猫儿眼提取物对HL-60细胞抑制作用的实验研究
【摘要】 目的 观察猫儿眼提取物对HL-60细胞的抑制作用。方法 采用MTT法、台盼蓝染色法和克隆形成方法测定猫儿眼提取物对HL-60细胞抑制作用。结果 分别给予1.0、5.0和50.0μg/ml猫儿眼植物酸48h，用MTT法测定其对肿瘤细胞的抑制率分别为70.4、71.7和73.3%;台盼蓝染色法显示，给药48h，，对细胞生长抑制率分别为58.7、73.0和77.3%;对克隆形成抑制率为82.0、87.0和98.1%。结论 猫儿眼提取物对HL-60细胞具有显著的抑制作用，其效果随给药浓度的增加而增加。
关键词 猫儿眼提取物 HL-60 MTT法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-01002-02
The inhibitory effect of Maoeryan Extract on HL-60cells
, 百拇医药
Chen Jing，Hou Xianglin，Yu Farong
College of Lanzhou Medicine，Lanzhou730000.
【Abstract】 Objective To determine the inhibitory effect of mao er yan extract for HL-60cells.Methods The inhibitory effect of mao er yan extract on HL-60cells in vitro were determined by the methods of methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)and trypan-blue.Results mao er yan extract at a does of1.0、5.0and50.0μg/ml were given to HL-60cells for48h，respectively，and the inhibitory rate for HL-60cells was by70.4、71.7and73.3%，respecˉtively;cellular growth inhibitory ratewas by58.7、73.0%and77.3%，respectively;as well as inhibitory rate of clone formating was by82.0，87.0and98.1%，respectively.Conclusion The mao er yan extract has significantly inhibitoˉry effect for HL-60cells and the inhibitory effect was increasing with the increase of concentration.
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Key words mao er yan extract HL-60cells method of MTT
猫儿眼为大戟科(Euphorbiaceae)多年生肉质草本植物，广泛分布于我国西北和华北地区，根入药。在民间曾有用猫儿眼生药治疗白血病 [1] 、食管癌的记载。本实验选甘肃天水产的猫儿眼，制成提取物，对HL-60细胞的抑制作用进行实验研究，以期为猫儿眼的开发研究和临床应用提供资料。
1 材料和方法
1.1 药物、试剂 猫儿眼提取物:由兰州大学化工学院天然植物研究所提取制得，黄色结晶，实验时，以二甲基亚砜助溶加RPMI1640培养液配制成所需浓度(二甲基亚砜含量<0.003%)。5-氟尿嘧啶(5-FU):上海旭东海普药业有限公司生产，批号0000306.MTT:上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
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1.2 细胞系 HL-60细胞系，由兰州军区总医院药局实验室惠增。全部实验在甘肃省医学科学研究院药理毒理学实验室完成。
1.3 MTT法实验 将HL-60细胞置于内含10%的胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养液，5%CO 2 ，37℃，饱和湿度条件中培养。取培养细胞以1.4×10 5 /ml的密度分别接种于96孔板，每孔90μl。给药组:设3个浓度(1.0、5.0、50.0μg/ml)，每孔加药10μl;5-FU组:每孔加5-FU(10μg/ml)10μl;对照组加等量PBS液。每组4个重复孔。培养48h后，加MTT(5.0mg/ml，PBS液配制)每孔10μl，孵育4h，去培养液，每孔加DMSO100μl，振荡10min，用酶联免疫检测仪在494nm处测其OD值，计算细胞生长抑制率(IR%):细胞生长抑制率(%)=1-实验组平均OD值对照组平均OD值×100%
, 百拇医药
1.4 台盼蓝法实验 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2.5×10 5 个/ml，接种于96孔培养板，每孔90μl，培养24h后，给药组:分别加入浓度为1.0、5.0、50.0μg/ml，每孔10μl;5-FU组:加5-FU(10μg/ml)，每孔10μl;对照组:加等量PBS液;各设4个重复孔。培养48h，加0.4%台盼蓝每孔20μl，用血球计数板在光镜下计活细胞数。
1.5 克隆形成法实验 在无菌环境中，取培养细胞，用含15%的胎牛血清的RPMI1640培养液稀释为1×10 3 个/ml的悬液，置37℃水浴预温。取35mm培养皿7个，分别加药物20μl。取RPMI1640培养液9份，加5%琼脂液1份，摇匀后加入培养皿，每个1ml，混匀药物后置室温使其凝固。再取预温的细胞液9.4ml，加5%琼脂液0.6ml混匀，在上述的每个培养皿中加入1ml，置室温使其凝固后5%CO 2 ，37℃，饱和湿度条件中培养7天，用10倍解剖显微镜计数50个细胞以上的克隆。
, 百拇医药
1.6 数据处理 实验数据采用SPSS10.0统计软件中Dunˉnett t-tests检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 MTT法测定结果 分别给予5-FU、1.0、5.0和50.0μg/ml猫儿眼提取物48h用MTT法测定，其抑制率分别为13.8、70.4、71.7和73.3%，与对照组比，差异有显著性(P<0.001)，见图1。
2.2 台盼蓝拒染法计数结果 分别给予5-FU、1.0、5.0、50.0μg/ml猫儿眼提取物48h，抑制率分别为71.9、58.7、73.0、77.3%，见图2。
图1 不同剂量药物对HL-60细胞的抑制作用(与对照组比: ˇˇ P<0.001)
图2 不同剂量药物对HL-60细胞的抑制作用(与对照组比: ˇˇ P<0.001)
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3 讨论
钟理等 [2] 在HL-60细胞集落培养中分别加入灵芝复方4～20mg/ml，对集落的形成有明显的抑制作用。儿茶类化合物 [3] 、昆明山海棠 [4] 、亚硒酸钠 [5] 等对HL-60细胞生长均有明显的抑制作用。本文采用体外培养HL-60细胞和MTT法、台盼蓝染色及克隆形成的方法，给予不同浓度的猫儿眼提取物，结果表明，猫儿眼提取物对HL-60细胞生长、克隆形成具有明显的抑制作用，且具有量效关系。
参考文献
1 Wu TS，Lin YM.Haruna M.Antitumor agents，119.Kansuiphorins A and B，two novel antileukemic diterpenesters from Euphorbnia kansui.J.Natˉural Products，1991，54(3):823-826.
, 百拇医药
2 钟理，蒋德昭，王绮如.灵芝复方诱导HL-60白血病细胞凋亡的研究.中草药，2000，31(1):34-36.
3 赵燕，曹进，祝和成，等.表没食子儿茶酸酯诱导HL-60细胞程序性死亡.中国药学杂志，1998，33(8):469-472.
4 敖琳，曹佳，孙华明，等.昆明山海棠诱导HL-60细胞凋亡的初步研究.中草药，2001，32(10):913-916.
5 叶进，刘复强，吴轶苹.全反式维甲酸和亚硒酸钠对HL-60细胞VEGF及其受体表达的影响.中国实验血液学杂志，2004，12(2):142-146.
作者单位:730000甘肃兰州兰州医学院
730070兰州甘肃政法学院公安分院( 通讯作者)
(收稿日期:2004-05-12)
(编辑使 臻), 百拇医药
关键词 猫儿眼提取物 HL-60 MTT法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-01002-02
The inhibitory effect of Maoeryan Extract on HL-60cells
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Chen Jing，Hou Xianglin，Yu Farong
College of Lanzhou Medicine，Lanzhou730000.
【Abstract】 Objective To determine the inhibitory effect of mao er yan extract for HL-60cells.Methods The inhibitory effect of mao er yan extract on HL-60cells in vitro were determined by the methods of methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)and trypan-blue.Results mao er yan extract at a does of1.0、5.0and50.0μg/ml were given to HL-60cells for48h，respectively，and the inhibitory rate for HL-60cells was by70.4、71.7and73.3%，respecˉtively;cellular growth inhibitory ratewas by58.7、73.0%and77.3%，respectively;as well as inhibitory rate of clone formating was by82.0，87.0and98.1%，respectively.Conclusion The mao er yan extract has significantly inhibitoˉry effect for HL-60cells and the inhibitory effect was increasing with the increase of concentration.
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Key words mao er yan extract HL-60cells method of MTT
猫儿眼为大戟科(Euphorbiaceae)多年生肉质草本植物，广泛分布于我国西北和华北地区，根入药。在民间曾有用猫儿眼生药治疗白血病 [1] 、食管癌的记载。本实验选甘肃天水产的猫儿眼，制成提取物，对HL-60细胞的抑制作用进行实验研究，以期为猫儿眼的开发研究和临床应用提供资料。
1 材料和方法
1.1 药物、试剂 猫儿眼提取物:由兰州大学化工学院天然植物研究所提取制得，黄色结晶，实验时，以二甲基亚砜助溶加RPMI1640培养液配制成所需浓度(二甲基亚砜含量<0.003%)。5-氟尿嘧啶(5-FU):上海旭东海普药业有限公司生产，批号0000306.MTT:上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
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1.2 细胞系 HL-60细胞系，由兰州军区总医院药局实验室惠增。全部实验在甘肃省医学科学研究院药理毒理学实验室完成。
1.3 MTT法实验 将HL-60细胞置于内含10%的胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养液，5%CO 2 ，37℃，饱和湿度条件中培养。取培养细胞以1.4×10 5 /ml的密度分别接种于96孔板，每孔90μl。给药组:设3个浓度(1.0、5.0、50.0μg/ml)，每孔加药10μl;5-FU组:每孔加5-FU(10μg/ml)10μl;对照组加等量PBS液。每组4个重复孔。培养48h后，加MTT(5.0mg/ml，PBS液配制)每孔10μl，孵育4h，去培养液，每孔加DMSO100μl，振荡10min，用酶联免疫检测仪在494nm处测其OD值，计算细胞生长抑制率(IR%):细胞生长抑制率(%)=1-实验组平均OD值对照组平均OD值×100%
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1.4 台盼蓝法实验 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2.5×10 5 个/ml，接种于96孔培养板，每孔90μl，培养24h后，给药组:分别加入浓度为1.0、5.0、50.0μg/ml，每孔10μl;5-FU组:加5-FU(10μg/ml)，每孔10μl;对照组:加等量PBS液;各设4个重复孔。培养48h，加0.4%台盼蓝每孔20μl，用血球计数板在光镜下计活细胞数。
1.5 克隆形成法实验 在无菌环境中，取培养细胞，用含15%的胎牛血清的RPMI1640培养液稀释为1×10 3 个/ml的悬液，置37℃水浴预温。取35mm培养皿7个，分别加药物20μl。取RPMI1640培养液9份，加5%琼脂液1份，摇匀后加入培养皿，每个1ml，混匀药物后置室温使其凝固。再取预温的细胞液9.4ml，加5%琼脂液0.6ml混匀，在上述的每个培养皿中加入1ml，置室温使其凝固后5%CO 2 ，37℃，饱和湿度条件中培养7天，用10倍解剖显微镜计数50个细胞以上的克隆。
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1.6 数据处理 实验数据采用SPSS10.0统计软件中Dunˉnett t-tests检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 MTT法测定结果 分别给予5-FU、1.0、5.0和50.0μg/ml猫儿眼提取物48h用MTT法测定，其抑制率分别为13.8、70.4、71.7和73.3%，与对照组比，差异有显著性(P<0.001)，见图1。
2.2 台盼蓝拒染法计数结果 分别给予5-FU、1.0、5.0、50.0μg/ml猫儿眼提取物48h，抑制率分别为71.9、58.7、73.0、77.3%，见图2。
图1 不同剂量药物对HL-60细胞的抑制作用(与对照组比: ˇˇ P<0.001)
图2 不同剂量药物对HL-60细胞的抑制作用(与对照组比: ˇˇ P<0.001)
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3 讨论
钟理等 [2] 在HL-60细胞集落培养中分别加入灵芝复方4～20mg/ml，对集落的形成有明显的抑制作用。儿茶类化合物 [3] 、昆明山海棠 [4] 、亚硒酸钠 [5] 等对HL-60细胞生长均有明显的抑制作用。本文采用体外培养HL-60细胞和MTT法、台盼蓝染色及克隆形成的方法，给予不同浓度的猫儿眼提取物，结果表明，猫儿眼提取物对HL-60细胞生长、克隆形成具有明显的抑制作用，且具有量效关系。
参考文献
1 Wu TS，Lin YM.Haruna M.Antitumor agents，119.Kansuiphorins A and B，two novel antileukemic diterpenesters from Euphorbnia kansui.J.Natˉural Products，1991，54(3):823-826.
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2 钟理，蒋德昭，王绮如.灵芝复方诱导HL-60白血病细胞凋亡的研究.中草药，2000，31(1):34-36.
3 赵燕，曹进，祝和成，等.表没食子儿茶酸酯诱导HL-60细胞程序性死亡.中国药学杂志，1998，33(8):469-472.
4 敖琳，曹佳，孙华明，等.昆明山海棠诱导HL-60细胞凋亡的初步研究.中草药，2001，32(10):913-916.
5 叶进，刘复强，吴轶苹.全反式维甲酸和亚硒酸钠对HL-60细胞VEGF及其受体表达的影响.中国实验血液学杂志，2004，12(2):142-146.
作者单位:730000甘肃兰州兰州医学院
730070兰州甘肃政法学院公安分院( 通讯作者)
(收稿日期:2004-05-12)
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