屈建国 温瑞福 徐洪涛 洪涛 中华实验和临床病毒学杂志 1999年第4期第13卷 综述

    电子显微镜作为一种研究工具在核酸研究中已发挥很大作用并日益受到重视。1859年人们首先发现核酸为活体组织细胞核的主要组成成分，90年后又在电镜下观察到单个核酸分子，而Avery等于1944年发现核酸是遗传的分子基础后，更激起人们了解核酸物理结构的兴趣。1959年Aleinschmedt及Zahn建立了一种新的电镜技术，即细胞色素C展层技术(又称碱性蛋白膜技术及Kleinschmice-Zahn技术)，并成功地在电镜下观察到双链DNA(dsDNA)分子，开始了应用电子显微镜研究DNA结构和功能的新时代[1]。以后经过方法学上的不断改进，又发展了许多新的技术，广泛应用于DNA结构与功能以及蛋白质-DNA相互作用的研究。我们参阅了近三十多年的有关文献并结合本实验室从事核酸电镜技术研究的体会，就DNA电镜的常用技术及其基本应用加以介绍。

    1 DNA电镜样品制备方法

    1.1 细胞色素C展层技术(碱性蛋白膜技术)[2，3] 溶液中的DNA分子呈三维无规则超卷曲状态，电镜观察前必须将DNA分子变为二维伸展状态非聚集分子。细胞色素C展层技术的原理就是将DNA溶液与碱性蛋白(细胞色素C)混合，带负电的DNA分子非特异性吸附大量细胞色素C，而后者具有在水或低盐溶液表面变性形成单层膜的特性，这时缠绕其中的DNA分子也随之展开呈二维伸展状态。将变性剂(如甲酰胺等)加入展开液中，可以防止单链DNA分子内碱基非随机配对。细胞色素C展层技术不仅可以用于观察双链DNA分子(dsDNA)，也可用于观察单链DNA分子(ssDNA)，此时该方法也可称甲酰胺展层技术。展开液(上相液)中含0.1～0.5 μg/ml的DNA分子，0.1～0.25 mg/ml的细胞色素C，40%～60%的甲酰胺，缓冲液的pH为8.5。展开液沿斜面流至下相液(蒸馏水或10%甲酰胺，10 mM Tris*HCL, 1mM EDTA pH8.5)上展开，尔后用覆有支持膜的铜网取样。单链DNA分子用此法也能较好地展开，其直径稍细，形态较为曲折。下相液中甲酰胺浓度比上相液中低30%，缓冲液离子浓度为上相液中的10%。

    1.2 扩散方法[4] 扩散方法是碱性蛋白膜技术的一种变化形式，其原理是碱性蛋白在含DNA的下相液表面形成单层蛋白膜，DNA分子通过扩散运动与蛋白膜接触并吸附其上。该方法可以大大减缓展层过程中的剪切力，尤其适用于较长的DNA分子。其制样过程为：配制混液，将20 ng/ml的DNA，0.2M醋酸胺(pH6.0) ......