果的差异;(2)本实验所用GM耳毒模型为一慢性模型，有可能没有观察到cNOS表达在急性期的变化。这一点我们将 在以后的工作中继续深入探讨。近年来的研究表明，iNOS的诱导表达及其产生的大量NO可能参与了内耳疾病的发病过程。Shi等 [5] 发现噪声可诱导豚鼠耳蜗螺旋器毛细胞及血管纹边缘细胞内iNOS的高表达，提示iNOS参与了噪声所致的听力丧失。Watanabe等 [6] 报道iNOS表达见于LPS处理后豚鼠耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带和螺旋神经节，同时伴有CAP阈值明显增大，提示iNOS通过合成大量NO引起炎症性耳蜗功能障碍。随后，他们又观察到耳毒性药物Cisplatin也可使豚鼠耳蜗iNOS表达增强，同时伴有ABR阈值增大，提示iNOS介导了Cisplatin的耳毒性 [7] ，导致听力丧失。我们的研究结果显示，GM注射后，豚鼠耳蜗螺旋器、血管纹、螺旋韧带及螺旋神经节细胞中iNOS表达明显增强，且与ABR阈值升高高度相关，表明iNOS及其产生的大量NO也参与了GM耳中毒过程，从而进一步证实了本研究室的前期工作结果。
, 百拇医药
综上，本研究证明GM可能并不影响cNOS的表达，而是通过使iNOS表达显著增强，进而产生过量的NO，引起耳蜗损害，导致听力丧失。这可能也是氨基苷类抗生素的耳毒性机制之一。至于GM诱导iNOS表达增强的具体途径，尚有待深入研究。(本文图片见封三)
参考文献
1 Gosepath K，Gath I，Maurer J，et al.Characterization of nitric oxide synˉhase isoforms expressed in different structures of the guinea pig cochlea.BrainRes，1997，747(1):26-33.
2 王爱梅，姜恩魁，高东明，等.一氧化氮合酶异构体在豚鼠耳蜗的定位表达.锦州医学院学报，2004，25(1):9-11.
, 百拇医药
3 Tabuchi K，Tsuji S，Kusakari J，et al.Ischemia-reperfusion injury of the cochlea:effects of an iron chelator and nitric oxide synthase inˉhibitors.Hear Res，2001，160(1-2):31-36.
4 Hess A，Bloch W，Huverstuh1J.Expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS/NOSⅡ)in the cochlea of guinea pigs after intratympaniˉcal endotoxin treatment.Brain Res，1999，830(1):113-122.
5 Shi X，Dai C，Nuttall AL.Altered expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)in the cochlea.Hear Res，2003，177(1-2):43-52.
, 百拇医药
6 Watanabe K，Hessb A，Zumegenb C，et al.Changes of the compound acˉtion potential(CAP)and the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS/NOSⅡ)in the cochlea under thein flammatory condition(1).Hear Res，2000，145(1-2):149-155.
7 Watanabe K，Hess A，Bloch W，et al.Nitric oxide synthase inhibitor suppresses the ototoxic side effect of cisplatin in guinea pigs.Anticancer Drugs，2000，11(5):401-406.
8 Wu W，Liuzzi FJ，Schinco FP，et al.Neuronal nitric oxide synthase is inˉduced in spinal neurons by traumatic injury.Neuroscience，1994，61:719-726.
, http://www.100md.com
9 Suschek C，Fehsel K，Kroncke KD，et al.Primary cultures of rat islet capillary endothelial cells:constitutive and cytokine-inducible macrophage-like nitric oxide synthase are expressed and activities regˉulated by glucose concentration.Am J Pathol，1994，145:685-695.
10 Zhang ZG，Chopp M，Zaloga C，et al.Cerebralendothelial nitric oxide synthase expression after focal cerebral ischemia in rats.Stroke，1993，24:2016-2021.
作者单位:121001辽宁锦州医学院生理教研室
110001沈阳中国医科大学听力研究室
110031沈阳医学院生理教研室
(编辑秋 实), 百拇医药