抗乙型肝炎病毒新药的体外研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)是比较严格的嗜肝DNA病毒，其感染的宿主范围狭窄。由于缺乏有效的实验工具，抗HBV新药的研究进展缓慢。1986年，Sureau等[1]首先报道筛选出能表达HBV全部病毒标志的细胞株。至此，HBV体外培养取得突破，抗HBV新药开发有了一个良好的体外研究工具。在众多培养系统中，以HepG2.2.15在新药体外研究中应用最多。该细胞株是用2个头尾相连的HBVDNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定的向培养上清中分泌HBsAg,HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是体外筛选抗HBV药物的良好模型。
1 筛选抗HBV的化学药物
抗HBV的化学合成药物中，研究较多的是核苷类似物和某些抗生素类药物。朱永廉[2]从2.2.15细胞培养液中提取乙肝病毒DNA，用DNA印迹法分析β-L-2',3'-双脱氧-5-氟胞苷对乙肝病毒DNA复制的影响。发现该药对HBV具有较强的抑制作用(IC50为0.05μmol/L),而且在浓度高到足以抑制乙肝病毒复制达90%以上时，对细胞线粒体DNA合成并无影响,说明其抗HBV作用在体外有较强的选择性。但该作用是可逆的，在停药后12d，病毒复制即开始恢复。产生这种“反跳”现象可能由于该药物主要抑制DNA聚合酶(HBVDNAP)，而对其他的病毒复制中间体，如超螺旋DNA(cccDNA)作用甚微。停药后，病毒复制可以从cccDNA处重新启动，导致产生“反跳”。吴婷等[3]以2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg,HBVDNA及细胞存活率为观察指标，综合评价了诺西肽体外抗HBV效果。结果表明:诺西肽对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别>16和>4.8。Southern杂交结果显示：诺西肽在12.5μg/ml浓度下对细胞内HBVDNA的抑制率为26.4%。提示该药可能作用于病毒生活周期的后期mRNA翻译和蛋白质的加工阶段。此外，该药在抑制HBV抗原的同时，显示出明显的促细胞生长作用，提示该药应用于临床后可能发挥出抗HBV和保肝的双重功效。他们又以同样的指标，评价了天然多肽类抗生素恩拉霉素体外抗HBV效果[4]。结果表明，恩拉霉素对HBsAg和HBeAg的IC50分别为27和34μg/ml；TI均>4。Southern结果显示：50μg/ml恩拉霉素对细胞内游离HBVDNA抑制率为56.8%。
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2 筛选抗HBV的反义核酸
目前，基因治疗是一种很有发展前景的方法，反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASON)用于调控基因的表达已成为抗HBV研究的一个热点问题。姚志强等[5]应用2.2.15细胞证明:反义核酸抑制HBV基因表达具有序列特异性、剂量相关性、时效依赖性、修饰增强性、作用协同性、对宿主细胞无害性等特点。其中针对HBV mRNA SPⅡ增强子帽区、多聚腺苷信号区及S基因起始区的ASON抑制活性最高,对HBsAg抑制率可达85%～90%,对HBeAg抑制率也近50%～60%,反复用药后HBVDNA同样受到抑制。其后，有学者相继报道针对PolyA增加信号序列、HBV前C和C基因区以及HBV基因S区和C区的翻译起始位点的ASON对HBV表现出明显的抑制效果。
上述工作研究的均为寡核苷酸硫代磷酸酯(PS-ODN)。但在进一步深入实验之后，发现PS-ODN存在一些剂量依赖性的不良反应，如脾肿大，血小板减少等，这些不良反应的产生可能是由于寡核苷酸的多阴离子特性造成了其体内特异性不强，多器官分布。针对这种情况，许多学者着手对其进行修饰改造，以期提高作用靶向性，降低不良反应。文立民等人[6]证明经阳离子脂质体(lipofectin)介导后,反义寡核苷酸在加入2.2.15细胞30min后,大多进入细胞质,而且在10min以后,大部分迅速聚积于细胞核中,它们在细胞核及细胞质中可稳定存在12h以上。郭军等[7]人工合成了两种半乳糖多聚赖氨酸导向配体,与荧光素标记的互补于HBV mRNA多聚腺苷酸信号部分的21-聚反义硫代脱氧核苷酸(ASODN)电性结合,并与2.2.15细胞共同孵育。40min后配体组对HBsAg和HBeAg的抑制率为41%～47%和28%～31%,单纯ASODN组为11%和5%,3d后配体组为88%～89%和71%～74%，对照组为64%和53%。经分析,配体使2.2.15细胞荧光染色率达75.3%和83.8%，对照组为24.3%。后经体内结果证明：两种人工配体均具有导向ASODN入肝细胞的功能,进而明显提高ASODN抗HBV的活性。钟森等[8]针对HBV前C/C基因区设计合成了16聚硫代和脂肪链-硫代两种修饰的ASON,检测作用细胞的HBsAg，HBeAg以及HBVDNA的分泌情况。结果显示ASON在短时作用于细胞的情况下,脂肪链修饰的硫代ASON的抗病毒活性显著高于未经脂肪链修饰者(P<0.002和P<0.05)。提示脂肪链修饰是今后ASON药物设计和开发的一个新途径。
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3 筛选抗HBV的蛋白质类药物
各类干扰素为治疗HBV发挥了相当重要的作用。但越来越多的实验证明干扰素的治疗效果有限，有学者转而研究其他种蛋白质药物。邓涛等[9]根据乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的MHC-Ⅰ类分子结合的关键序列合成了2段抗原性多肽(PepⅠaa:18～27及PepⅡaa:141～151)，分别与转铁蛋白(Tf)、抗CD3的单克隆抗体(CD3McAb)和白细胞介素2(IL-2)联合体外诱导乙肝病毒抗原特异性细胞毒T细胞(HBV-CTLs)，考察其对HBV的特异性杀伤力。结果发现HBV-CTLs在出现针对2.2.15的特异性细胞毒活性,d14达高峰,分别为67%(PepⅠ+Tf+CD3McAb+IL-2)及55%(PepⅡ+Tf+CD3McAb+IL-2)。由于同时测定到Fas配体(FasL)的表达较高，并与一氧化氮(NO)的表达为正相关。作者认为Fas-FasL介导细胞凋亡可能是HBV-CTLs杀伤机制之一，NO可能参与了HBV-CTLs功能的调节。楼敏等[10]用化学偶联剂SPDP将鼠源性CD3与HBs单克隆抗体连接，得到HBs/CD3双特异性抗体。实验显示，HBs/CD3双特异性单克隆抗体能显著提高LAK细胞与2.2.15细胞结合率,而且能增强其对2.2.15细胞的杀伤力，该作用与抗体浓度相关，HBsAb浓度递增,细胞毒性作用随之增加。对细胞毒性作用的特异性研究表明：加入HBs/CD3BsAb后,LAK细胞对2.2.15细胞的杀伤力显著高于HepG-2和K562细胞组。结果表明，HBs/CD3双特异性抗体具有双向识别LAK细胞和2.2.15细胞的特性，可以特异地促进LAK细胞与靶细胞结合，发挥选择性细胞毒性作用。
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4 筛选抗HBV的中草药
临床上已经有不少应用中草药治疗乙型肝炎的观察，但是尚缺乏有关的实验依据。范涛等[11]对4种中草药制剂体外抗HBV活性及其机制进行了研究。发现复方黄芪浸膏水提取液对HBsAg和HBeAg的抑制率较高，但对HBVDNA无明显抑制,提示该药可能作用于病毒的转录、翻译和蛋白合成等环节或直接与病毒蛋白结合而致HBsAg及HBeAg滴度下降。文立民等[12]以培养上清液中HBsAg和HBeAg滴度作为评价天然药物抗HBV效果的指标，对板蓝根、苦味叶下珠和4种中药混合物的抗HBV作用进行了比较。结果显示,苦味叶下珠与4种中药的混合物抗HBV的作用较强，可望成为有潜力的抗HBV药物。刘庄等[13]则考察了不同品种、剂型和添加成分的叶下珠提取物抗HBV的作用。其中沱茶珍珠草抗HBV作用最明显，在浓度为500mg/L时对HBsAg的抑制率可达100%，而未显示出明显的细胞毒。同时还观察到叶下珠提取物对病毒颗粒的抑制作用不仅发生在转录前水平，对mRNA的翻译可能也有影响。他们又对动物药华蟾素体外抗HBV活性进行了研究[14]。结果显示，该药对HBsAg和HBeAg的ID50分别为0.08和0.07mg/ml，CD50为2.5mg/ml，HBsAg为31.3，HBeAg为35.7，而且它对细胞内HBVDNA及其复制中间体呈剂量依赖型抑制。张均倡等[15]用2.2.15细胞株模型评价了肝康对HBsAg，HBeAg，HBV-DNA的抑制效果。发现从用药到见效需要3～4d，之后可出现明显的量效依赖性抑制作用，维持3～5d后逐渐减弱、消失，同时发现病毒复制、分泌越旺盛，抑制作用越强。
目前，国外筛选的抗HBV药物主要集中在化学合成药物上，尤其是核苷类似物。该类药物主要作用于HBVDNAP，而未能抑制其他的复制中间体，造成停药后发生“反跳”，反义核酸可以与靶mRNA序列特异性结合，抑制HBV基因表达，从而达到治疗效果。
虽然2.2.15细胞株只是一个体外实验系统，脱离了机体中免疫系统对HBV产生影响的环境。但是该细胞模型以及其他已建立的细胞培养系统，为全面、准确评价药物抗HBV效果提供了科学依据，为进一步开发抗HBV新药提供了坚实的基础，在抗HBV药物的研究开发工作中起着重要的作用。, 百拇医药
1 筛选抗HBV的化学药物
抗HBV的化学合成药物中，研究较多的是核苷类似物和某些抗生素类药物。朱永廉[2]从2.2.15细胞培养液中提取乙肝病毒DNA，用DNA印迹法分析β-L-2',3'-双脱氧-5-氟胞苷对乙肝病毒DNA复制的影响。发现该药对HBV具有较强的抑制作用(IC50为0.05μmol/L),而且在浓度高到足以抑制乙肝病毒复制达90%以上时，对细胞线粒体DNA合成并无影响,说明其抗HBV作用在体外有较强的选择性。但该作用是可逆的，在停药后12d，病毒复制即开始恢复。产生这种“反跳”现象可能由于该药物主要抑制DNA聚合酶(HBVDNAP)，而对其他的病毒复制中间体，如超螺旋DNA(cccDNA)作用甚微。停药后，病毒复制可以从cccDNA处重新启动，导致产生“反跳”。吴婷等[3]以2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg,HBVDNA及细胞存活率为观察指标，综合评价了诺西肽体外抗HBV效果。结果表明:诺西肽对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别>16和>4.8。Southern杂交结果显示：诺西肽在12.5μg/ml浓度下对细胞内HBVDNA的抑制率为26.4%。提示该药可能作用于病毒生活周期的后期mRNA翻译和蛋白质的加工阶段。此外，该药在抑制HBV抗原的同时，显示出明显的促细胞生长作用，提示该药应用于临床后可能发挥出抗HBV和保肝的双重功效。他们又以同样的指标，评价了天然多肽类抗生素恩拉霉素体外抗HBV效果[4]。结果表明，恩拉霉素对HBsAg和HBeAg的IC50分别为27和34μg/ml；TI均>4。Southern结果显示：50μg/ml恩拉霉素对细胞内游离HBVDNA抑制率为56.8%。
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2 筛选抗HBV的反义核酸
目前，基因治疗是一种很有发展前景的方法，反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASON)用于调控基因的表达已成为抗HBV研究的一个热点问题。姚志强等[5]应用2.2.15细胞证明:反义核酸抑制HBV基因表达具有序列特异性、剂量相关性、时效依赖性、修饰增强性、作用协同性、对宿主细胞无害性等特点。其中针对HBV mRNA SPⅡ增强子帽区、多聚腺苷信号区及S基因起始区的ASON抑制活性最高,对HBsAg抑制率可达85%～90%,对HBeAg抑制率也近50%～60%,反复用药后HBVDNA同样受到抑制。其后，有学者相继报道针对PolyA增加信号序列、HBV前C和C基因区以及HBV基因S区和C区的翻译起始位点的ASON对HBV表现出明显的抑制效果。
上述工作研究的均为寡核苷酸硫代磷酸酯(PS-ODN)。但在进一步深入实验之后，发现PS-ODN存在一些剂量依赖性的不良反应，如脾肿大，血小板减少等，这些不良反应的产生可能是由于寡核苷酸的多阴离子特性造成了其体内特异性不强，多器官分布。针对这种情况，许多学者着手对其进行修饰改造，以期提高作用靶向性，降低不良反应。文立民等人[6]证明经阳离子脂质体(lipofectin)介导后,反义寡核苷酸在加入2.2.15细胞30min后,大多进入细胞质,而且在10min以后,大部分迅速聚积于细胞核中,它们在细胞核及细胞质中可稳定存在12h以上。郭军等[7]人工合成了两种半乳糖多聚赖氨酸导向配体,与荧光素标记的互补于HBV mRNA多聚腺苷酸信号部分的21-聚反义硫代脱氧核苷酸(ASODN)电性结合,并与2.2.15细胞共同孵育。40min后配体组对HBsAg和HBeAg的抑制率为41%～47%和28%～31%,单纯ASODN组为11%和5%,3d后配体组为88%～89%和71%～74%，对照组为64%和53%。经分析,配体使2.2.15细胞荧光染色率达75.3%和83.8%，对照组为24.3%。后经体内结果证明：两种人工配体均具有导向ASODN入肝细胞的功能,进而明显提高ASODN抗HBV的活性。钟森等[8]针对HBV前C/C基因区设计合成了16聚硫代和脂肪链-硫代两种修饰的ASON,检测作用细胞的HBsAg，HBeAg以及HBVDNA的分泌情况。结果显示ASON在短时作用于细胞的情况下,脂肪链修饰的硫代ASON的抗病毒活性显著高于未经脂肪链修饰者(P<0.002和P<0.05)。提示脂肪链修饰是今后ASON药物设计和开发的一个新途径。
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各类干扰素为治疗HBV发挥了相当重要的作用。但越来越多的实验证明干扰素的治疗效果有限，有学者转而研究其他种蛋白质药物。邓涛等[9]根据乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的MHC-Ⅰ类分子结合的关键序列合成了2段抗原性多肽(PepⅠaa:18～27及PepⅡaa:141～151)，分别与转铁蛋白(Tf)、抗CD3的单克隆抗体(CD3McAb)和白细胞介素2(IL-2)联合体外诱导乙肝病毒抗原特异性细胞毒T细胞(HBV-CTLs)，考察其对HBV的特异性杀伤力。结果发现HBV-CTLs在出现针对2.2.15的特异性细胞毒活性,d14达高峰,分别为67%(PepⅠ+Tf+CD3McAb+IL-2)及55%(PepⅡ+Tf+CD3McAb+IL-2)。由于同时测定到Fas配体(FasL)的表达较高，并与一氧化氮(NO)的表达为正相关。作者认为Fas-FasL介导细胞凋亡可能是HBV-CTLs杀伤机制之一，NO可能参与了HBV-CTLs功能的调节。楼敏等[10]用化学偶联剂SPDP将鼠源性CD3与HBs单克隆抗体连接，得到HBs/CD3双特异性抗体。实验显示，HBs/CD3双特异性单克隆抗体能显著提高LAK细胞与2.2.15细胞结合率,而且能增强其对2.2.15细胞的杀伤力，该作用与抗体浓度相关，HBsAb浓度递增,细胞毒性作用随之增加。对细胞毒性作用的特异性研究表明：加入HBs/CD3BsAb后,LAK细胞对2.2.15细胞的杀伤力显著高于HepG-2和K562细胞组。结果表明，HBs/CD3双特异性抗体具有双向识别LAK细胞和2.2.15细胞的特性，可以特异地促进LAK细胞与靶细胞结合，发挥选择性细胞毒性作用。
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4 筛选抗HBV的中草药
临床上已经有不少应用中草药治疗乙型肝炎的观察，但是尚缺乏有关的实验依据。范涛等[11]对4种中草药制剂体外抗HBV活性及其机制进行了研究。发现复方黄芪浸膏水提取液对HBsAg和HBeAg的抑制率较高，但对HBVDNA无明显抑制,提示该药可能作用于病毒的转录、翻译和蛋白合成等环节或直接与病毒蛋白结合而致HBsAg及HBeAg滴度下降。文立民等[12]以培养上清液中HBsAg和HBeAg滴度作为评价天然药物抗HBV效果的指标，对板蓝根、苦味叶下珠和4种中药混合物的抗HBV作用进行了比较。结果显示,苦味叶下珠与4种中药的混合物抗HBV的作用较强，可望成为有潜力的抗HBV药物。刘庄等[13]则考察了不同品种、剂型和添加成分的叶下珠提取物抗HBV的作用。其中沱茶珍珠草抗HBV作用最明显，在浓度为500mg/L时对HBsAg的抑制率可达100%，而未显示出明显的细胞毒。同时还观察到叶下珠提取物对病毒颗粒的抑制作用不仅发生在转录前水平，对mRNA的翻译可能也有影响。他们又对动物药华蟾素体外抗HBV活性进行了研究[14]。结果显示，该药对HBsAg和HBeAg的ID50分别为0.08和0.07mg/ml，CD50为2.5mg/ml，HBsAg为31.3，HBeAg为35.7，而且它对细胞内HBVDNA及其复制中间体呈剂量依赖型抑制。张均倡等[15]用2.2.15细胞株模型评价了肝康对HBsAg，HBeAg，HBV-DNA的抑制效果。发现从用药到见效需要3～4d，之后可出现明显的量效依赖性抑制作用，维持3～5d后逐渐减弱、消失，同时发现病毒复制、分泌越旺盛，抑制作用越强。
目前，国外筛选的抗HBV药物主要集中在化学合成药物上，尤其是核苷类似物。该类药物主要作用于HBVDNAP，而未能抑制其他的复制中间体，造成停药后发生“反跳”，反义核酸可以与靶mRNA序列特异性结合，抑制HBV基因表达，从而达到治疗效果。
虽然2.2.15细胞株只是一个体外实验系统，脱离了机体中免疫系统对HBV产生影响的环境。但是该细胞模型以及其他已建立的细胞培养系统，为全面、准确评价药物抗HBV效果提供了科学依据，为进一步开发抗HBV新药提供了坚实的基础，在抗HBV药物的研究开发工作中起着重要的作用。, 百拇医药