银杏白果多糖的免疫调节活性与抗肿瘤作用
【摘要】 目的 研究银杏白果多糖(Ginkgo biloba seed polysaccharide，GBSP)的免疫调节活性与抗肿瘤作用。方法 体内实验，腹腔注射剂量为100mg/kg体重的GBSP，检查GBSP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡血红细胞的吞噬百分率和吞噬指数的影响;腹腔注射GBSP(剂量分别为:75、150、300mg/kg体重)，测定GBSP对小鼠S 180 实体瘤的抑瘤率。体外实验:3 H-TdR掺入，液体闪烁仪测定GBSP(剂量分别为:15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00μg/ml)对Yac-1细胞体外增殖的影响。结果 实验组小鼠的吞噬百分率和吞噬指数分别为19.06±2.38和0.89±0.16，与对照组相比差异有显著性(P<0.05);三个剂量的GBSP对S 180 的抑瘤率分别为24.58%、64.2%、55.3%;GBSP对Yac-1淋巴瘤细胞体外增殖有直接抑制作用，并且抑制作用与GBSP的剂量呈正相关。结论 GBSP具有较强的免疫调节活性与抗肿瘤作用。
, 百拇医药
关键词 银杏白果 多糖 吞噬细胞 抗肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0868-03
Effects of the polysaccharide from Ginkgo biloba seed
on immunoregulative and antineoplastic activities in mice
Chen Qun，Yang Guiwen，An Liguo
The Provincial Key Laboratory，Department of Biology，Shandong Normal University，Jinan250014.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effects of GBSP on immunoregulation and anti-tumoractivity.Methods Experiments in vivo:Tested the effect of GBSPat the dose of100mg/kg body weight(ip.)on the PP(Phagocytic Percentage)and PI(Phagocytic Index)of macrophages phagocytizing cock red blood cells in abdominal cavity of mice;Tested the inhibition rates of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice.Experiˉments in vitro:Tested the effect of GBSP on the multiplication of Yac-1by the method of 3 H-TdR.Results The PP and PIof experimental group of mice were19.06±2.38and0.89±0.16respectively，and thedifferences of comparˉing with contrast group were remarkable(P<0.05);The inhibition rates of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice were24.5%，64.2%and55.3%，at the doses of75，150，and300mg/kg body weight(ip.)respectively;GBSP could inhibit the multiplication of Yac-1cells directly and remarkably，and the inhibition effects were positively correlative with the doses of GBSP.Conclusion GBSP had strong activities of immunoregulation and anti-tumor.
, 百拇医药
Key words Ginkgo biloba seed polysaccharide macrophages anti-tumor
银杏树(Ginkgo biloba L.)的叶子和果实均具有重要的药用价值，目前研究与开发较多是由银杏叶中提取的银杏黄酮的治疗心血管疾病、神经系统疾病及清除自由基和抗氧化等方面的作用，而有关银杏提取物的免疫调节作用和抗肿瘤活性的研究鲜有报道。银杏叶、银杏外种皮和银杏叶培养细胞的水溶性多糖已被提取和纯化，它们的化学结构和部分生物学活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗自由基和抗氧化等，已有报道 [1～7] ，本文继银杏白果糖(Ginkgo biloba seed polysaccharide，GBSP)结构和诱导肿瘤细胞凋亡的研究 [8，9] 之后的研究GBSP的免疫调节活性和抗肿瘤作用，以期为GBSP的药理研究及其临床应用和开发提供基础资料。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试剂与仪器 银杏白果，购自济南建联中药店，乳白色，大小均匀，质地光滑，无霉变;RPMI1640培养粉，美国GIBCO公司产品;小牛血清， 3 H-TdR，美国Sigma公司产品;其余试剂均为国产分析纯。DU640蛋白质核酸分析仪(Backman，美国)，RKJ二氧化碳培养箱(日本池本理化株式会社)，液体闪烁计数仪(Backman，美国)。
1.2 动物 昆明种小鼠，体重20±2g，雄性，购自山东省卫生防疫站实验动物中心。
1.3 瘤株 S 180 种鼠，购自山东省医学科学院实验动物中心;Yac-1细胞株由荷兰鹿特丹大学提供。
1.4 GBSP的分离提取与纯化 银杏白果200g，粉碎后分3次加入3000ml的蒸馏水，75℃共浸提8h，合并过滤液于旋转蒸发器中，45℃浓缩至过滤液原体积的30%。浓缩液3000r/min离心15min，上清液加入3倍体积95%乙醇沉淀粗多糖。收集沉淀，加入适量蒸馏水，充分复溶、透析，Seˉvag法去蛋白，反复多次，至280nm紫外线检测无明显吸收峰。样液再以3倍体积95%乙醇沉淀多糖，最后乙醇脱水，冷冻干燥，获得GBSP白色粉末。
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1.5 GBSP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡血红细胞的影响 小鼠随机分组，实验组:常规腹腔注射100mg/kg体重的GBSP生理盐水溶液1ml;对照组:腹腔注射生理盐水1ml。每天注射1次，共2次。第二次注射后12h，小鼠腹腔注射100倍稀释的鸡红细胞悬液1ml，1h后处死动物，取腹水涂片，常规Wright’s染色，凉干后透明、封片、镜检。每鼠做3张涂片，每张片计数100个吞噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数。
1.6 GBSP对S 180 移植性实体瘤的影响 小鼠随机分组，在接种S 180 前实验组隔天常规腹腔注射GBSP生理盐水溶液1ml，对照组注射生理盐水1ml，共注射3次。第三次注射24h后，将对数期S 180 细胞用生理盐水洗涤3次，并调细胞浓度为每ml含10 7 个S 180 细胞，小鼠均常规前肢腋下接种该S 180 细胞悬液0.2ml。24h后，各实验组每天常规腹腔注射1次GBSP生理盐水溶液1ml，对照组注射生理盐水1ml。连续腹腔注射9天后处死动物，剥瘤称重，计算抑瘤率。
, 百拇医药
1.7 GBSP对Yac-1细胞体外增殖的影响 将对数期Yac-1细胞离心洗涤3次后，用培养液调细胞浓度为每ml含10 6 个细胞，接种于96孔培养板中。24h后，实验组加入培养液配制的GBSP溶液至终浓度为:15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00μg/ml，对照组代之以等量的培养液。每组设3个重组，37℃，5%CO 2 ，培养12h。每孔加入0.5μCi的 3 H-TdR，37℃培养12h，收集细胞，液体闪烁仪测定脉冲数(cpm)。
2 结果
2.1 GBSP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡血红细胞的影响 实验组小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡红细胞的能力显著增强，吞噬百分数、吞噬指数2个指标与对照组相比差异有显著性(表1)。
Tab1 The effect!of GBSP on the index of macrophages in mice GBSP Treatment
, 百拇医药
注 ˇ P<0.05vs control group(t test)
2.2 GBSP对S 180 移植性实体瘤的影响 各防治组与对照组相比，差异均有显著性，抑瘤率最高达64.2%(表2)，但用药剂量增加的一定程度后，抑瘤率下降。
Tab2 The effect of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice GBSP Treatment
注: b P<0.01， c P<0.001vs control group(t test)
2.3 GBSP对Yac-1淋巴瘤细胞体外增殖的影响 GBSP对Yac-1淋巴瘤细胞体外增殖有直接抑制作用，抑制作用 与GBSP的剂量呈正相关(表3)。
, 百拇医药
Tab3 The effect of GBSP on the multiplication of Yac-1cells in vitro GBSP Treatment
注: a P<0.05， b P<0.01vs control group(t test)
3 讨论
体内外抑瘤实验表明，银杏白果多糖GBSP对小鼠S 180 实体瘤的抑瘤率最高可达64.2%，并且可抑制Yac-1肿瘤细胞体外增殖。通过实验笔者判断GBSP的抗肿瘤活性可能是通过下述途径来实现的。一是通过间接途径:GBSP可以促进吞噬细胞的吞噬活性，使其吞噬百分率和吞噬指数提高，活化了的吞噬细胞可增强分泌肿瘤细胞坏死因子TNF-α，增强了对肿瘤细胞的杀伤作用;二是通过直接途径:GBSP抑制肿瘤细胞繁殖，诱导肿瘤细胞凋亡 [9] ，从而杀伤肿瘤。有报道表明少数植物多糖可以通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡而对肿瘤有直接杀伤作用 [10～12] 。化学性抗癌药物往往具有很大的副作用，它在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。而银杏白果多糖对肿瘤有抑制作用，但对正常细胞却没有副作用。因此，对银杏白果多糖进行深入研究和开发应用，具有十分重要的意义。
, http://www.100md.com
参考文献
1 陈群，刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用.中药药理与临床，2003，19(5):18-19.
2 陈群，陈永红.银杏叶多糖的分离、分析及其对小鼠腹腔吞噬细胞的影响.淮南师范学院学报，2002，4(2):32-34.
3 Kraus J.Water-soluble polysaccharides from Ginkgo biloba leaves.Phytochemistry，1991，30(9):3017-3020.
4 靳菊情，丁东宁，边晓丽，等.银杏叶多糖的化学及清除羟自由基作用.西安医科大学学报，2000，21(5):217-220.
5 于荣敏，马文霞，张辉，等.银杏细胞培养物多糖和银杏叶多糖的研究.中国生化药物杂志，1999，20(5):417-419.
, http://www.100md.com
6 宋丽艳，马文霞，于荣敏，等.银杏细胞培养物多糖和银杏叶多糖生物活性的研究.中国生化药物杂志，1999，20(6):278-280.
7 赵肃清，李峰，孙远明.银杏外种皮研究进展.武汉植物学研究，2000，18(6):515-518.
8 陈群，杨贵文，安利国.银杏白果糖的提取、纯化和分析.中国药学杂志，2002，37(5):331-333.
9 Chen Qun，Yang Guiwen，An Liguo.Apoptosis of hepatoma cells SMMC-7721induced by Ginkgo Biloba seed polysaccharide.World Journal of Gastroenterol，2002，8(5):832-834.
10 Kim HS，Kacew S，Lee BM.In vitro chemopreventive effects of plant polysaccharide(Aloe barbadensis Miller，Lentinus edodes，Ganoderma lucidum and Coriolus versicolor).Carcinogenesis，1999，20(8):1637-1640.
, 百拇医药
11 Sogawa K，Matsuda M，Okutani K.Induction of apoptosis by a marine polysaccharide in a human leukemic cell line.Journal of Marine Biotechnology，1998，6(4):241-243.
12 Dong Ying，Kwan Chiu-Yin，Chen Zhinan，et al.Antiumor effects of a refined polysaccharide peptide fraction isolated from Coriolus versicolˉor:In vitro and in vivo studies.Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology.1996，92(2):140-148.
基金项目:安徽省高校优秀青年教师资助计划项目(2000jq144)
作者单位:232001安徽省淮南师范学院化生系(原单位:山东师大)
250014山东师范大学生物系动物抗性生物学省级重点实验室
(收稿日期2004-02-17)
(编辑黄 杰), 百拇医药
, 百拇医药
关键词 银杏白果 多糖 吞噬细胞 抗肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0868-03
Effects of the polysaccharide from Ginkgo biloba seed
on immunoregulative and antineoplastic activities in mice
Chen Qun，Yang Guiwen，An Liguo
The Provincial Key Laboratory，Department of Biology，Shandong Normal University，Jinan250014.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effects of GBSP on immunoregulation and anti-tumoractivity.Methods Experiments in vivo:Tested the effect of GBSPat the dose of100mg/kg body weight(ip.)on the PP(Phagocytic Percentage)and PI(Phagocytic Index)of macrophages phagocytizing cock red blood cells in abdominal cavity of mice;Tested the inhibition rates of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice.Experiˉments in vitro:Tested the effect of GBSP on the multiplication of Yac-1by the method of 3 H-TdR.Results The PP and PIof experimental group of mice were19.06±2.38and0.89±0.16respectively，and thedifferences of comparˉing with contrast group were remarkable(P<0.05);The inhibition rates of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice were24.5%，64.2%and55.3%，at the doses of75，150，and300mg/kg body weight(ip.)respectively;GBSP could inhibit the multiplication of Yac-1cells directly and remarkably，and the inhibition effects were positively correlative with the doses of GBSP.Conclusion GBSP had strong activities of immunoregulation and anti-tumor.
, 百拇医药
Key words Ginkgo biloba seed polysaccharide macrophages anti-tumor
银杏树(Ginkgo biloba L.)的叶子和果实均具有重要的药用价值，目前研究与开发较多是由银杏叶中提取的银杏黄酮的治疗心血管疾病、神经系统疾病及清除自由基和抗氧化等方面的作用，而有关银杏提取物的免疫调节作用和抗肿瘤活性的研究鲜有报道。银杏叶、银杏外种皮和银杏叶培养细胞的水溶性多糖已被提取和纯化，它们的化学结构和部分生物学活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗自由基和抗氧化等，已有报道 [1～7] ，本文继银杏白果糖(Ginkgo biloba seed polysaccharide，GBSP)结构和诱导肿瘤细胞凋亡的研究 [8，9] 之后的研究GBSP的免疫调节活性和抗肿瘤作用，以期为GBSP的药理研究及其临床应用和开发提供基础资料。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试剂与仪器 银杏白果，购自济南建联中药店，乳白色，大小均匀，质地光滑，无霉变;RPMI1640培养粉，美国GIBCO公司产品;小牛血清， 3 H-TdR，美国Sigma公司产品;其余试剂均为国产分析纯。DU640蛋白质核酸分析仪(Backman，美国)，RKJ二氧化碳培养箱(日本池本理化株式会社)，液体闪烁计数仪(Backman，美国)。
1.2 动物 昆明种小鼠，体重20±2g，雄性，购自山东省卫生防疫站实验动物中心。
1.3 瘤株 S 180 种鼠，购自山东省医学科学院实验动物中心;Yac-1细胞株由荷兰鹿特丹大学提供。
1.4 GBSP的分离提取与纯化 银杏白果200g，粉碎后分3次加入3000ml的蒸馏水，75℃共浸提8h，合并过滤液于旋转蒸发器中，45℃浓缩至过滤液原体积的30%。浓缩液3000r/min离心15min，上清液加入3倍体积95%乙醇沉淀粗多糖。收集沉淀，加入适量蒸馏水，充分复溶、透析，Seˉvag法去蛋白，反复多次，至280nm紫外线检测无明显吸收峰。样液再以3倍体积95%乙醇沉淀多糖，最后乙醇脱水，冷冻干燥，获得GBSP白色粉末。
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1.5 GBSP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡血红细胞的影响 小鼠随机分组，实验组:常规腹腔注射100mg/kg体重的GBSP生理盐水溶液1ml;对照组:腹腔注射生理盐水1ml。每天注射1次，共2次。第二次注射后12h，小鼠腹腔注射100倍稀释的鸡红细胞悬液1ml，1h后处死动物，取腹水涂片，常规Wright’s染色，凉干后透明、封片、镜检。每鼠做3张涂片，每张片计数100个吞噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数。
1.6 GBSP对S 180 移植性实体瘤的影响 小鼠随机分组，在接种S 180 前实验组隔天常规腹腔注射GBSP生理盐水溶液1ml，对照组注射生理盐水1ml，共注射3次。第三次注射24h后，将对数期S 180 细胞用生理盐水洗涤3次，并调细胞浓度为每ml含10 7 个S 180 细胞，小鼠均常规前肢腋下接种该S 180 细胞悬液0.2ml。24h后，各实验组每天常规腹腔注射1次GBSP生理盐水溶液1ml，对照组注射生理盐水1ml。连续腹腔注射9天后处死动物，剥瘤称重，计算抑瘤率。
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1.7 GBSP对Yac-1细胞体外增殖的影响 将对数期Yac-1细胞离心洗涤3次后，用培养液调细胞浓度为每ml含10 6 个细胞，接种于96孔培养板中。24h后，实验组加入培养液配制的GBSP溶液至终浓度为:15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00μg/ml，对照组代之以等量的培养液。每组设3个重组，37℃，5%CO 2 ，培养12h。每孔加入0.5μCi的 3 H-TdR，37℃培养12h，收集细胞，液体闪烁仪测定脉冲数(cpm)。
2 结果
2.1 GBSP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡血红细胞的影响 实验组小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡红细胞的能力显著增强，吞噬百分数、吞噬指数2个指标与对照组相比差异有显著性(表1)。
Tab1 The effect!of GBSP on the index of macrophages in mice GBSP Treatment
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注 ˇ P<0.05vs control group(t test)
2.2 GBSP对S 180 移植性实体瘤的影响 各防治组与对照组相比，差异均有显著性，抑瘤率最高达64.2%(表2)，但用药剂量增加的一定程度后，抑瘤率下降。
Tab2 The effect of GBSP on the growth of hypostatic tumor S 180 in the body of mice GBSP Treatment
注: b P<0.01， c P<0.001vs control group(t test)
2.3 GBSP对Yac-1淋巴瘤细胞体外增殖的影响 GBSP对Yac-1淋巴瘤细胞体外增殖有直接抑制作用，抑制作用 与GBSP的剂量呈正相关(表3)。
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Tab3 The effect of GBSP on the multiplication of Yac-1cells in vitro GBSP Treatment
注: a P<0.05， b P<0.01vs control group(t test)
3 讨论
体内外抑瘤实验表明，银杏白果多糖GBSP对小鼠S 180 实体瘤的抑瘤率最高可达64.2%，并且可抑制Yac-1肿瘤细胞体外增殖。通过实验笔者判断GBSP的抗肿瘤活性可能是通过下述途径来实现的。一是通过间接途径:GBSP可以促进吞噬细胞的吞噬活性，使其吞噬百分率和吞噬指数提高，活化了的吞噬细胞可增强分泌肿瘤细胞坏死因子TNF-α，增强了对肿瘤细胞的杀伤作用;二是通过直接途径:GBSP抑制肿瘤细胞繁殖，诱导肿瘤细胞凋亡 [9] ，从而杀伤肿瘤。有报道表明少数植物多糖可以通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡而对肿瘤有直接杀伤作用 [10～12] 。化学性抗癌药物往往具有很大的副作用，它在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。而银杏白果多糖对肿瘤有抑制作用，但对正常细胞却没有副作用。因此，对银杏白果多糖进行深入研究和开发应用，具有十分重要的意义。
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参考文献
1 陈群，刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用.中药药理与临床，2003，19(5):18-19.
2 陈群，陈永红.银杏叶多糖的分离、分析及其对小鼠腹腔吞噬细胞的影响.淮南师范学院学报，2002，4(2):32-34.
3 Kraus J.Water-soluble polysaccharides from Ginkgo biloba leaves.Phytochemistry，1991，30(9):3017-3020.
4 靳菊情，丁东宁，边晓丽，等.银杏叶多糖的化学及清除羟自由基作用.西安医科大学学报，2000，21(5):217-220.
5 于荣敏，马文霞，张辉，等.银杏细胞培养物多糖和银杏叶多糖的研究.中国生化药物杂志，1999，20(5):417-419.
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6 宋丽艳，马文霞，于荣敏，等.银杏细胞培养物多糖和银杏叶多糖生物活性的研究.中国生化药物杂志，1999，20(6):278-280.
7 赵肃清，李峰，孙远明.银杏外种皮研究进展.武汉植物学研究，2000，18(6):515-518.
8 陈群，杨贵文，安利国.银杏白果糖的提取、纯化和分析.中国药学杂志，2002，37(5):331-333.
9 Chen Qun，Yang Guiwen，An Liguo.Apoptosis of hepatoma cells SMMC-7721induced by Ginkgo Biloba seed polysaccharide.World Journal of Gastroenterol，2002，8(5):832-834.
10 Kim HS，Kacew S，Lee BM.In vitro chemopreventive effects of plant polysaccharide(Aloe barbadensis Miller，Lentinus edodes，Ganoderma lucidum and Coriolus versicolor).Carcinogenesis，1999，20(8):1637-1640.
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11 Sogawa K，Matsuda M，Okutani K.Induction of apoptosis by a marine polysaccharide in a human leukemic cell line.Journal of Marine Biotechnology，1998，6(4):241-243.
12 Dong Ying，Kwan Chiu-Yin，Chen Zhinan，et al.Antiumor effects of a refined polysaccharide peptide fraction isolated from Coriolus versicolˉor:In vitro and in vivo studies.Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology.1996，92(2):140-148.
基金项目:安徽省高校优秀青年教师资助计划项目(2000jq144)
作者单位:232001安徽省淮南师范学院化生系(原单位:山东师大)
250014山东师范大学生物系动物抗性生物学省级重点实验室
(收稿日期2004-02-17)
(编辑黄 杰), 百拇医药