局部联合应用反义核酸对大鼠颈动脉肌内膜增殖的作用
作者：郗永安 汪丽蕙 朱国英 张钧华
单位：100050 北京天坛医院 CCU病房
关键词：寡核苷酸类；反义；内皮；血管
中国循环杂志99zk16 摘要
目的：观察局部联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras对氮气干燥内皮剥脱术后大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用。
方法：50只SD大鼠随机分为对照组、错配组、反义c-myb组、反义c-Ha-ras组和联合用药组，于内皮剥脱后经凝胶球囊局部导入不同核酸片段。术后14天取材制片，采用计算机图像分析法测量管腔面积，内/中膜面积、厚度比值。
结果：联合用药组管腔面积(0.39±0.12 mm2)大于反义c-myb、反义c-Ha-ras组(0.29±0.01 mm2,0.28±0.01 mm2,P<0.05)和错配组(0.18±0.05 mm2,P<0.01),与对照组(0.40±0.14 mm2)比较，管腔面积无显著差异(P>0.05)。其内/中膜面积、厚度比值(0.11±0.02,0.02±0.00)均低于单一制剂组和错配组(0.45±0.24,0.39±0.25;0.57±0.24,0.56±0.23;1.16±0.38,1.85±0.79;P<0.01)。
, http://www.100md.com
结论：局部靶向联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras能进一步抑制血管损伤后肌内膜增殖，有效防止管腔狭窄。
Effects of Locally Delivered Antisense Oligonucleotides on Myointimal Hyperplasia of Rat Carotid Artery after Nitrogen Drying
Coronary Care Unit, Tiantan Hospital, Chinese Academy of Medcial Sciences, Beijing (100050)
Xi Yong an, Wang Lihui, Zhu Guoying, et al.
Abstract
, http://www.100md.com Objective: To determine if antisense c-myb plus c-Ha-ras delivered locally via hydrogel catheter inhibits the development of myointimal hyperplasia in rat carotid artery after nitrogen desiccation of the endothelium.
Methods: Fifty SD rats were randomized into five groups (ten in each). After endothelial injury, different antisense oligonucleotides were administered locally through hydrogel catheter. Animals were killed 14 days after gas drying. The lumen areas, ratios of intimal to medial area and intimal to medial thickness were measured with the aid of computer. The q test was used for statistical analysis.
, http://www.100md.com
Results: The lumen area of the combined (antisense c-myb and c-Ha-ras) group (0.39±0.12 mm2) was larger than that of the antisense c-myb, c-Ha-ras and mismatch mismatching oligonucleotide) groups (0.29±0.01 mm2,q=3.488 2; 0.28±0.01 mm2,q=3.744 1; p<0.05; 0.18±0.05 mm2, q=7.064 0, p<0.01, respectively). No difference in lumen areas was found between the combined group and control group (0.40±0.14 mm2, q=0.117 8, p>0.05). The ratios of intimal to medial area and intimal to medial thickness for the combined group (0.11±0.02, 0.02±0.00) were significantly decreased compared with the antisense c-myb、 c-Ha-ras and mismatch groups (0.45±0.24, 0.39±0.25 and 1.16±0.38; q=9.871 7, 9.545 2 and 30.682 2; 0.57±0.24, 0.56±0.23 and 1.85±0.79; q=9.144 2, 8.847 7 and 29.564 7, respectively; p<0.01).
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Conclusion: Myointimal hyperplasia of rat carotid artery after nitrogen drying can be further suppressed by local intravascular delivery of combined antisense c-myb and c-Ha-ras. The technique is promising to be used to prevent injured artery from obstructive stenosis.
Key words Oligonucleotides; Antisense; Endothelium; Vascular
肌内膜增殖(myointimal hyperplasia,MH)是冠状动脉介入术后再狭窄及众多心血管疾病的主要病理特征[1]。癌基因与抗癌基因表达异常是其重要发病机制之一。利用反义制剂能特异性阻遏相应靶基因的功能。局部应用反义c-myb能有效抑制肌内膜增殖，但不能完全消除管腔狭窄[2]。本工作采用凝胶包被球囊局部联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras,以探讨同步给予两种反义制剂是否能进一步减轻肌内膜增生，消除管腔狭窄，为增殖性血管病变的防治提供新途径。
, 百拇医药
1 材料与方法
主要实验用品 反义c-myb(GTGTCGGGGTC-TCCGGC,鼠c-myb序列4～22位)、反义c-Ha-ras(TTCCG-TCATCGCTCC,与以c-Ha-ras第一密码子为中心的序列互补)及错配(GTGCGCGGGTCTTCGGCG)硫代磷酸寡核苷酸由Beckman DNA自动合成仪合成[3，4]。2 F凝胶包被球囊为Masfild产品。
动物与分组：50只雄性SD大鼠，体重250～300 g,随机分为对照组、错配组、反义c-myb组、反义c-Ha-ras组与联合用药组，每组10只。
大鼠颈动脉氮气干燥内皮剥脱术：按改良的Fishman法制作大鼠颈动脉内皮剥脱模型。
经凝胶球囊局部应用硫代磷酸寡核苷酸：稀释硫代寡核苷酸，使其浓度为2 μg/μl。充盈球囊(压力约为203 kPa,1 kPa=7.5 mmHg),取稀释液100 μl均匀涂布于球囊表面，吹干后，排除囊内气体，经左颈外动脉置入导管，使球囊近端恰位于动脉分叉部之下。充盈球囊(压力203 kPa),维持30分,放气后退出导管，结扎颈外动脉近端，剪除颈内、颈总动脉结扎线，恢复血供。逐层缝合组织，皮肤。碘酒、酒精消毒后，分笼饲养。对照组仅行PBS冲洗。
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标本制备，观测与统计学处理：于术后14天,经4%多聚甲醛原位灌注后，取处理段动脉经10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片、苏木素伊红(HE)染色，光镜观察。切片经计算机(IBAS2000USA)进行图像分析，测量管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值。结果以平均值±标准差(±s)表示。行Newman-Keuls(q)检验。
2 结果
各组管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值见附表。联合用药组管腔面积大于反义c-myb、反义c-Ha-ras和错配组(q=3.488 2,3.744 1,P<0.05;q=7.064 0,P<0.01)。与对照组比较管腔面积无显著性差异(q=0.117 8,P>0.05)。其内膜/中膜面积、厚度比值均低于反义c-myb、反义c-Ha-ras和错配组(q=9.871 7,9.545 2和30.682 2,P<0.01;q=9.144 2,8.847 7和29.564 7,P<0.01)。反义c-myb、反义c-Ha-ras组管腔面积大于错配组(q=3.575 8,3.314 0,P<0.05)小于对照组(q=3.606 1,3.861 9,P<0.05),内膜/中膜面积、厚度比值小于错配组(q=20.810 5,21.137 0;20.754 0，20.805 8;P<0.01)。
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附表 各组血管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值(±s) 组别
大鼠
(只)
血管腔面积
(mm2)
内膜/中膜
面积比值
内膜/中膜
厚度比值
对照组
10
0.40±0.14
, 百拇医药
—
—
错配组
10
0.18±0.05△△*
1.16±0.38**
1.85±0.79**
反义c-myb组
10
0.29±0.01
0.45±0.24
0.57±0.24
, 百拇医药
反义c-Ha-ras组
10
0.28±0.01
0.39±0.25
0.56±0.23
联合用药组
10
0.39±0.12*△▲
0.11±0.02**▲
0.02±0.00**▲
注：与反义c-myb、反义c-Ha-ras组比较*P<0.05**P<0.01；与对照组比较△P>0.05△△P<0.05；与错配组比较▲P<0.01。—:未测
, 百拇医药
3 讨论
肌内膜增殖是多因素参与的病理过程。研究表明，肌内膜形成过程中有多种原癌基因活化与异常表达，其产物在功能上与导致细胞增殖的信号通路及细胞周期控制点密切相关，提示癌基因在细胞增殖与表型转化中起关键作用。已证实许多癌基因在调节细胞增殖方面具有协同作用[5]。反义核酸能特异性封闭相应靶基因。联合应用多种针对不同癌基因的反义制剂有可能在不同环节上同时阻断增殖信息的传递和细胞周期的演进，是防止肌内膜增殖的新思路。Ras基因在细胞增殖中具有重要作用。Ras基因产物在丝裂原信号自细胞膜向核内传递过程中起传感器作用[6]。Myb基因编码75 kD DNA结合蛋白，在细胞增殖的转录水平起调节作用，参与细胞G1/S期过渡的细胞周期控制[7]。本文观察了联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras是否能进一步抑制动脉损伤后肌内膜增殖，消除管腔狭窄。结果发现，联合用药组管腔面积大于单一制剂和错配组，与对照组比较管腔面积无差异。其内膜/中膜面积、厚度比值均低于单一制剂组和错配组。表明联合应用反义制剂可进一步减轻肌内膜增殖，使管腔面积趋于正常，优于单一制剂组。反义c-myb、反义c-Ha-ras对大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用具有相加性。提示定点靶向应用多种反义制剂或药物是防止肌内膜增殖性血管腔狭窄的有效新途径。联合应用反义制剂的协同机制尚不完全清楚。研究显示，多种癌基因产物均直接或间接参与导致细胞增殖和分化的信号传导系统。反义ras能阻断以P21蛋白中介的多个信息通路，使多种生长因子刺激细胞增殖的作用受到抑制。反义c-myb能发挥核内转录后水平抗增殖作用。两者联合应用对细胞增殖的始动因素起到了双重阻断作用，是其具有协同抗肌内膜增殖的可能机制。
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Shwarts SM, deBlois D, O′Brien ERM. The intima: soil for atherosclerosis and restenosis. Circ Res, 1995,77:445—455.
2 Azrin MA, Mitchel JF, Bow LM, et al. Local delivery of c-myb antisense oligonucleotides during balloon angioplasty. Cathet Cardiovasc Diagn, 1997,41:232—240.
3 Pickering JE, Isner JM, Ford CM, et al. Processing of chimeric antisense oligonucleotides by human vascular smooth muscle cells and human atherosclerotic plaque: implication for antisense therapy of restenosis after angioplasty. Circulation, 1996,93:772—780.
, http://www.100md.com
4 Nabel EG. Gene therapy for cardiovascular disease. Circulation, 1995,91:541—548.
5 Hunter T. Cooperation between oncogenes. Cell, 1991,6:249—270.
6 Simons M, Morgan KG, Parker C, et al. The proto-oncogene c-myb mediates an intracellular calcium rise during the late G1 phase of the cell cycle. J Biol Chem, 1993,268:627—632.
7 Chang EH, MIller PS, Cushman C, et al. Antisense inhibition of ras P21 expression that is sensitive to a point mutation. Biochemistry, 1991,30:8283—8286.
(收稿:1999-05-04), 百拇医药
单位：100050 北京天坛医院 CCU病房
关键词：寡核苷酸类；反义；内皮；血管
中国循环杂志99zk16 摘要
目的：观察局部联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras对氮气干燥内皮剥脱术后大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用。
方法：50只SD大鼠随机分为对照组、错配组、反义c-myb组、反义c-Ha-ras组和联合用药组，于内皮剥脱后经凝胶球囊局部导入不同核酸片段。术后14天取材制片，采用计算机图像分析法测量管腔面积，内/中膜面积、厚度比值。
结果：联合用药组管腔面积(0.39±0.12 mm2)大于反义c-myb、反义c-Ha-ras组(0.29±0.01 mm2,0.28±0.01 mm2,P<0.05)和错配组(0.18±0.05 mm2,P<0.01),与对照组(0.40±0.14 mm2)比较，管腔面积无显著差异(P>0.05)。其内/中膜面积、厚度比值(0.11±0.02,0.02±0.00)均低于单一制剂组和错配组(0.45±0.24,0.39±0.25;0.57±0.24,0.56±0.23;1.16±0.38,1.85±0.79;P<0.01)。
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结论：局部靶向联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras能进一步抑制血管损伤后肌内膜增殖，有效防止管腔狭窄。
Effects of Locally Delivered Antisense Oligonucleotides on Myointimal Hyperplasia of Rat Carotid Artery after Nitrogen Drying
Coronary Care Unit, Tiantan Hospital, Chinese Academy of Medcial Sciences, Beijing (100050)
Xi Yong an, Wang Lihui, Zhu Guoying, et al.
Abstract
, http://www.100md.com Objective: To determine if antisense c-myb plus c-Ha-ras delivered locally via hydrogel catheter inhibits the development of myointimal hyperplasia in rat carotid artery after nitrogen desiccation of the endothelium.
Methods: Fifty SD rats were randomized into five groups (ten in each). After endothelial injury, different antisense oligonucleotides were administered locally through hydrogel catheter. Animals were killed 14 days after gas drying. The lumen areas, ratios of intimal to medial area and intimal to medial thickness were measured with the aid of computer. The q test was used for statistical analysis.
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Results: The lumen area of the combined (antisense c-myb and c-Ha-ras) group (0.39±0.12 mm2) was larger than that of the antisense c-myb, c-Ha-ras and mismatch mismatching oligonucleotide) groups (0.29±0.01 mm2,q=3.488 2; 0.28±0.01 mm2,q=3.744 1; p<0.05; 0.18±0.05 mm2, q=7.064 0, p<0.01, respectively). No difference in lumen areas was found between the combined group and control group (0.40±0.14 mm2, q=0.117 8, p>0.05). The ratios of intimal to medial area and intimal to medial thickness for the combined group (0.11±0.02, 0.02±0.00) were significantly decreased compared with the antisense c-myb、 c-Ha-ras and mismatch groups (0.45±0.24, 0.39±0.25 and 1.16±0.38; q=9.871 7, 9.545 2 and 30.682 2; 0.57±0.24, 0.56±0.23 and 1.85±0.79; q=9.144 2, 8.847 7 and 29.564 7, respectively; p<0.01).
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Conclusion: Myointimal hyperplasia of rat carotid artery after nitrogen drying can be further suppressed by local intravascular delivery of combined antisense c-myb and c-Ha-ras. The technique is promising to be used to prevent injured artery from obstructive stenosis.
Key words Oligonucleotides; Antisense; Endothelium; Vascular
肌内膜增殖(myointimal hyperplasia,MH)是冠状动脉介入术后再狭窄及众多心血管疾病的主要病理特征[1]。癌基因与抗癌基因表达异常是其重要发病机制之一。利用反义制剂能特异性阻遏相应靶基因的功能。局部应用反义c-myb能有效抑制肌内膜增殖，但不能完全消除管腔狭窄[2]。本工作采用凝胶包被球囊局部联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras,以探讨同步给予两种反义制剂是否能进一步减轻肌内膜增生，消除管腔狭窄，为增殖性血管病变的防治提供新途径。
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1 材料与方法
主要实验用品 反义c-myb(GTGTCGGGGTC-TCCGGC,鼠c-myb序列4～22位)、反义c-Ha-ras(TTCCG-TCATCGCTCC,与以c-Ha-ras第一密码子为中心的序列互补)及错配(GTGCGCGGGTCTTCGGCG)硫代磷酸寡核苷酸由Beckman DNA自动合成仪合成[3，4]。2 F凝胶包被球囊为Masfild产品。
动物与分组：50只雄性SD大鼠，体重250～300 g,随机分为对照组、错配组、反义c-myb组、反义c-Ha-ras组与联合用药组，每组10只。
大鼠颈动脉氮气干燥内皮剥脱术：按改良的Fishman法制作大鼠颈动脉内皮剥脱模型。
经凝胶球囊局部应用硫代磷酸寡核苷酸：稀释硫代寡核苷酸，使其浓度为2 μg/μl。充盈球囊(压力约为203 kPa,1 kPa=7.5 mmHg),取稀释液100 μl均匀涂布于球囊表面，吹干后，排除囊内气体，经左颈外动脉置入导管，使球囊近端恰位于动脉分叉部之下。充盈球囊(压力203 kPa),维持30分,放气后退出导管，结扎颈外动脉近端，剪除颈内、颈总动脉结扎线，恢复血供。逐层缝合组织，皮肤。碘酒、酒精消毒后，分笼饲养。对照组仅行PBS冲洗。
, http://www.100md.com
标本制备，观测与统计学处理：于术后14天,经4%多聚甲醛原位灌注后，取处理段动脉经10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片、苏木素伊红(HE)染色，光镜观察。切片经计算机(IBAS2000USA)进行图像分析，测量管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值。结果以平均值±标准差(±s)表示。行Newman-Keuls(q)检验。
2 结果
各组管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值见附表。联合用药组管腔面积大于反义c-myb、反义c-Ha-ras和错配组(q=3.488 2,3.744 1,P<0.05;q=7.064 0,P<0.01)。与对照组比较管腔面积无显著性差异(q=0.117 8,P>0.05)。其内膜/中膜面积、厚度比值均低于反义c-myb、反义c-Ha-ras和错配组(q=9.871 7,9.545 2和30.682 2,P<0.01;q=9.144 2,8.847 7和29.564 7,P<0.01)。反义c-myb、反义c-Ha-ras组管腔面积大于错配组(q=3.575 8,3.314 0,P<0.05)小于对照组(q=3.606 1,3.861 9,P<0.05),内膜/中膜面积、厚度比值小于错配组(q=20.810 5,21.137 0;20.754 0，20.805 8;P<0.01)。
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附表 各组血管腔面积，内膜/中膜面积、厚度比值(±s) 组别
大鼠
(只)
血管腔面积
(mm2)
内膜/中膜
面积比值
内膜/中膜
厚度比值
对照组
10
0.40±0.14
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—
—
错配组
10
0.18±0.05△△*
1.16±0.38**
1.85±0.79**
反义c-myb组
10
0.29±0.01
0.45±0.24
0.57±0.24
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反义c-Ha-ras组
10
0.28±0.01
0.39±0.25
0.56±0.23
联合用药组
10
0.39±0.12*△▲
0.11±0.02**▲
0.02±0.00**▲
注：与反义c-myb、反义c-Ha-ras组比较*P<0.05**P<0.01；与对照组比较△P>0.05△△P<0.05；与错配组比较▲P<0.01。—:未测
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3 讨论
肌内膜增殖是多因素参与的病理过程。研究表明，肌内膜形成过程中有多种原癌基因活化与异常表达，其产物在功能上与导致细胞增殖的信号通路及细胞周期控制点密切相关，提示癌基因在细胞增殖与表型转化中起关键作用。已证实许多癌基因在调节细胞增殖方面具有协同作用[5]。反义核酸能特异性封闭相应靶基因。联合应用多种针对不同癌基因的反义制剂有可能在不同环节上同时阻断增殖信息的传递和细胞周期的演进，是防止肌内膜增殖的新思路。Ras基因在细胞增殖中具有重要作用。Ras基因产物在丝裂原信号自细胞膜向核内传递过程中起传感器作用[6]。Myb基因编码75 kD DNA结合蛋白，在细胞增殖的转录水平起调节作用，参与细胞G1/S期过渡的细胞周期控制[7]。本文观察了联合应用反义c-myb、反义c-Ha-ras是否能进一步抑制动脉损伤后肌内膜增殖，消除管腔狭窄。结果发现，联合用药组管腔面积大于单一制剂和错配组，与对照组比较管腔面积无差异。其内膜/中膜面积、厚度比值均低于单一制剂组和错配组。表明联合应用反义制剂可进一步减轻肌内膜增殖，使管腔面积趋于正常，优于单一制剂组。反义c-myb、反义c-Ha-ras对大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用具有相加性。提示定点靶向应用多种反义制剂或药物是防止肌内膜增殖性血管腔狭窄的有效新途径。联合应用反义制剂的协同机制尚不完全清楚。研究显示，多种癌基因产物均直接或间接参与导致细胞增殖和分化的信号传导系统。反义ras能阻断以P21蛋白中介的多个信息通路，使多种生长因子刺激细胞增殖的作用受到抑制。反义c-myb能发挥核内转录后水平抗增殖作用。两者联合应用对细胞增殖的始动因素起到了双重阻断作用，是其具有协同抗肌内膜增殖的可能机制。
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4 参考文献
1 Shwarts SM, deBlois D, O′Brien ERM. The intima: soil for atherosclerosis and restenosis. Circ Res, 1995,77:445—455.
2 Azrin MA, Mitchel JF, Bow LM, et al. Local delivery of c-myb antisense oligonucleotides during balloon angioplasty. Cathet Cardiovasc Diagn, 1997,41:232—240.
3 Pickering JE, Isner JM, Ford CM, et al. Processing of chimeric antisense oligonucleotides by human vascular smooth muscle cells and human atherosclerotic plaque: implication for antisense therapy of restenosis after angioplasty. Circulation, 1996,93:772—780.
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4 Nabel EG. Gene therapy for cardiovascular disease. Circulation, 1995,91:541—548.
5 Hunter T. Cooperation between oncogenes. Cell, 1991,6:249—270.
6 Simons M, Morgan KG, Parker C, et al. The proto-oncogene c-myb mediates an intracellular calcium rise during the late G1 phase of the cell cycle. J Biol Chem, 1993,268:627—632.
7 Chang EH, MIller PS, Cushman C, et al. Antisense inhibition of ras P21 expression that is sensitive to a point mutation. Biochemistry, 1991,30:8283—8286.
(收稿:1999-05-04), 百拇医药