银杏叶提取物中白果酸的HPLC法限量检查
【摘要】 目的 研究银杏叶提取物中白果酸的HPLC限量检查方法。方法 以甲醇-水-冰醋酸(85:15:0.5)为流动相，检测波长:310nm，对银杏叶提取物中白果酸的HPLC限量检查进行研究。结果 此方法可以很好地将白果酸与其它成分分离，并测定银杏叶提取物中白果酸的含量。结论 参照国际标准，对银杏叶提取物中白果酸规定不得超过5ppm，此法可以有效地控制银杏叶提取物的质量，保证用药安全。
关键词 银杏叶提取物 白果酸 HPLC 限量检查
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0488-02
The quantitative limitation of ginkgolic acid in EGB by HPLC Li Xiaomeng，
Xu Weiliang，Pang Xiaoxiong
, 百拇医药
Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou510224.
【Abstract】 Objective To study the method to control the quantitative limitation of bilobic acid of EGB by HPLC.Methods It was eluated with methol-H 2 O-acetic acid(85:15:0.5)，the detection wavelength was310nm.Results Ginkgolic acidcould be well separated by this method and the constituents of Ginkgolic acid were also be determined.Conclusion To match with the international standard and to keep the safety of using，the conˉstituents of Ginkgolic acid should not be over5ppm in EGB.
, 百拇医药
Key words EGB ginkgolic acid HPLC the quantitative limitation
银杏(Ginkgobiloal L.)为现存古代孑遗植物之一，又名白果树，素有裸子植物“活化石”之称，为我国特产，资源拥有量占世界总量的70%。据本草考证，药用历史近2000年。银杏集药用、食用、材用、绿化美化环境于一体，被誉为“东方的圣者”，银杏叶制剂是目前在欧美最畅销的食用增补剂和药品。银杏提取物(EGB)具有独特药理活性和巨大的临床应用价值，因此对银杏叶的药用、保健、化妆品等综合价值的深入挖掘和开发日益受到国内外的重视。从文献来看，银杏酸是银杏叶中含有的一类长链苯酚类化合物，为银杏的毒副作用成分，银杏酸的含量是银杏制剂质量标准中的一个主要控制指标，国际上对其要求日益严格，德国Schwabe公司于1991年专利中提出银杏酸类物质含量低于10ppm，而1997年，德国卫生部又要求银杏酸的含量<5ppm，德国医药产品研究所则在一封公开信中要求各个厂家将银杏酚酸的含量控制在5ppm以下，如果制剂不能达到这一标准，就要强制取消其注册号。美国Montana公司的专利中也明确指出此类物质控制在5ppm以内是为了去除其可能产生的过敏反应，正是由于这些过敏反应，目前国际上的EGB生产标准才要求把银杏酚酸类物质的含量控制在5ppm以下，因此，我们在制订其质量标准时，也采用了这一标准，以保证本品的使用安全性。由于白果酸为银杏酚酸的代表性成分，故常用白果酸来进行限量。我们采用HPLC法，对银杏提取物(EGB)中白果酸进行限量检查，试验证明，本法可操作性强，重现性好，方法可行 [1～4] 。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 高效液相色谱仪:Waters600E泵;Waters996PAD检测器;Millennium 32 色谱工作站;Shimadzu Libror AEL40SM(十万分之一)天平(日本岛津所):SYZ-A石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏信达仪器厂)。甲醇(色谱纯，Tedia Company，Inc.，Fairfield，OH，USA)，水(重蒸馏，临用前制备)，冰醋酸(分析纯，南京化学试剂厂)。白果酸对照品(中国药科大学提供);银杏叶提取物样品从市场购买。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件和系统适用性试验 本文建立了HPLC法测定提取物中白果酸含量的方法。根据文献报道，并对色谱条件进行反复试验，确定了色谱条件为:色谱柱:DiaˉmonsilC 18 柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸(85:15:0.5)，用0.45μm微孔滤膜滤过;检测波长:310nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃。理论塔板数按白果酸峰计算不低于1000。
, 百拇医药
1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取本品5g，置索氏提取器中，以石油醚(30～60℃)150ml回流提取5h，挥干石油醚，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。因白果酸为低极性成分，其在石油醚中有良好的溶解度，而银杏提取物中的内酯及黄酮类成分在石油醚中难溶，故以石油醚为提取试剂既可以提取白果酸，又可排除银杏内酯及黄酮类成分的干扰。
1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取白果对照品12.56 mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取0.2，0.5，1.0，1.5，3.0ml，分别置5个100ml量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的对照品溶液。
2 结果
2.1 方法学考察
2.1.1 线性范围测定 精密吸取上述不同浓度白果酸的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，照上述方法测定，以白果酸峰面积为纵坐标，进样量(ng)为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数，结果见表1。表1 白果酸线性关系考察进样量(ng) 20.096 50.24 100.48 150.72 301.44峰面积 20557 41663 90315 146312 280264 回归方程 Y=938.3X-1078.3 相关系数 r=0.9991结果说明:白果酸在进样量20.096ng～301.44ng范围内呈良好的线性关系。
, 百拇医药
2.1.2 精密度试验 精密吸取上述浓度为5.024μg/ml的对照品溶液20μl，重复进样5次，测定白果酸峰面积积分 值，计算，结果峰面积平均值为91062，RSD为0.8%，结果说明仪器精密度良好。
2.1.3 稳定性试验 精密吸取上述浓度为5.024μg/ml的对照品溶液，48h内每隔一定时间进样20μl，测定白果酸峰面积积分值，计算，结果峰面积平均值为90043，RSD为2.5%，结果说明，供试品溶液在48h内基本稳定。
2.1.4 重现性试验 取同一批样品，精密称取5份，每份约5g，分别照前述方法制备供试品溶液，照含量测定法测定白果酸峰面积积分值，计算含量，结果均未检出白果酸。测定结果说明，白果酸含量测定结果重现性良好。
2.1.5 回收率试验 采用加样回收法，取上述已知含量样品(白果酸含量未检出)，精密称取2.5g，精密加入白果酸对照品溶液5ml(浓度:白果酸5.024μg/ml)，照含量测定法制备，测定含量，计算回收率，结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 白果酸回收率测定结果取样量(g)
2.2 样品测定 取3批EGB提取物，照正文方法制备供试品溶液，精密吸取2μl，依法进样，测定，计算，结果见表3。
表3 EGB提取物白果酸的限量检查结果
2.3 最低检测限的检查 取线性关系项下对照品溶液，稀释制备一系列浓度的溶液(5.024ppm、2.512ppm、1.0048ppm、0.5024ppm、0.2512ppm、0.1256ppm)，照上述色谱条件，以信噪比等于3:1为标准，测得0.2512ppm浓度的溶液的信噪比接近3:1，以进样量20μl计算，测得其最低检测限为5.024×10 -3 μg。
3 结论
根据文献报道，银杏制剂中白果酸的限量检查均不得超过5ppm，故以此为借鉴，制备对照品溶液浓度为5μg/ml，而供试品溶液的浓度为1g/ml，故供试品溶液中白果酸的峰面积可以与对照品溶液的峰面积直接比较来进行限量，供试品溶液的白果酸峰面积不得大于对照品溶液的峰面积。 此测定方法的最低检测限为5.024×10 -3 μg，即浓度为0.2512ppm，进样量为20μl时的白果酸进样量，即5.024×10 -3 μg进样量的白果酸的样品已能够测定，所以此测定方法是比较可靠的。考虑到银杏叶的总酚酸类成分中以白果酸为主，现只能得到单一的酚酸类对照品白果酸，故本品采用白果酸作为指标来进行限度检查，是可行的。
, http://www.100md.com
参考文献
1 张迪清，何照范.银杏叶资源的化学研究，北京:中国轻工业出版社，1999，1.
2 Mark Blumenthal.German government limits ginkgolic acid levels in ginkgo leaf extracts.Herral Gram，1997，41:29.
3 颜玉贞，谢培山，钱培良，等.银杏提取物及制剂薄层荧光扫描定量测定研究.中国中药杂志，1997，22(3):159.
4 Van Beek TA.Analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves and standardized extracts.proceedings of’97International Seminar on Ginkˉgo，Beijing，1997，158-173.
作者单位:510224广东药学院药学系
(收稿日期:2003-12-14)
(编辑姜 峰), http://www.100md.com
关键词 银杏叶提取物 白果酸 HPLC 限量检查
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0488-02
The quantitative limitation of ginkgolic acid in EGB by HPLC Li Xiaomeng，
Xu Weiliang，Pang Xiaoxiong
, 百拇医药
Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou510224.
【Abstract】 Objective To study the method to control the quantitative limitation of bilobic acid of EGB by HPLC.Methods It was eluated with methol-H 2 O-acetic acid(85:15:0.5)，the detection wavelength was310nm.Results Ginkgolic acidcould be well separated by this method and the constituents of Ginkgolic acid were also be determined.Conclusion To match with the international standard and to keep the safety of using，the conˉstituents of Ginkgolic acid should not be over5ppm in EGB.
, 百拇医药
Key words EGB ginkgolic acid HPLC the quantitative limitation
银杏(Ginkgobiloal L.)为现存古代孑遗植物之一，又名白果树，素有裸子植物“活化石”之称，为我国特产，资源拥有量占世界总量的70%。据本草考证，药用历史近2000年。银杏集药用、食用、材用、绿化美化环境于一体，被誉为“东方的圣者”，银杏叶制剂是目前在欧美最畅销的食用增补剂和药品。银杏提取物(EGB)具有独特药理活性和巨大的临床应用价值，因此对银杏叶的药用、保健、化妆品等综合价值的深入挖掘和开发日益受到国内外的重视。从文献来看，银杏酸是银杏叶中含有的一类长链苯酚类化合物，为银杏的毒副作用成分，银杏酸的含量是银杏制剂质量标准中的一个主要控制指标，国际上对其要求日益严格，德国Schwabe公司于1991年专利中提出银杏酸类物质含量低于10ppm，而1997年，德国卫生部又要求银杏酸的含量<5ppm，德国医药产品研究所则在一封公开信中要求各个厂家将银杏酚酸的含量控制在5ppm以下，如果制剂不能达到这一标准，就要强制取消其注册号。美国Montana公司的专利中也明确指出此类物质控制在5ppm以内是为了去除其可能产生的过敏反应，正是由于这些过敏反应，目前国际上的EGB生产标准才要求把银杏酚酸类物质的含量控制在5ppm以下，因此，我们在制订其质量标准时，也采用了这一标准，以保证本品的使用安全性。由于白果酸为银杏酚酸的代表性成分，故常用白果酸来进行限量。我们采用HPLC法，对银杏提取物(EGB)中白果酸进行限量检查，试验证明，本法可操作性强，重现性好，方法可行 [1～4] 。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 高效液相色谱仪:Waters600E泵;Waters996PAD检测器;Millennium 32 色谱工作站;Shimadzu Libror AEL40SM(十万分之一)天平(日本岛津所):SYZ-A石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏信达仪器厂)。甲醇(色谱纯，Tedia Company，Inc.，Fairfield，OH，USA)，水(重蒸馏，临用前制备)，冰醋酸(分析纯，南京化学试剂厂)。白果酸对照品(中国药科大学提供);银杏叶提取物样品从市场购买。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件和系统适用性试验 本文建立了HPLC法测定提取物中白果酸含量的方法。根据文献报道，并对色谱条件进行反复试验，确定了色谱条件为:色谱柱:DiaˉmonsilC 18 柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸(85:15:0.5)，用0.45μm微孔滤膜滤过;检测波长:310nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃。理论塔板数按白果酸峰计算不低于1000。
, 百拇医药
1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取本品5g，置索氏提取器中，以石油醚(30～60℃)150ml回流提取5h，挥干石油醚，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。因白果酸为低极性成分，其在石油醚中有良好的溶解度，而银杏提取物中的内酯及黄酮类成分在石油醚中难溶，故以石油醚为提取试剂既可以提取白果酸，又可排除银杏内酯及黄酮类成分的干扰。
1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取白果对照品12.56 mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取0.2，0.5，1.0，1.5，3.0ml，分别置5个100ml量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的对照品溶液。
2 结果
2.1 方法学考察
2.1.1 线性范围测定 精密吸取上述不同浓度白果酸的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，照上述方法测定，以白果酸峰面积为纵坐标，进样量(ng)为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数，结果见表1。表1 白果酸线性关系考察进样量(ng) 20.096 50.24 100.48 150.72 301.44峰面积 20557 41663 90315 146312 280264 回归方程 Y=938.3X-1078.3 相关系数 r=0.9991结果说明:白果酸在进样量20.096ng～301.44ng范围内呈良好的线性关系。
, 百拇医药
2.1.2 精密度试验 精密吸取上述浓度为5.024μg/ml的对照品溶液20μl，重复进样5次，测定白果酸峰面积积分 值，计算，结果峰面积平均值为91062，RSD为0.8%，结果说明仪器精密度良好。
2.1.3 稳定性试验 精密吸取上述浓度为5.024μg/ml的对照品溶液，48h内每隔一定时间进样20μl，测定白果酸峰面积积分值，计算，结果峰面积平均值为90043，RSD为2.5%，结果说明，供试品溶液在48h内基本稳定。
2.1.4 重现性试验 取同一批样品，精密称取5份，每份约5g，分别照前述方法制备供试品溶液，照含量测定法测定白果酸峰面积积分值，计算含量，结果均未检出白果酸。测定结果说明，白果酸含量测定结果重现性良好。
2.1.5 回收率试验 采用加样回收法，取上述已知含量样品(白果酸含量未检出)，精密称取2.5g，精密加入白果酸对照品溶液5ml(浓度:白果酸5.024μg/ml)，照含量测定法制备，测定含量，计算回收率，结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 白果酸回收率测定结果取样量(g)
2.2 样品测定 取3批EGB提取物，照正文方法制备供试品溶液，精密吸取2μl，依法进样，测定，计算，结果见表3。
表3 EGB提取物白果酸的限量检查结果
2.3 最低检测限的检查 取线性关系项下对照品溶液，稀释制备一系列浓度的溶液(5.024ppm、2.512ppm、1.0048ppm、0.5024ppm、0.2512ppm、0.1256ppm)，照上述色谱条件，以信噪比等于3:1为标准，测得0.2512ppm浓度的溶液的信噪比接近3:1，以进样量20μl计算，测得其最低检测限为5.024×10 -3 μg。
3 结论
根据文献报道，银杏制剂中白果酸的限量检查均不得超过5ppm，故以此为借鉴，制备对照品溶液浓度为5μg/ml，而供试品溶液的浓度为1g/ml，故供试品溶液中白果酸的峰面积可以与对照品溶液的峰面积直接比较来进行限量，供试品溶液的白果酸峰面积不得大于对照品溶液的峰面积。 此测定方法的最低检测限为5.024×10 -3 μg，即浓度为0.2512ppm，进样量为20μl时的白果酸进样量，即5.024×10 -3 μg进样量的白果酸的样品已能够测定，所以此测定方法是比较可靠的。考虑到银杏叶的总酚酸类成分中以白果酸为主，现只能得到单一的酚酸类对照品白果酸，故本品采用白果酸作为指标来进行限度检查，是可行的。
, http://www.100md.com
参考文献
1 张迪清，何照范.银杏叶资源的化学研究，北京:中国轻工业出版社，1999，1.
2 Mark Blumenthal.German government limits ginkgolic acid levels in ginkgo leaf extracts.Herral Gram，1997，41:29.
3 颜玉贞，谢培山，钱培良，等.银杏提取物及制剂薄层荧光扫描定量测定研究.中国中药杂志，1997，22(3):159.
4 Van Beek TA.Analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves and standardized extracts.proceedings of’97International Seminar on Ginkˉgo，Beijing，1997，158-173.
作者单位:510224广东药学院药学系
(收稿日期:2003-12-14)
(编辑姜 峰), http://www.100md.com