c-fos反义寡核苷酸减弱蜜蜂毒诱导的前速激肽原A mRNA在脊髓后角神经元的表达
作者：王文 武胜昔 王亚云 倪同尚 朱敏 李云庆
单位：第四军医大学基础部解剖学教研室 梁NB022琚脑研究中心，西安 710032
关键词：c-fos；前速激肽原A；反义寡核苷 酸；伤害性感受；脊髓；原位杂交；大鼠
解剖学报00zk15
【摘要】目的 探讨Fos蛋白对前原速激肽A(PPTA)基因表达的调节作 用。方法 免疫组织化学和原位杂交组织化学技术。结果 足底皮下注入蜜蜂毒引起持续、单向性的痛行为反应，导致Fos蛋白在刺激侧脊髓 背角神经元的表达以及PPTA mRNA阳性神经元的数量增加。椎管内给予c-fos 反意寡核苷酸(ASO)明显抑制蜜 蜂毒诱导的痛反应和减少脊髓背角Fos蛋白和PPTA mRNA阳性神经元的数量。椎管内给予盐水 和c-fos正义寡核苷酸(SO)则无影响。结论 Fos可 能参与伤害性刺激诱 导的脊髓背角神经元PPTA mRNA的表达上调，在外周伤害性信息的传递中可能起着重要的作用。
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【中图分类号】R971.2 【文献标识码】A 【文章编号】0592-1356(2000)-增-57
c-fos ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE REDUCES BE E VENOM-INDUCED PPTA mRNA EXPRESSION IN THE NEURONS OF SPINAL DORSAL HORN
WANG Wen， WU Sheng-xi， WANG Ya-yun，NI Tong-shang，ZHU Min，LI Yun -qing*
(Department of Anatomy and K.K.Leiung Brain Research Centre，the Fourth Military Medical University， Xi＇an 710032，China)
, 百拇医药 【Abstract】Objective To investigate the roles of Fos protei n in the regulation of prepro tachykinin A (PPTA)gene expression.Metho d s Intraplantar injection of bee venom (BV) was used as a pain model.Immu n ohistchemistry and in situ hybridization were performed to obser ve the effects of intrathecal pretreatment of c-fos antisense oligodeoxynucleotid e (ASO) to the expr ession of Fos protein and PPTA mRNA expression in the spinal dorsal horn.Results Administration of BV into the plantar surface produced a ton i c， monophasic nociceptive response，induced Fos expression in the neurons of th e ipsilateral spinal dorsal horn and increased the number of PPTA mRNA Positive ne urons.Intrathecal pretreatment with c-fos ASO not only significantl y inhibited t he BV-induced nociceptive response but also reduced the number of Fos and PPTA mRNA positive neurons in the spinal dorsal horn.Conclusions F os might play important roles in the processing of noxious information and take pa rt in the noxious stimulation-induced upregulation of PPTA mRNA expression in t he neurons of spinal dorsal horn.
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【Key words】c-fos;Preprotachykinin A；Antisense oligodeoxyn ucleotide;Nociception;Spinal cord;in situ hybridization histochimist ry;Rat P物质(SP)是外周的致痛物质之一，在伤害性信息的传递过程中起着重要 的作用。前速激肽 原A (PPTA)是SP的前体。以往的研究观察到皮下注射福尔马林、角叉菜胶、完全弗氏佐剂等 多种伤害性刺激均可引起脊髓背角浅层神经元表达PPTA mRNA 的水平上调[1，2] ，提示存在外周伤害性刺激对脊髓背角浅层神经元的跨突触激活机制。但是参与背角神经元 内PPTA mRNA 表达调节的因素尚不清楚。我们的研究观察到外周伤害性刺激条件下，刺激 侧脊髓背角内PPTA mRNA 阳性神经元同时表达Fos蛋白[3]，提示作为转录因子的F os 蛋白可能也参与PPTA基因的转录调节。为进一步验证此推测，本研究利用反义寡核苷酸(ASO )技术结合形态学方法，在足底注射蜜蜂毒(BV)致痛的大鼠模型上观察了椎管内给予c-fos ASO对PPTA mRNA 在大鼠脊髓背角神经元表达的影响。
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材料和方法
1.实验动物
健康成年雄性SD大鼠22只，体重180～220g，每只动物单独饲养于塑料盒(22～26℃)中。为 了保持其生物节律，实验室每日晨8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00熄灯，行为学实 验均在9：00～18：30间进行。实验前5d每日将大鼠置于实验观察箱中 30 min，使之适应。 大鼠随机分组，第1组(n=11)用于行为学和免疫组织化学检测；第2组(n=11)用于行为学和原位杂交组织化学检测。
2.反义寡核苷酸和鞘内置管术
c-fos寡核苷酸由上海 Sangon 公司合成，全碱基硫代磷酸修饰。反义寡核 苷酸(ASO)和正义 寡核苷酸(SO)的序列分别为：5’-GAA CAT CAT GGT CGT-3’和5’-ACG ACC ATG ATG TT C-3’。
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大鼠经氯氨酮50～100 mg/kg麻醉后，从背侧C7水平沿中线向尾侧切开并去除下胸椎椎板 ， 剪开硬脊膜，经蛛网膜下腔向尾侧置入聚乙烯PE-10导管(日本Natume公司)至腰膨大(L 4～ L5)。然后经导管外口注入50μl无菌生理盐水，见硬脊膜破口处有气泡及脑脊液溢出，即 封外口。外露部分固定于皮肤。术后3d，选择状态良好、无活动障碍的动物进行实验。实验 完毕后解剖动物，以确定鞘内导管的位置。
3.BV注射、鞘内给药及行为学观察
用1 ml注射器快速将BV(4g/L)注射入大鼠一侧后肢足底中心皮下。在给予BV前4h，分别鞘 内注射生理盐水(10μ1，n=6)、c-fos SO (50μg/10μl，n=8)和 c-fos ASO (50μg/10μl，n=8)。推进速度为0.5μ1/s。
将30cm×30cm×30cm的透明有机玻璃箱置于高于实验台50 cm的架子上，实验前动物均在实 验 箱中适应30 min以上。大鼠一侧后肢足底中心皮下注入BV后立即将其放回实验箱开始检测， 记录自BV注射起1h内每5min 的自发缩足反射次数。
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4.免疫组织化学染色及原位杂交步骤
第一组大鼠(n=11)在BV注射2h后，以戊巴比妥钠(40mg/kg，i.p)麻醉，常规 灌注取材。取腰 段(L4～L5)脊髓置上述固定液中后固定4h(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB中 过夜(4℃)。冠状冰冻切片(厚30μm)。隔2张取1片，共分3套收集。第1套切片经0.01 mol /L PBS清洗后，用兔抗Fos血清(1：1 000，中山公司) 室温孵育过夜；ABC 法呈色，光镜观 察并摄片。用正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，结果呈阴性。第3套切片进行Nissl染色 ，以确定脊髓灰质分层。
第2组大鼠(n=11)在蜜蜂毒注射20h后，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p)麻醉 。断头后快速取腰 段(L4～L5)脊髓，立即包埋于干冰粉末中。恒冷箱切片(厚14μm)。切片贴于经明胶处 理的载玻片上，置 -70℃冰箱中保存备用。实验所用PPTA探针为寡核苷酸探针，含30个碱 基，其序列与大鼠脑内相应mRNA的一部分(175～204号碱基)互补[4]。探针用3’末 端标 记法及[α-35S]dATP(>1 000 Ci/mmol，Amersham)标记。标记探针的特异放 射活性 为1.2×109dpm/μg。切片快速干燥后依次用4%多聚甲醛、0.1 mol/L PB及杂交 前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)处理。杂交时将200μl杂交液[ 含4×SSC、50%甲 酰胺 、0.025%tRNA、10%硫酸苏糖、1×Denhardt液(含0.02%牛血清蛋白、0.02% Ficol 400、0.02% PVP K-30)]，15μl DTT及标记探针(6～9×106dpm/载玻片)滴于切片表面 ， 置湿盒中于40℃孵育48h。杂交后，用1×SSC冲洗(55℃，3×20min)，最后将LM-l型乳胶(A m ersham)涂于切片表面，暗盒中曝光(4℃)。4周后，用Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定 影液定影，1%硫堇复染。脱水、透明、封片，光镜下明、暗视野观察并摄片。
, 百拇医药
每只大鼠均选取6张切片分别进行Fos及PPTA mRNA阳性细胞的计数。行为学测定及细胞计数 的数据均为
±s表示，应用ANOVA检验作统计学分 析，P<0.05时具有显著性统计学意义。
结 果
1.行为学检测结果
足底皮下注入BV可诱致持续、单向性痛行为反应(包括缩足反射和抬足/舔足行为)，且持续1 ～2h以上。鞘内预先注入等体积的盐水、SO和ASO后，BV诱导的每5 min平均缩足次数见图1 。A SO处理使BV诱导的缩足反应显著降低(P<0.01)，与盐水组相比降低了54. 2%。SO处理使缩足反射轻度降低，但无统计学差异(P>0.05)。
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图1 c-fos ASO、SO或生理盐水组足底注 射BV后大鼠1h内每5min平均缩足次数。**与SO组及盐水组比较，P<0.01
Fig.1 Column graph showing the average flinches per 5 min during 1h observation period after BV injection with pretreatment of c-fos ASO，SO or sa li ne.**P<0.01，compared with SO group and saline group.
2.免疫组织化学染色结果
足底皮下注射BV 2h后，在注射侧L4～L5脊髓背角观察到大量Fos阳性神经元。阳性神 经 元主要位于背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，在Ⅲ～Ⅴ层也有散在分布。椎管内预先给予盐水、SO和AS O后，背角浅层Fos阳性神经元的数量见附表。与盐水组和SO组相比，c-fos ASO使背角浅层Fos阳性神经元的数量明显减少(图2)。
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附表 鞘内注射盐水、c-fos SO和ASO对BV 诱导的脊髓背角浅层Fos和PPTA mRNA表达的影响((±s)
Table Effects of intrathecal pretreatment with saline，c-fos SO and ASO to the ex pression of Fos and PPTA mRNA in the superfacial layers of the spinal dorsal h orn induced BV injection (±s)
盐水
saline
c-fos正义寡核苷酸
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c-fos S O
c-fos反义寡核苷酸
c-fos ASO
Fos阳性神经元(positive neurons)
57.8±12.1
53.4±10.3
16.2±6.7*
PPTA mRNA阳神神经元(positive neurons)
35.1±10.6
33.2±9.4
20.5±7.8**
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*P<0.01，**P<0.05， 与盐水和SO组相比(compared with saline group and SO group).
3.原位杂交组织化学反应的结果
BV注射也增强了PPTA mRNA 在刺激侧脊髓背角浅层神经元中的表达。在BV注射后20h，注射 侧脊髓背角浅层PPTA mRNA 阳性神经元的数量达到35.5±11.4。椎管内预先给予ASO后， 背角浅层PPTA mRNA阳性神经元的数量明显下降，为20.5±7.8，与盐水组(35.1±10.6) 和SO组(33.2±9.4)相比有显著性差异(附表，图2)。另外，ASO组脊髓背角PPTA mRNA阳性 神经元杂交信号强度也降低(图2)。
讨 论
本研究观察到足底注射BV诱导了脊髓背角神经元Fos蛋白的表达以及PPTA mRNA表达的上调， 这 与以往用其他伤害性刺激模型得到的结果一致[1，2，5]。鞘内给予c-fo s ASO不仅显著 抑制脊髓背角浅层Fos蛋白的表达，而且明显减弱背角浅层PPTA mRNA神经元的的数量。c-f os ASO明显抑制足底注射BV引起的大鼠痛反应，给予盐水和c-fos S O对大鼠的痛反应没有明 显影响。上述结果提示，c-fos ASO对大鼠痛反应的抑制可能是由于其对脊 髓背角Fos蛋白表 达的抑制，进而减弱背角神经元PPTA mRNA的表达所致，表明Fos蛋白和PPTA参与介导了皮下 注射BV诱导的痛反应。
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本研究所用的反义寡核苷酸技术已在神经科学研究领域得到广泛的应用，该方法可以方便 地 观察单个蛋白、递质的功能[6]。本实验中采用的硫代磷酸修饰反义寡核苷酸探针 具有 较好的抗降解能力，半衰期长，适用于在体实验。同时采用盐水和正义寡核苷酸作对照，排 除了手术因素的影响以及非特异性效应，增强了结果的客观性和可靠性。本研究中应用c-f os ASO的剂量及用药时程来自我们的预实验及他人的研究结果[7，8]，在该 给药条件下( 50μg，4h)，c-fos ASO 可以发挥其最大的对Fos蛋白表达的抑制效应。我 们在既往实验中观 察到足底注射BV 4h，脊髓后角PPTA mRNA阳性神经元的数量即增加，24h后达到峰值。本研 究选择注射BV后20h取材观察PPTA mRNA的变化是为了保证c-fos ASO对它的 最大抑制效应。
c-fos基因是早期即刻癌基因家族中的一员，多种刺激条件均可引起Fos蛋 白的表达。Fos蛋 白与其他早期即刻其因，如c-jun的表达产物Jun能形成异源二聚体，作为 转录调节因子促进 靶基因的转录，在细胞的信号转导中起重要作用[8]。形态学的研究观察到在外周 福 尔马林刺激条件下，脊髓背角内约80%～90%前强啡肽原(PPD)及前脑啡肽原(PPE) mRNA阳性 神经元同时表达Fos 蛋白[9，10]。分子生物学研究证明[11]在PPD和PPE 基因中存 在Fos蛋白的特异性结合位点，当Fos蛋白和这一段序列结合后即能促进PPD及PPE基因的转录 ，从而使PPD和PPE mRNA在脊髓背角神经元中的表达增强。我们以往的研究观察到在外周伤 害性刺激作用下，脊髓背角浅层约77.9%的 PPTA mRNA阳性神经元表达Fos蛋白，提示Fos蛋 白可能参与PPTA转录水平的调节[2]。本研究观察到鞘内注射c-fos ASO明显抑制BV诱导 的脊髓背角Fos蛋白的表达和减少PPTA mRNA阳性神经元的数量，支持上述推测。外周的伤害 性刺激可能跨突触激活脊髓背角神经元Fos蛋白的表达，Fos蛋白进一步影响PPTA基因的转录 ，使这些神经元PPTA mRNA的表达上调，从而参与伤害性信息向上位脑结构的传递。进一步 的工作则需利用分子生物学手段在Fos蛋白对PPTA基因的转录调节机制方面开展深入研究。
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本文照片的制作得到原悦萍同志的协助，谨致谢意。
图2 鞘内注射生理盐水(A，D)、c-fos SO(B，E)或ASO(C,F)组BV注射侧大鼠 脊髓背角浅层FOS蛋白(A，B，C)和PPTA mRNA(D,E,F)阳性神经元的分布。标尺示100μm[ ZK)〗
Fig.2 Expression of FOS(A,B,C) and PPTA mRNA(D,E,F) in the neurons of su perficial laminae of the spinal dorsal horn ipsilateral to the
BV injection in saline g ro up(A,D),c-fos SO group(B,E) or ASO group(C,F).Bar＝100μm
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【基金项目】国家杰出青年科学基金资助项目(39625011)、国家重 点基础研究规划 “脑功能和脑重大疾病的基础研究”(G1999054000)和高等院校骨干教师资助项目
【作者简介】王文(1975—)，男(汉族)，四川省都江堰市人，硕 士研究生
参考文献
[1]Minami M，kuraishi Y， Fawamura M，et al.Enhanceme nt of preprotachykinin A gen e expression in the rat spinal cord:possible involvement of substance P-contain ing spinal neurons in nociception[J]Neurosci Lett，1989，88(1):105-110.
[2]Noguchi K，Ruda MA.Gene regulation in an ascending nociceptive pathw ay:inflam mation induced increase in preprotachykinin mRNA in rat lamina I spinal prejecti on neurons [J].J Neurosci，1992，12(7):2563-2572.
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[3]王亚云，武胜昔，李云庆，等.外周炎性刺激条件下大鼠脊髓背角中PPTA mRNA 和Fos阳性神经元的分布.中国疼痛医学杂志，1998，4(2)：106-110.
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【收稿日期】20000-07-04 【修回日期】2000-08-03, 百拇医药
单位：第四军医大学基础部解剖学教研室 梁NB022琚脑研究中心，西安 710032
关键词：c-fos；前速激肽原A；反义寡核苷 酸；伤害性感受；脊髓；原位杂交；大鼠
解剖学报00zk15
【摘要】目的 探讨Fos蛋白对前原速激肽A(PPTA)基因表达的调节作 用。方法 免疫组织化学和原位杂交组织化学技术。结果 足底皮下注入蜜蜂毒引起持续、单向性的痛行为反应，导致Fos蛋白在刺激侧脊髓 背角神经元的表达以及PPTA mRNA阳性神经元的数量增加。椎管内给予c-fos 反意寡核苷酸(ASO)明显抑制蜜 蜂毒诱导的痛反应和减少脊髓背角Fos蛋白和PPTA mRNA阳性神经元的数量。椎管内给予盐水 和c-fos正义寡核苷酸(SO)则无影响。结论 Fos可 能参与伤害性刺激诱 导的脊髓背角神经元PPTA mRNA的表达上调，在外周伤害性信息的传递中可能起着重要的作用。
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【中图分类号】R971.2 【文献标识码】A 【文章编号】0592-1356(2000)-增-57
c-fos ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE REDUCES BE E VENOM-INDUCED PPTA mRNA EXPRESSION IN THE NEURONS OF SPINAL DORSAL HORN
WANG Wen， WU Sheng-xi， WANG Ya-yun，NI Tong-shang，ZHU Min，LI Yun -qing*
(Department of Anatomy and K.K.Leiung Brain Research Centre，the Fourth Military Medical University， Xi＇an 710032，China)
, 百拇医药 【Abstract】Objective To investigate the roles of Fos protei n in the regulation of prepro tachykinin A (PPTA)gene expression.Metho d s Intraplantar injection of bee venom (BV) was used as a pain model.Immu n ohistchemistry and in situ hybridization were performed to obser ve the effects of intrathecal pretreatment of c-fos antisense oligodeoxynucleotid e (ASO) to the expr ession of Fos protein and PPTA mRNA expression in the spinal dorsal horn.Results Administration of BV into the plantar surface produced a ton i c， monophasic nociceptive response，induced Fos expression in the neurons of th e ipsilateral spinal dorsal horn and increased the number of PPTA mRNA Positive ne urons.Intrathecal pretreatment with c-fos ASO not only significantl y inhibited t he BV-induced nociceptive response but also reduced the number of Fos and PPTA mRNA positive neurons in the spinal dorsal horn.Conclusions F os might play important roles in the processing of noxious information and take pa rt in the noxious stimulation-induced upregulation of PPTA mRNA expression in t he neurons of spinal dorsal horn.
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【Key words】c-fos;Preprotachykinin A；Antisense oligodeoxyn ucleotide;Nociception;Spinal cord;in situ hybridization histochimist ry;Rat P物质(SP)是外周的致痛物质之一，在伤害性信息的传递过程中起着重要 的作用。前速激肽 原A (PPTA)是SP的前体。以往的研究观察到皮下注射福尔马林、角叉菜胶、完全弗氏佐剂等 多种伤害性刺激均可引起脊髓背角浅层神经元表达PPTA mRNA 的水平上调[1，2] ，提示存在外周伤害性刺激对脊髓背角浅层神经元的跨突触激活机制。但是参与背角神经元 内PPTA mRNA 表达调节的因素尚不清楚。我们的研究观察到外周伤害性刺激条件下，刺激 侧脊髓背角内PPTA mRNA 阳性神经元同时表达Fos蛋白[3]，提示作为转录因子的F os 蛋白可能也参与PPTA基因的转录调节。为进一步验证此推测，本研究利用反义寡核苷酸(ASO )技术结合形态学方法，在足底注射蜜蜂毒(BV)致痛的大鼠模型上观察了椎管内给予c-fos ASO对PPTA mRNA 在大鼠脊髓背角神经元表达的影响。
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材料和方法
1.实验动物
健康成年雄性SD大鼠22只，体重180～220g，每只动物单独饲养于塑料盒(22～26℃)中。为 了保持其生物节律，实验室每日晨8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00熄灯，行为学实 验均在9：00～18：30间进行。实验前5d每日将大鼠置于实验观察箱中 30 min，使之适应。 大鼠随机分组，第1组(n=11)用于行为学和免疫组织化学检测；第2组(n=11)用于行为学和原位杂交组织化学检测。
2.反义寡核苷酸和鞘内置管术
c-fos寡核苷酸由上海 Sangon 公司合成，全碱基硫代磷酸修饰。反义寡核 苷酸(ASO)和正义 寡核苷酸(SO)的序列分别为：5’-GAA CAT CAT GGT CGT-3’和5’-ACG ACC ATG ATG TT C-3’。
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大鼠经氯氨酮50～100 mg/kg麻醉后，从背侧C7水平沿中线向尾侧切开并去除下胸椎椎板 ， 剪开硬脊膜，经蛛网膜下腔向尾侧置入聚乙烯PE-10导管(日本Natume公司)至腰膨大(L 4～ L5)。然后经导管外口注入50μl无菌生理盐水，见硬脊膜破口处有气泡及脑脊液溢出，即 封外口。外露部分固定于皮肤。术后3d，选择状态良好、无活动障碍的动物进行实验。实验 完毕后解剖动物，以确定鞘内导管的位置。
3.BV注射、鞘内给药及行为学观察
用1 ml注射器快速将BV(4g/L)注射入大鼠一侧后肢足底中心皮下。在给予BV前4h，分别鞘 内注射生理盐水(10μ1，n=6)、c-fos SO (50μg/10μl，n=8)和 c-fos ASO (50μg/10μl，n=8)。推进速度为0.5μ1/s。
将30cm×30cm×30cm的透明有机玻璃箱置于高于实验台50 cm的架子上，实验前动物均在实 验 箱中适应30 min以上。大鼠一侧后肢足底中心皮下注入BV后立即将其放回实验箱开始检测， 记录自BV注射起1h内每5min 的自发缩足反射次数。
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4.免疫组织化学染色及原位杂交步骤
第一组大鼠(n=11)在BV注射2h后，以戊巴比妥钠(40mg/kg，i.p)麻醉，常规 灌注取材。取腰 段(L4～L5)脊髓置上述固定液中后固定4h(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB中 过夜(4℃)。冠状冰冻切片(厚30μm)。隔2张取1片，共分3套收集。第1套切片经0.01 mol /L PBS清洗后，用兔抗Fos血清(1：1 000，中山公司) 室温孵育过夜；ABC 法呈色，光镜观 察并摄片。用正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，结果呈阴性。第3套切片进行Nissl染色 ，以确定脊髓灰质分层。
第2组大鼠(n=11)在蜜蜂毒注射20h后，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p)麻醉 。断头后快速取腰 段(L4～L5)脊髓，立即包埋于干冰粉末中。恒冷箱切片(厚14μm)。切片贴于经明胶处 理的载玻片上，置 -70℃冰箱中保存备用。实验所用PPTA探针为寡核苷酸探针，含30个碱 基，其序列与大鼠脑内相应mRNA的一部分(175～204号碱基)互补[4]。探针用3’末 端标 记法及[α-35S]dATP(>1 000 Ci/mmol，Amersham)标记。标记探针的特异放 射活性 为1.2×109dpm/μg。切片快速干燥后依次用4%多聚甲醛、0.1 mol/L PB及杂交 前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)处理。杂交时将200μl杂交液[ 含4×SSC、50%甲 酰胺 、0.025%tRNA、10%硫酸苏糖、1×Denhardt液(含0.02%牛血清蛋白、0.02% Ficol 400、0.02% PVP K-30)]，15μl DTT及标记探针(6～9×106dpm/载玻片)滴于切片表面 ， 置湿盒中于40℃孵育48h。杂交后，用1×SSC冲洗(55℃，3×20min)，最后将LM-l型乳胶(A m ersham)涂于切片表面，暗盒中曝光(4℃)。4周后，用Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定 影液定影，1%硫堇复染。脱水、透明、封片，光镜下明、暗视野观察并摄片。
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每只大鼠均选取6张切片分别进行Fos及PPTA mRNA阳性细胞的计数。行为学测定及细胞计数 的数据均为
±s表示，应用ANOVA检验作统计学分 析，P<0.05时具有显著性统计学意义。结 果
1.行为学检测结果
足底皮下注入BV可诱致持续、单向性痛行为反应(包括缩足反射和抬足/舔足行为)，且持续1 ～2h以上。鞘内预先注入等体积的盐水、SO和ASO后，BV诱导的每5 min平均缩足次数见图1 。A SO处理使BV诱导的缩足反应显著降低(P<0.01)，与盐水组相比降低了54. 2%。SO处理使缩足反射轻度降低，但无统计学差异(P>0.05)。
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图1 c-fos ASO、SO或生理盐水组足底注 射BV后大鼠1h内每5min平均缩足次数。**与SO组及盐水组比较，P<0.01
Fig.1 Column graph showing the average flinches per 5 min during 1h observation period after BV injection with pretreatment of c-fos ASO，SO or sa li ne.**P<0.01，compared with SO group and saline group.
2.免疫组织化学染色结果
足底皮下注射BV 2h后，在注射侧L4～L5脊髓背角观察到大量Fos阳性神经元。阳性神 经 元主要位于背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，在Ⅲ～Ⅴ层也有散在分布。椎管内预先给予盐水、SO和AS O后，背角浅层Fos阳性神经元的数量见附表。与盐水组和SO组相比，c-fos ASO使背角浅层Fos阳性神经元的数量明显减少(图2)。
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附表 鞘内注射盐水、c-fos SO和ASO对BV 诱导的脊髓背角浅层Fos和PPTA mRNA表达的影响((
±s)Table Effects of intrathecal pretreatment with saline，c-fos SO and ASO to the ex pression of Fos and PPTA mRNA in the superfacial layers of the spinal dorsal h orn induced BV injection (
±s)盐水
saline
c-fos正义寡核苷酸
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c-fos S O
c-fos反义寡核苷酸
c-fos ASO
Fos阳性神经元(positive neurons)
57.8±12.1
53.4±10.3
16.2±6.7*
PPTA mRNA阳神神经元(positive neurons)
35.1±10.6
33.2±9.4
20.5±7.8**
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*P<0.01，**P<0.05， 与盐水和SO组相比(compared with saline group and SO group).
3.原位杂交组织化学反应的结果
BV注射也增强了PPTA mRNA 在刺激侧脊髓背角浅层神经元中的表达。在BV注射后20h，注射 侧脊髓背角浅层PPTA mRNA 阳性神经元的数量达到35.5±11.4。椎管内预先给予ASO后， 背角浅层PPTA mRNA阳性神经元的数量明显下降，为20.5±7.8，与盐水组(35.1±10.6) 和SO组(33.2±9.4)相比有显著性差异(附表，图2)。另外，ASO组脊髓背角PPTA mRNA阳性 神经元杂交信号强度也降低(图2)。
讨 论
本研究观察到足底注射BV诱导了脊髓背角神经元Fos蛋白的表达以及PPTA mRNA表达的上调， 这 与以往用其他伤害性刺激模型得到的结果一致[1，2，5]。鞘内给予c-fo s ASO不仅显著 抑制脊髓背角浅层Fos蛋白的表达，而且明显减弱背角浅层PPTA mRNA神经元的的数量。c-f os ASO明显抑制足底注射BV引起的大鼠痛反应，给予盐水和c-fos S O对大鼠的痛反应没有明 显影响。上述结果提示，c-fos ASO对大鼠痛反应的抑制可能是由于其对脊 髓背角Fos蛋白表 达的抑制，进而减弱背角神经元PPTA mRNA的表达所致，表明Fos蛋白和PPTA参与介导了皮下 注射BV诱导的痛反应。
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本研究所用的反义寡核苷酸技术已在神经科学研究领域得到广泛的应用，该方法可以方便 地 观察单个蛋白、递质的功能[6]。本实验中采用的硫代磷酸修饰反义寡核苷酸探针 具有 较好的抗降解能力，半衰期长，适用于在体实验。同时采用盐水和正义寡核苷酸作对照，排 除了手术因素的影响以及非特异性效应，增强了结果的客观性和可靠性。本研究中应用c-f os ASO的剂量及用药时程来自我们的预实验及他人的研究结果[7，8]，在该 给药条件下( 50μg，4h)，c-fos ASO 可以发挥其最大的对Fos蛋白表达的抑制效应。我 们在既往实验中观 察到足底注射BV 4h，脊髓后角PPTA mRNA阳性神经元的数量即增加，24h后达到峰值。本研 究选择注射BV后20h取材观察PPTA mRNA的变化是为了保证c-fos ASO对它的 最大抑制效应。
c-fos基因是早期即刻癌基因家族中的一员，多种刺激条件均可引起Fos蛋 白的表达。Fos蛋 白与其他早期即刻其因，如c-jun的表达产物Jun能形成异源二聚体，作为 转录调节因子促进 靶基因的转录，在细胞的信号转导中起重要作用[8]。形态学的研究观察到在外周 福 尔马林刺激条件下，脊髓背角内约80%～90%前强啡肽原(PPD)及前脑啡肽原(PPE) mRNA阳性 神经元同时表达Fos 蛋白[9，10]。分子生物学研究证明[11]在PPD和PPE 基因中存 在Fos蛋白的特异性结合位点，当Fos蛋白和这一段序列结合后即能促进PPD及PPE基因的转录 ，从而使PPD和PPE mRNA在脊髓背角神经元中的表达增强。我们以往的研究观察到在外周伤 害性刺激作用下，脊髓背角浅层约77.9%的 PPTA mRNA阳性神经元表达Fos蛋白，提示Fos蛋 白可能参与PPTA转录水平的调节[2]。本研究观察到鞘内注射c-fos ASO明显抑制BV诱导 的脊髓背角Fos蛋白的表达和减少PPTA mRNA阳性神经元的数量，支持上述推测。外周的伤害 性刺激可能跨突触激活脊髓背角神经元Fos蛋白的表达，Fos蛋白进一步影响PPTA基因的转录 ，使这些神经元PPTA mRNA的表达上调，从而参与伤害性信息向上位脑结构的传递。进一步 的工作则需利用分子生物学手段在Fos蛋白对PPTA基因的转录调节机制方面开展深入研究。
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本文照片的制作得到原悦萍同志的协助，谨致谢意。
图2 鞘内注射生理盐水(A，D)、c-fos SO(B，E)或ASO(C,F)组BV注射侧大鼠 脊髓背角浅层FOS蛋白(A，B，C)和PPTA mRNA(D,E,F)阳性神经元的分布。标尺示100μm[ ZK)〗
Fig.2 Expression of FOS(A,B,C) and PPTA mRNA(D,E,F) in the neurons of su perficial laminae of the spinal dorsal horn ipsilateral to the
BV injection in saline g ro up(A,D),c-fos SO group(B,E) or ASO group(C,F).Bar＝100μm
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【基金项目】国家杰出青年科学基金资助项目(39625011)、国家重 点基础研究规划 “脑功能和脑重大疾病的基础研究”(G1999054000)和高等院校骨干教师资助项目
【作者简介】王文(1975—)，男(汉族)，四川省都江堰市人，硕 士研究生
参考文献
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【收稿日期】20000-07-04 【修回日期】2000-08-03, 百拇医药