地塞米松对高氧肺损伤大鼠肺组织基质金属蛋白酶及其组织抑制剂表达的影响
【摘要】 目的 观察地塞米松对高氧暴露大鼠肺组织中基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)表达的影响，探讨地塞米松治疗高氧肺损伤的作用机制。方法 2周龄Wistar大鼠32只，随机分为空气组和高氧组(各16只)。高氧暴露7 d后，取两组大鼠各8只检测支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量和肺湿/干重比(W/D),并观察肺组织病理学改变。余16只大鼠行肺组织培养,空气组8只作为空气对照组，高氧组8只各设高氧对照组，高氧+地塞米松1×10-8、1×10-6和1×10-4 mol/L组，培养24 h后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达。结果 ①与空气组相比，高氧组肺组织出现水肿、出血、炎性细胞浸润；BALF中蛋白含量、W/D明显增高。②高氧对照组MMPs、TIMPs mRNA表达和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值较空气对照组明显增高。③地塞米松能剂量依赖性下调MMP-2、MMP-9 mRNA表达；对TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达有一定程度的抑制效应；随地塞米松浓度的增加，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值亦逐渐降低。结论 地塞米松下调MMPs mRNA表达，调节MMPs/TIMPs之间的失衡，可能是其减轻高氧肺损伤的机制之一。
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【关键词】 基质金属蛋白酶； 金属蛋白酶类； 高氧； 地塞米松
Study on effect of dexamethasone on the expression of matrix metalloproteinase and its tissue inhibitors in hyperoxia-induced lung injury
LIU Cheng-jun, XU Feng, KUANG Feng-wu, DANG Run, LU Zhong-yi, WANG Xing-yong.
PICU of Children's Hospital of Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014, China
Objective: To observe the effect of dexamethasone on the mRNA expression of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) in the lung tissue and to explore the protective mechanism of dexamethasone in hyeroxia-induced lung injury. Methods: Thirty-two two-week old Wistar rats were randomly divided into atmospheric-air group (n=16) and hyperoxia group (n=16). After 7 days of continuous exposure to high concentration O 2(≥95%), the lung wet/dry(W/D) ratio, the protein content in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and histopathological changes of the lung were measured in 16 rats(8 in each group). The lung tissue specimens of the other 16 rats were cultured, 8 among which served as stmospheric-air control group, the remainder in the hyperoxia group were divided into hyperoxia control group,hyperoxia+dexamethasone (1×10-8 mol/L) group, hyperoxia+dexamethasone (1×10-6 mol/L) group, and hyperoxia+dexamethasone (1×10-4 mol/L) group. Eight samples were examined in each group. After cultured for 24 hours, the lung tissue were collected and its mRNA expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: ①Pulmonary edema, hemorrhage and extensive inflammatory cells infiltration were observed in hyperoxia group, but no such changes were found in the atmospheric-air group. The lung W/D and the protein content in BALF in hyperoxia group were significantly higher than those in atmospheric air groups. ②The mRNA expressions of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and the ratio of MMP-2/TIMP-2, MMP-9/TIMP-1 were significantly higher in the hyperoxic group than those in the atmospheric-air group. ③Dexamethasone could down-regulate the mRNA expressions of MMP-2 and MMP-9 in a concentration dependant manner. The mRNA expressions of TIMP-1, TIMP-2 also could be reduced by dexamethasone. Decreasing ratios of MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 were found in correlation with increasing concentration of dexamethasone. Conclusion:: Dexamethasone can reduce the mRNA expressions of MMPs as well as regulate the balance of MMPs/TIMPs, which may be one of the mechanism of its protective effect on hyperoxia-induced lung injury.
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【Key words】 matrix metalloproteinase; metalloproteinase; hyperoxia; dexamethasone
高氧机械通气是治疗新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)的重要措施，但是长时间吸入高浓度氧又可以引起肺氧毒性损伤，导致肺间质纤维化和明显的肺发育障碍，是支气管肺发育不良(BPD)的主要致病因素之一(1)。研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)及其组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)在高氧肺损伤及其纤维化形成过程中发挥重要的作用(2)。地塞米松是一种糖皮质激素，对高氧肺损伤有一定的保护作用(3,4)，但其作用机制尚未完全阐明。我们通过已建立的高氧肺损伤大鼠动物模型，采用体外肺组织培养技术，观察不同浓度地塞米松对肺组织MMPs、TIMPs mRNA水平的影响，探讨地塞米松治疗高氧肺损伤的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型制备：
动物模型制备按参考文献(5)的方法进行。2周龄Wistar大鼠32只(由重庆医科大学动物实验中心提供)，随机分为空气组和高氧组(各16只)。高氧组置于有机玻璃氧仓中，持续输入氧气(2 L/min)，并连续行氧和二氧化碳(CO 2)浓度监测，保证氧浓度(体积分数)≥95%、CO 2体积分数≤5%(数字测氧仪CY100型，杭州立华仪器有限公司)；空气组置于同一室内空气中(氧浓度21%)。两组环境温度均控制在21~25 ℃，湿度为60%~70%,并于每日上午9时开箱10 min，添加饲料及饮水。
1.2 肺损伤指标的检测：高氧暴露7 d后，取高氧组和空气组大鼠各8只，腹腔注射乌拉坦麻醉后腹主动脉放血处死。开胸结扎右主支气管，取右中上肺，经体积分数为4%的甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下检查肺组织病理变化；取右下肺，轻轻擦干表面，立即称重记为肺湿重(W)。然后置于80 ℃烤箱内，48 h后称重记为肺干重(D)，计算W/D；以4 ℃生理盐水1 ml行左肺支气管肺泡灌洗，反复灌洗3次后回收，回收率达90%。支气管肺泡灌洗液(BALF)4 000 r/min(离心半径11 cm)离心10 min，取上清液测蛋白(Folin-酚试剂法)。
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1.3 无血清肺组织培养(6)：空气组和高氧组中另各8只动物麻醉后放血处死，无菌开胸，经肺动脉插管用无菌生理盐水冲净肺血。取肺组织剪成1 mm3小块，用预冷的DMEM/F12培养基洗涤3次，取30块左右置24孔培养板中。空气组8只动物为空气对照组，高氧组8只各设高氧对照组，高氧+地塞米松1×10-8、1×10-6和1×10-4 mol/L组，每组8孔，分别加入含不同浓度地塞米松的无血清DMEM/F12培养基(每毫升培养基含100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素)，然后置于体积分数为5%的CO 2培养箱中37 ℃条件下培养24 h。收集肺组织，置于-70 ℃冰箱保存待测。14 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMPs、TIMPs mRNA水平：用Tripure试剂(美国Promega公司)从肺组织中提取总RNA，紫外分光光度仪测定吸光度A 260/A 280的比值来衡量RNA的纯度在190~200。引物按参考文献(7)的方法由上海生工生物工程公司合成。引物序列：MMP-2上游：5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游：5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′；MMP-9上游：5′-GCAGGAGAGGAAGCTG AGTC-3′，下游：5′-TCATGGTGAGAACCGAAGC-3′；TIMP-1上游：5′-CTCATCGCGGGCCGTTTAAG-3′，下游：5′-GAAGGCTTCGGGTCATCGAG-3′；TIMP-2上游：5′-GGACCTGACAAGGACATCG-3′，下游：5′-CGCAAGAACCATCACTTCTC-3′。PCR反应条件：94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，74 ℃延伸1 min，共35个循环。模板量及循环次数经预检测均在线性范围内。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，电泳条带用凝胶成像分析系统(美国BIO-RED公司)作积分吸光度值的测定，用来与内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的吸光度值比值变化来表示mRNA的相对含量。
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1 5 统计学处理：统计学处理由SPSS 110统计软件完成。数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠肺组织病理学变化：高氧组大鼠肺组织出现明显水肿、出血、炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，巨噬细胞增多，同时肺组织结构紊乱；而空气组肺组织结构正常。
2 2 大鼠肺W/D及BALF中蛋白含量变化(表1)：高氧组肺W/D及BALF蛋白含量均明显增高，与空气组比较有显著性差异(P均<0001)。
2 3 地塞米松对大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1以及TIMP-2 mRNA表达水平的影响(表2)：与空气对照组相比，高氧对照组的MMPs和TIMPs mRNA表达以及MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值明显增高(P均<0.05)。地塞米松能剂量依赖性下调MMP-2、MMP-9 mRNA表达(高氧+地塞米松各组与高氧对照组相比,P均<0.05)；对TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达亦均有一定程度的抑制作用，仅在高氧+地塞米松1×10-4 mol/L组与高氧对照组相比差异有显著性(P<0.05)；而MMP-2/TIMP-2及MMP-9/TIMP-1比值随地塞米松浓度增加逐渐降低。
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3 讨 论
3.1 高氧肺损伤与MMPs：高氧肺损伤早期特征性改变是肺泡毛细血管基底膜断裂，肺泡炎性水肿，继之出现细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)沉积、纤维母细胞增生和肺纤维化(2)。其发病机制尚未完全阐明。目前认为，ECM代谢紊乱参与了急、慢性肺损伤的病理生理过程。MMPs是降解ECM成分最重要的一类蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9主要降解基底膜的主要结构成分Ⅳ型胶原等，二者在肺泡基底膜的降解和重塑方面发挥重要的作用；TIMP-2、TIMP-1分别是其特异性的组织抑制剂，能有效地抑制MMPs的活性，参与调节ECM的合成和降解。本组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在空气对照组肺组织中都有少量表达，表明它们均参与了正常肺组织ECM的代谢。高氧对照组肺组织中MMP-2、MMP-9、 TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达均明显增加，但MMP-2、MMP-9增加明显，造成MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值增高，MMPs活性增强。MMPs过度激活与表达，致大量ECM成分如Ⅳ型胶原、弹性蛋白降解，基底膜严重破坏，肺通透性增加，炎症细胞浸润，从而导致弥漫性肺泡损伤(8)。
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3.2 地塞米松对肺组织中MMPs、TIMPs mRNA表达的影响：地塞米松对高氧肺损伤有一定的保护作用(3,4)，是目前治疗支气管肺发育不良的常用药物之一，但对其用药方式、持续时间、药效及不良反应等方面均存在争议(9,10)，且其作用机制还不完全清楚。Frank(11)认为地塞米松能促进胎鼠肺表面活性物质的合成和抗氧化酶(AOE)系统的成熟，保护新生鼠免受氧毒性的损害。也有学者认为，地塞米松可通过抑制肺巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达(3)，或上调抗炎细胞因子IL-10的表达，调节致炎因子和抗炎因子之间的平衡(4)，从而减轻高氧肺损伤。近年来研究发现，糖皮质激素可以影响MMPs、TIMPs的表达，调节MMPs/TIMPs的失衡，阻止病情的进展。Harkness等(12)研究表明，地塞米松在中枢神经系统能抑制血管内皮细胞MMP-2、MMP-9的表达和活性，降低血脑屏障的损害。Kumagai等(13)证实，MMP-9的表达降低和低水平MMP-9/TIMP-1比值可降低肺基底膜损害，减轻炎症反应，抑制异常ECM重塑。本研究显示，地塞米松能剂量依赖性下调肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达，对TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达抑制作用较MMPs弱，并且随着地塞米松干预浓度增加，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值逐渐降低,MMPs/TIMPs之间恢复平衡。因此推测地塞米松减轻高氧肺损伤机制之一可能是通过下调MMPs mRNA的表达，调节MMPs/TIMPs之间的失衡来实现的。综上所述，高氧时MMPs过度表达及MMPs/TIMPs失衡可能是肺损伤的重要机制之一。地塞米松可下调MMPs表达，调节MMPs/TIMPs间失衡，可治疗高氧肺损伤。但是地塞米松可引起感染、血压升高、脑及肺发育受阻等不良反应，限制了其临床应用(10,11)。开发一些新的、不良反应小的MMPs抑制剂应用于临床，是今后研究的方向。
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参考文献
1 Saugstad O D.Bronchopulmonary dysplasia and oxidative stress:are we closer to an understanding of the pathogenesis of BPD(J)? Acta Paediatr，1997,86:1277-1282.
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3 Lindsay L,Olver S J,Freeman S L,et al.Modulation of hyperoxia-induced TNF-α expression in the newborn rat lung by thalidomide and dexamethasone(J). Inflammation，2000，24:347-356.
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罗自强，冯丹丹，周伏文，等.低浓度内皮素-1对活性氧抑制肺表面活性物质脂质合成的保护(J).生理学报，2002,54:89-93.
7 Zhao Y G,Xiao A Z,Cao X M,et al.Expression of matrix metalloproteinase -2,-9 and tissue inhibitors of metalloproteinase -1,-2,-3 mRNAs in rat uterus during early pregnancy(J).Mol Reprod Dev，2002,62:149-158.
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8 Gushima Y,Ichikado K,Suga M,et al.Expression of matrix metalloproteinas
es in pigs with hyperoxia-induced acute lung injury(J).Eur Respir J,2001,18:827-837.
9 Grier D G,Halliday H L.Corticosteroids in the prevention and management of bronchopulmonary dysplasia(J).Semin Neonatol，2003,8:83-91.
10 Cole C H.Postnatal glucocorticosteroid therapy for treatment and prevention of neonatal chronic lung disease(J).Expert Opin Investig Drugs,2000,9:53-67.
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11 Frank L.Prenatal dexamethasone treatment improvement survival of newborn rats during prolonged high O 2 exposure(J).Pediatr Res,1992,32:215-221.
12 Harkness K A,Adamson P,Sussman J D,et al.Dexamethasone regulation of matrix metalloproteinase expression in CNS vascular endothelium(J).Brain，2000,123:698-709.
13 Kumagai K,Ohno I,Imait K,et al.The involvement of matrix metalloproteinase in basement injury in a murine model of acute allergic airway inflammation(J).Clin Exp Allergy,2002，32:1527-1534.
作者单位：400014 重庆医科大学儿童医院PICU
作者简介：刘成军(1969-),男(汉族),湖北省当阳县人,医学硕士,主治医师。
刘成军 许峰 匡凤梧 党润 卢仲毅 王兴勇, 百拇医药
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【关键词】 基质金属蛋白酶； 金属蛋白酶类； 高氧； 地塞米松
Study on effect of dexamethasone on the expression of matrix metalloproteinase and its tissue inhibitors in hyperoxia-induced lung injury
LIU Cheng-jun, XU Feng, KUANG Feng-wu, DANG Run, LU Zhong-yi, WANG Xing-yong.
PICU of Children's Hospital of Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014, China
Objective: To observe the effect of dexamethasone on the mRNA expression of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) in the lung tissue and to explore the protective mechanism of dexamethasone in hyeroxia-induced lung injury. Methods: Thirty-two two-week old Wistar rats were randomly divided into atmospheric-air group (n=16) and hyperoxia group (n=16). After 7 days of continuous exposure to high concentration O 2(≥95%), the lung wet/dry(W/D) ratio, the protein content in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and histopathological changes of the lung were measured in 16 rats(8 in each group). The lung tissue specimens of the other 16 rats were cultured, 8 among which served as stmospheric-air control group, the remainder in the hyperoxia group were divided into hyperoxia control group,hyperoxia+dexamethasone (1×10-8 mol/L) group, hyperoxia+dexamethasone (1×10-6 mol/L) group, and hyperoxia+dexamethasone (1×10-4 mol/L) group. Eight samples were examined in each group. After cultured for 24 hours, the lung tissue were collected and its mRNA expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: ①Pulmonary edema, hemorrhage and extensive inflammatory cells infiltration were observed in hyperoxia group, but no such changes were found in the atmospheric-air group. The lung W/D and the protein content in BALF in hyperoxia group were significantly higher than those in atmospheric air groups. ②The mRNA expressions of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and the ratio of MMP-2/TIMP-2, MMP-9/TIMP-1 were significantly higher in the hyperoxic group than those in the atmospheric-air group. ③Dexamethasone could down-regulate the mRNA expressions of MMP-2 and MMP-9 in a concentration dependant manner. The mRNA expressions of TIMP-1, TIMP-2 also could be reduced by dexamethasone. Decreasing ratios of MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 were found in correlation with increasing concentration of dexamethasone. Conclusion:: Dexamethasone can reduce the mRNA expressions of MMPs as well as regulate the balance of MMPs/TIMPs, which may be one of the mechanism of its protective effect on hyperoxia-induced lung injury.
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【Key words】 matrix metalloproteinase; metalloproteinase; hyperoxia; dexamethasone
高氧机械通气是治疗新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)的重要措施，但是长时间吸入高浓度氧又可以引起肺氧毒性损伤，导致肺间质纤维化和明显的肺发育障碍，是支气管肺发育不良(BPD)的主要致病因素之一(1)。研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)及其组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)在高氧肺损伤及其纤维化形成过程中发挥重要的作用(2)。地塞米松是一种糖皮质激素，对高氧肺损伤有一定的保护作用(3,4)，但其作用机制尚未完全阐明。我们通过已建立的高氧肺损伤大鼠动物模型，采用体外肺组织培养技术，观察不同浓度地塞米松对肺组织MMPs、TIMPs mRNA水平的影响，探讨地塞米松治疗高氧肺损伤的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型制备：
动物模型制备按参考文献(5)的方法进行。2周龄Wistar大鼠32只(由重庆医科大学动物实验中心提供)，随机分为空气组和高氧组(各16只)。高氧组置于有机玻璃氧仓中，持续输入氧气(2 L/min)，并连续行氧和二氧化碳(CO 2)浓度监测，保证氧浓度(体积分数)≥95%、CO 2体积分数≤5%(数字测氧仪CY100型，杭州立华仪器有限公司)；空气组置于同一室内空气中(氧浓度21%)。两组环境温度均控制在21~25 ℃，湿度为60%~70%,并于每日上午9时开箱10 min，添加饲料及饮水。
1.2 肺损伤指标的检测：高氧暴露7 d后，取高氧组和空气组大鼠各8只，腹腔注射乌拉坦麻醉后腹主动脉放血处死。开胸结扎右主支气管，取右中上肺，经体积分数为4%的甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下检查肺组织病理变化；取右下肺，轻轻擦干表面，立即称重记为肺湿重(W)。然后置于80 ℃烤箱内，48 h后称重记为肺干重(D)，计算W/D；以4 ℃生理盐水1 ml行左肺支气管肺泡灌洗，反复灌洗3次后回收，回收率达90%。支气管肺泡灌洗液(BALF)4 000 r/min(离心半径11 cm)离心10 min，取上清液测蛋白(Folin-酚试剂法)。
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1.3 无血清肺组织培养(6)：空气组和高氧组中另各8只动物麻醉后放血处死，无菌开胸，经肺动脉插管用无菌生理盐水冲净肺血。取肺组织剪成1 mm3小块，用预冷的DMEM/F12培养基洗涤3次，取30块左右置24孔培养板中。空气组8只动物为空气对照组，高氧组8只各设高氧对照组，高氧+地塞米松1×10-8、1×10-6和1×10-4 mol/L组，每组8孔，分别加入含不同浓度地塞米松的无血清DMEM/F12培养基(每毫升培养基含100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素)，然后置于体积分数为5%的CO 2培养箱中37 ℃条件下培养24 h。收集肺组织，置于-70 ℃冰箱保存待测。14 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMPs、TIMPs mRNA水平：用Tripure试剂(美国Promega公司)从肺组织中提取总RNA，紫外分光光度仪测定吸光度A 260/A 280的比值来衡量RNA的纯度在190~200。引物按参考文献(7)的方法由上海生工生物工程公司合成。引物序列：MMP-2上游：5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游：5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′；MMP-9上游：5′-GCAGGAGAGGAAGCTG AGTC-3′，下游：5′-TCATGGTGAGAACCGAAGC-3′；TIMP-1上游：5′-CTCATCGCGGGCCGTTTAAG-3′，下游：5′-GAAGGCTTCGGGTCATCGAG-3′；TIMP-2上游：5′-GGACCTGACAAGGACATCG-3′，下游：5′-CGCAAGAACCATCACTTCTC-3′。PCR反应条件：94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，74 ℃延伸1 min，共35个循环。模板量及循环次数经预检测均在线性范围内。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，电泳条带用凝胶成像分析系统(美国BIO-RED公司)作积分吸光度值的测定，用来与内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的吸光度值比值变化来表示mRNA的相对含量。
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1 5 统计学处理：统计学处理由SPSS 110统计软件完成。数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠肺组织病理学变化：高氧组大鼠肺组织出现明显水肿、出血、炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，巨噬细胞增多，同时肺组织结构紊乱；而空气组肺组织结构正常。
2 2 大鼠肺W/D及BALF中蛋白含量变化(表1)：高氧组肺W/D及BALF蛋白含量均明显增高，与空气组比较有显著性差异(P均<0001)。
2 3 地塞米松对大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1以及TIMP-2 mRNA表达水平的影响(表2)：与空气对照组相比，高氧对照组的MMPs和TIMPs mRNA表达以及MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值明显增高(P均<0.05)。地塞米松能剂量依赖性下调MMP-2、MMP-9 mRNA表达(高氧+地塞米松各组与高氧对照组相比,P均<0.05)；对TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达亦均有一定程度的抑制作用，仅在高氧+地塞米松1×10-4 mol/L组与高氧对照组相比差异有显著性(P<0.05)；而MMP-2/TIMP-2及MMP-9/TIMP-1比值随地塞米松浓度增加逐渐降低。
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3.1 高氧肺损伤与MMPs：高氧肺损伤早期特征性改变是肺泡毛细血管基底膜断裂，肺泡炎性水肿，继之出现细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)沉积、纤维母细胞增生和肺纤维化(2)。其发病机制尚未完全阐明。目前认为，ECM代谢紊乱参与了急、慢性肺损伤的病理生理过程。MMPs是降解ECM成分最重要的一类蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9主要降解基底膜的主要结构成分Ⅳ型胶原等，二者在肺泡基底膜的降解和重塑方面发挥重要的作用；TIMP-2、TIMP-1分别是其特异性的组织抑制剂，能有效地抑制MMPs的活性，参与调节ECM的合成和降解。本组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在空气对照组肺组织中都有少量表达，表明它们均参与了正常肺组织ECM的代谢。高氧对照组肺组织中MMP-2、MMP-9、 TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达均明显增加，但MMP-2、MMP-9增加明显，造成MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值增高，MMPs活性增强。MMPs过度激活与表达，致大量ECM成分如Ⅳ型胶原、弹性蛋白降解，基底膜严重破坏，肺通透性增加，炎症细胞浸润，从而导致弥漫性肺泡损伤(8)。
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3.2 地塞米松对肺组织中MMPs、TIMPs mRNA表达的影响：地塞米松对高氧肺损伤有一定的保护作用(3,4)，是目前治疗支气管肺发育不良的常用药物之一，但对其用药方式、持续时间、药效及不良反应等方面均存在争议(9,10)，且其作用机制还不完全清楚。Frank(11)认为地塞米松能促进胎鼠肺表面活性物质的合成和抗氧化酶(AOE)系统的成熟，保护新生鼠免受氧毒性的损害。也有学者认为，地塞米松可通过抑制肺巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达(3)，或上调抗炎细胞因子IL-10的表达，调节致炎因子和抗炎因子之间的平衡(4)，从而减轻高氧肺损伤。近年来研究发现，糖皮质激素可以影响MMPs、TIMPs的表达，调节MMPs/TIMPs的失衡，阻止病情的进展。Harkness等(12)研究表明，地塞米松在中枢神经系统能抑制血管内皮细胞MMP-2、MMP-9的表达和活性，降低血脑屏障的损害。Kumagai等(13)证实，MMP-9的表达降低和低水平MMP-9/TIMP-1比值可降低肺基底膜损害，减轻炎症反应，抑制异常ECM重塑。本研究显示，地塞米松能剂量依赖性下调肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达，对TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达抑制作用较MMPs弱，并且随着地塞米松干预浓度增加，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值逐渐降低,MMPs/TIMPs之间恢复平衡。因此推测地塞米松减轻高氧肺损伤机制之一可能是通过下调MMPs mRNA的表达，调节MMPs/TIMPs之间的失衡来实现的。综上所述，高氧时MMPs过度表达及MMPs/TIMPs失衡可能是肺损伤的重要机制之一。地塞米松可下调MMPs表达，调节MMPs/TIMPs间失衡，可治疗高氧肺损伤。但是地塞米松可引起感染、血压升高、脑及肺发育受阻等不良反应，限制了其临床应用(10,11)。开发一些新的、不良反应小的MMPs抑制剂应用于临床，是今后研究的方向。
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作者单位：400014 重庆医科大学儿童医院PICU
作者简介：刘成军(1969-),男(汉族),湖北省当阳县人,医学硕士,主治医师。
刘成军 许峰 匡凤梧 党润 卢仲毅 王兴勇, 百拇医药