携HBx基因逆转录病毒载体的构建
作者：闵军 刘彦文 陈积圣 罗树红 余新炳
单位：闵军 陈积圣(中山医科大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，广东 广州 510120)；刘彦文 罗树红 余新炳(中山医科大学寄生虫学教研室， 广东 广州 510089)
关键词：基因，HBx；逆转录病毒载体
00zk12
摘 要：【目的】 构建携HBx基因的逆转录病毒载体，为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】 采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因；将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX，构建质粒pLNSHBx，磷酸钙-DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317，检测培养上清病毒滴度。【结果】 应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因，并经序列分析证实；建立了产病毒细胞株PA317/HBx，检测其培养上清病毒滴度为8.9×104 CFU，PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】 成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。
, 百拇医药
中图分类号： R735.7 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0043-03
Construction of a Retroviral Vector Containing HBx Gene
MIN Jun, CHEN Ji-shen
( Department of Hepato-biliary Surgery, Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120,China)
LIU Yan-wen, LUO Shu-hong, YU Xin-bing
, 百拇医药
(Department of Parasitology, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract: 【Objective】 Establish a retroviral vector carrying HBx gene for investigation of the effects of HBx gene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma. 【Methods】 HBx gene was amplified from genomic DNA of HBV by PCR technique, and subcloned to plasmid pLNSX to construct recombinant plasmid pLNSHBx. Applying the calcium phosphate-DNA co-precipitation technique, the pLNSHBx was transferred into PA317 packaging cell line. Culture supernatant of these cells was collected for titration of the recombinant virus. 【Results】 HBx gene was cloned from HBV genome by PCR successfully, and proved by sequence determination. A vector producing cell line PA317/HBx was established. The titres of the recombinant virus in the culture supernatant were 8.9×104 CFU. An HBx gene integration was detected by PCR in the recombinant retroviral vectors. 【Conclusions】 A retrovirus vector containing HBx gene was successfully constructed.
, 百拇医药
Key words：gene, HBx； retroviral vector
乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx基因)是HBV 4个开放阅读框中最小的一个，编码154个氨基酸、分子质量为17 ku的X蛋白，即HBxAg。X蛋白是一种反式激活因子，可激活多种细胞基因的启动子、诱导细胞转化、失活抑癌基因P53、阻止DNA修复等，在HBV诱发肝癌的机制中起重要作用，因此，被称为“病毒癌基因”[1～3]。多年来，有关HBx基因研究的焦点主要集中在其诱发肝癌的机制上，鉴于HBx基因转录调节的特点，以及肝癌组织中HBx基因持续高表达的现象[4,5]，我们提出HBx基因对肝癌的恶性行为具有潜在影响的新观点。为此，我们构建了携HBx基因的重组逆转录病毒载体，为深入研究HBx基因对肝癌生物学行为的影响打下基础。现将载体构建过程报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材 料
携带3.2 kb全长人HBV基因组质粒 pT7T3HBV、逆转录病毒载体pLNSX、PA317包装细胞系和小鼠成纤维细胞系NIH3T3均为本室保存； G418购自Boehringer Mannheim公司，Polybrene为Sigma公司产品，各种限制性内切酶和PCR试剂购自华美生物工程公司。
1.2 HBx基因克隆
根据HBx基因全序列设计引物，5′端引物(X1)为：5′-GGaagcttCATATGGCTGCTAGGCTG-3′；3′端引物(X2)为：5′-TGaagcttAGATCTT-GAACAGTAGGA-3′，引物两端均含HindⅢ酶切位点，扩增片段长度为518 bp。以质粒pT7T3HBV为模板，PCR反应体积为100 μL，其中含2.5 mmol/L 4×dNTP 8 μL，5′和3′游引物各100 pmol/L，Taq DNA聚合酶3 U，反应条件为94 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环。反应结束后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，DEAE膜回收片段。在全自动序列分析仪中进行序列分析。
, 百拇医药
1.3 HBx基因重组逆转录病毒载体的构建
质粒DNA的提取、酶切、片段回收、去磷酸化、连接、转化参照文献[6]方法进行。
1.4 逆转录病毒的包装
重组质粒导入PA317包装细胞系采用磷酸钙-DNA共沉淀法[6]。
1.5 培养上清病毒鉴定
分别于转染后3、7、14、21 d收集细胞培养上清，同时收集筛选后的阳性克隆细胞株培养上清，5 000 r/min(Eppendorf 5417型离心机，r=9.2 cm)离心5 min，取上清煮沸15 min，以此为模板，分别以HBx基因引物X1和X2，新霉素抗性基因(neomycin resistance gene，NeoR)引物N1和N2[7]进行PCR反应。
, 百拇医药
1.6 病毒滴度测定
收集PA317/HBx细胞培养上清，5 000 r/min离心5 min，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤，以1 mL每管分装，-70 ℃冻存备用。在25 mL的培养瓶中接种105个NIH3T3细胞，置37 ℃、φ=5%CO2培养24 h，吸去培养液，将病毒上清分别按10-3、10-4倍稀释，以每瓶1 mL加入到细胞表面，同时加入8 μg Polybrence，在37 ℃、φ=5%CO2条件下吸附2.5 h，再加入2 mL RPMI 1640完全培养基培养24 h，PBS洗去病毒，换含G418(终质量浓度400 g/L)的培养液进行选择培养，3～4 d换液一次，4～6周细胞克隆形成后，在倒置显微镜下计算克隆形成数目。按下列公式计算出上清的病毒滴度：病毒滴度(CFU)=克隆数目×稀释倍数×10。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 HBx基因克隆与序列测定
PCR产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见一条特异条带位于DNA分子Marker(M)标准515 bp处，与预计扩增长度(518 bp)相符(图1)；以HBx基因3′端引物对此特异片段在全自动测序仪中反向测序(部分序列见图2)，证明此片段即为HBx基因编码序列。
图1 HBx基因PCR扩增
Fig.1 HBx gene amplification by PR
M: PCR Marker, 1:pT7T3HBV plasmid DNA as template； 2: ddH2O as template
图2 HBx基因部分序列(反义链)
, 百拇医药
Fig.2 Partial nucleotide sequence of HBx gene (anti-sense)
2.2 重组逆转录病毒载体的构建与鉴定
PCR产物HindⅢ酶切，pLNSX质粒HindⅢ酶切，用CIP酶对载体5′去磷酸化，将目的片段与载体DNA连接，产物转化大肠杆菌，快速酚法初筛出重组质粒，分别进行HBx基因PCR扩增及HindⅢ和BamHⅠ单酶切鉴定。重组体1和2经HindⅢ酶切和HBx基因均切出约500 bp片段，以引物进行PCR扩增，也都扩增出约500 bp左右特异条带，这表明HBx基因已成功连入pLNSX载体中。pLNSX与HBx连接可能有两种方式，即正向连接和反向连接。pLNSX于2 786 bp处有一BamHⅠ单酶切点，HBx基因在距起始密码子30 bp处也有一BamHⅠ单切点。因此，重组克隆经BamHⅠ单酶切后，正向连接者产生6 265 bp与382 bp两个片段，而反向连接者则产生5 829 bp和818 bp两个片段。对1和2号重组质粒进行BamHⅠ单酶切，电泳结果如图3所示。1号重组子为正向连接，命名为pLNSHBx；2号重组子则为反向连接，命名为pLNSHBxAS。
, 百拇医药
图3 pLNSHBx重组质粒BamHⅠ酶切鉴定
Fig.3 Recombinant plasmid pLNSHBx was identified by
restriction endonuclease emzyme BamHⅠ digested
M: PCR Marker, 1: Recombinant plasmid No.1 was digested with BamHⅠ, 2: Recombinant plasmid No.2 was digested with BamHⅠ, 3: Plasimd pLNSX was digested with BamHⅠ, 4:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ as DNA marker
2.3 携HBx基因重组逆转录病毒的包装与滴度测定
, http://www.100md.com
PA 317包装细胞是小鼠成纤维细胞NIH3T3经MoMLV转化而成，可为逆转录病毒载体提供结构蛋白。用磷酸钙-DNA共沉淀法将pLNSHBx导入PA317细胞，经400 mg/L G418筛选4周后形成细胞克隆；将细胞转至一新培养瓶中用800 mg/L G418加压筛选一次，此时仅少数细胞死亡，表明转染细胞能稳定表达NeoR基因。此细胞即为能分泌重组逆转录病毒的PA317产病毒细胞(vector producing cell，VPC)，命名为PA317/HBx。
2.4 培养上清病毒鉴定
用HBx基因引物与NeoR基因引物分别对3、7、14、21 d及PA317/HBx细胞培养上清进行PCR扩增，均扩增出特异性的HBx和NeoR基因条带，表明转染细胞能产生含HBx基因的重组逆转录病毒。
2.5 病毒滴度测定
, 百拇医药 用PA317/HBx细胞上清感染NIH3T3细胞，并让细胞在含G418的培养基中生长，第4周时可见克隆形成，此时在相差显微镜下统计克隆形成数目，稀释倍数为10-3的培养瓶中有37个克隆生长，10-4稀释的有12个克隆生长，取两者的均数，得出培养上清的病毒滴度为8.9×104 CFU。
3 讨 论
HBx基因编码的X蛋白是一个多功能的转录调节因子，可通过蛋白激酶信号途径活化AP-1、AP-2和NF-κB等核因子，促进癌基因和细胞因子基因如c-myc、IGF-Ⅰ等的表达，调节细胞的生长和分化[1]。在肝癌组织中已发现HBx基因与X蛋白的阳性率很高[4,5]，但X蛋白对肝癌细胞的恶性行为有何影响，迄今未见报道。在本研究中，我们采用PCR技术从HBV全基因组中获得全长HBx基因，并成功构建了携HBx基因、具有感染能力与较高滴度的的重组逆转录病毒。由于逆转录病毒载体可介导目的基因整合到细胞基因组中，因此，利用本实验构建的携HBx基因重组逆转录病毒来建立HBx+表型肝癌细胞株，可更接近于临床上HBx基因阳性肝癌的特征，从而为深入研究HBx基因对肝癌细胞生物学行为的影响打下基础。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700135，39970718)；国家教委博士点基金资助项目(9750)；广东省博士后基金资助项目
作者简介：闵 军(1965-)，男，湖北黄石人，博士，讲师.
参考文献：
[1] Koike K. Hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis (review) [J]. Intervirology, 1995, 38(3～4):134.
[2] Koide K, Takada S. Biochemistry and functions of heptitis B virus X protein (review) [J]. Intervirology, 1995,38(3～4):89.
, 百拇医药
[3] Schaefer S, Gerlich W H. In vitro transformation by hepatitis B DNA (review) [J]. Intervirology, 1995,38(3～4):143.
[4] 梁小浣，汤钊猷，张 予，等.乙型肝炎病毒X基因在肝癌中的表达[J].中华微生物杂志，1990，10(5)：341.
[5] 张 帆，朱源荣，孙宗棠.中国高发区肝细胞癌中HBVx基因的广泛存在及与p53基因249密码子高频率突变的密切关联 [J].中华肿瘤杂志，1998，20(1)：18.
[6] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验操作指南 [M].第2版.北京：科学出版社，1992.16～68，787～791.
[7] 张腾飞，陈诗书.细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定[J].生物化学杂志，1997，13(1)：1.
收稿日期：1999-04-22, http://www.100md.com
单位：闵军 陈积圣(中山医科大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，广东 广州 510120)；刘彦文 罗树红 余新炳(中山医科大学寄生虫学教研室， 广东 广州 510089)
关键词：基因，HBx；逆转录病毒载体
00zk12
摘 要：【目的】 构建携HBx基因的逆转录病毒载体，为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】 采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因；将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX，构建质粒pLNSHBx，磷酸钙-DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317，检测培养上清病毒滴度。【结果】 应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因，并经序列分析证实；建立了产病毒细胞株PA317/HBx，检测其培养上清病毒滴度为8.9×104 CFU，PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】 成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。
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中图分类号： R735.7 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0043-03
Construction of a Retroviral Vector Containing HBx Gene
MIN Jun, CHEN Ji-shen
( Department of Hepato-biliary Surgery, Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120,China)
LIU Yan-wen, LUO Shu-hong, YU Xin-bing
, 百拇医药
(Department of Parasitology, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract: 【Objective】 Establish a retroviral vector carrying HBx gene for investigation of the effects of HBx gene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma. 【Methods】 HBx gene was amplified from genomic DNA of HBV by PCR technique, and subcloned to plasmid pLNSX to construct recombinant plasmid pLNSHBx. Applying the calcium phosphate-DNA co-precipitation technique, the pLNSHBx was transferred into PA317 packaging cell line. Culture supernatant of these cells was collected for titration of the recombinant virus. 【Results】 HBx gene was cloned from HBV genome by PCR successfully, and proved by sequence determination. A vector producing cell line PA317/HBx was established. The titres of the recombinant virus in the culture supernatant were 8.9×104 CFU. An HBx gene integration was detected by PCR in the recombinant retroviral vectors. 【Conclusions】 A retrovirus vector containing HBx gene was successfully constructed.
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Key words：gene, HBx； retroviral vector
乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx基因)是HBV 4个开放阅读框中最小的一个，编码154个氨基酸、分子质量为17 ku的X蛋白，即HBxAg。X蛋白是一种反式激活因子，可激活多种细胞基因的启动子、诱导细胞转化、失活抑癌基因P53、阻止DNA修复等，在HBV诱发肝癌的机制中起重要作用，因此，被称为“病毒癌基因”[1～3]。多年来，有关HBx基因研究的焦点主要集中在其诱发肝癌的机制上，鉴于HBx基因转录调节的特点，以及肝癌组织中HBx基因持续高表达的现象[4,5]，我们提出HBx基因对肝癌的恶性行为具有潜在影响的新观点。为此，我们构建了携HBx基因的重组逆转录病毒载体，为深入研究HBx基因对肝癌生物学行为的影响打下基础。现将载体构建过程报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材 料
携带3.2 kb全长人HBV基因组质粒 pT7T3HBV、逆转录病毒载体pLNSX、PA317包装细胞系和小鼠成纤维细胞系NIH3T3均为本室保存； G418购自Boehringer Mannheim公司，Polybrene为Sigma公司产品，各种限制性内切酶和PCR试剂购自华美生物工程公司。
1.2 HBx基因克隆
根据HBx基因全序列设计引物，5′端引物(X1)为：5′-GGaagcttCATATGGCTGCTAGGCTG-3′；3′端引物(X2)为：5′-TGaagcttAGATCTT-GAACAGTAGGA-3′，引物两端均含HindⅢ酶切位点，扩增片段长度为518 bp。以质粒pT7T3HBV为模板，PCR反应体积为100 μL，其中含2.5 mmol/L 4×dNTP 8 μL，5′和3′游引物各100 pmol/L，Taq DNA聚合酶3 U，反应条件为94 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环。反应结束后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，DEAE膜回收片段。在全自动序列分析仪中进行序列分析。
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1.3 HBx基因重组逆转录病毒载体的构建
质粒DNA的提取、酶切、片段回收、去磷酸化、连接、转化参照文献[6]方法进行。
1.4 逆转录病毒的包装
重组质粒导入PA317包装细胞系采用磷酸钙-DNA共沉淀法[6]。
1.5 培养上清病毒鉴定
分别于转染后3、7、14、21 d收集细胞培养上清，同时收集筛选后的阳性克隆细胞株培养上清，5 000 r/min(Eppendorf 5417型离心机，r=9.2 cm)离心5 min，取上清煮沸15 min，以此为模板，分别以HBx基因引物X1和X2，新霉素抗性基因(neomycin resistance gene，NeoR)引物N1和N2[7]进行PCR反应。
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1.6 病毒滴度测定
收集PA317/HBx细胞培养上清，5 000 r/min离心5 min，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤，以1 mL每管分装，-70 ℃冻存备用。在25 mL的培养瓶中接种105个NIH3T3细胞，置37 ℃、φ=5%CO2培养24 h，吸去培养液，将病毒上清分别按10-3、10-4倍稀释，以每瓶1 mL加入到细胞表面，同时加入8 μg Polybrence，在37 ℃、φ=5%CO2条件下吸附2.5 h，再加入2 mL RPMI 1640完全培养基培养24 h，PBS洗去病毒，换含G418(终质量浓度400 g/L)的培养液进行选择培养，3～4 d换液一次，4～6周细胞克隆形成后，在倒置显微镜下计算克隆形成数目。按下列公式计算出上清的病毒滴度：病毒滴度(CFU)=克隆数目×稀释倍数×10。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 HBx基因克隆与序列测定
PCR产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见一条特异条带位于DNA分子Marker(M)标准515 bp处，与预计扩增长度(518 bp)相符(图1)；以HBx基因3′端引物对此特异片段在全自动测序仪中反向测序(部分序列见图2)，证明此片段即为HBx基因编码序列。
图1 HBx基因PCR扩增
Fig.1 HBx gene amplification by PR
M: PCR Marker, 1:pT7T3HBV plasmid DNA as template； 2: ddH2O as template
图2 HBx基因部分序列(反义链)
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Fig.2 Partial nucleotide sequence of HBx gene (anti-sense)
2.2 重组逆转录病毒载体的构建与鉴定
PCR产物HindⅢ酶切，pLNSX质粒HindⅢ酶切，用CIP酶对载体5′去磷酸化，将目的片段与载体DNA连接，产物转化大肠杆菌，快速酚法初筛出重组质粒，分别进行HBx基因PCR扩增及HindⅢ和BamHⅠ单酶切鉴定。重组体1和2经HindⅢ酶切和HBx基因均切出约500 bp片段，以引物进行PCR扩增，也都扩增出约500 bp左右特异条带，这表明HBx基因已成功连入pLNSX载体中。pLNSX与HBx连接可能有两种方式，即正向连接和反向连接。pLNSX于2 786 bp处有一BamHⅠ单酶切点，HBx基因在距起始密码子30 bp处也有一BamHⅠ单切点。因此，重组克隆经BamHⅠ单酶切后，正向连接者产生6 265 bp与382 bp两个片段，而反向连接者则产生5 829 bp和818 bp两个片段。对1和2号重组质粒进行BamHⅠ单酶切，电泳结果如图3所示。1号重组子为正向连接，命名为pLNSHBx；2号重组子则为反向连接，命名为pLNSHBxAS。
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图3 pLNSHBx重组质粒BamHⅠ酶切鉴定
Fig.3 Recombinant plasmid pLNSHBx was identified by
restriction endonuclease emzyme BamHⅠ digested
M: PCR Marker, 1: Recombinant plasmid No.1 was digested with BamHⅠ, 2: Recombinant plasmid No.2 was digested with BamHⅠ, 3: Plasimd pLNSX was digested with BamHⅠ, 4:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ as DNA marker
2.3 携HBx基因重组逆转录病毒的包装与滴度测定
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PA 317包装细胞是小鼠成纤维细胞NIH3T3经MoMLV转化而成，可为逆转录病毒载体提供结构蛋白。用磷酸钙-DNA共沉淀法将pLNSHBx导入PA317细胞，经400 mg/L G418筛选4周后形成细胞克隆；将细胞转至一新培养瓶中用800 mg/L G418加压筛选一次，此时仅少数细胞死亡，表明转染细胞能稳定表达NeoR基因。此细胞即为能分泌重组逆转录病毒的PA317产病毒细胞(vector producing cell，VPC)，命名为PA317/HBx。
2.4 培养上清病毒鉴定
用HBx基因引物与NeoR基因引物分别对3、7、14、21 d及PA317/HBx细胞培养上清进行PCR扩增，均扩增出特异性的HBx和NeoR基因条带，表明转染细胞能产生含HBx基因的重组逆转录病毒。
2.5 病毒滴度测定
, 百拇医药 用PA317/HBx细胞上清感染NIH3T3细胞，并让细胞在含G418的培养基中生长，第4周时可见克隆形成，此时在相差显微镜下统计克隆形成数目，稀释倍数为10-3的培养瓶中有37个克隆生长，10-4稀释的有12个克隆生长，取两者的均数，得出培养上清的病毒滴度为8.9×104 CFU。
3 讨 论
HBx基因编码的X蛋白是一个多功能的转录调节因子，可通过蛋白激酶信号途径活化AP-1、AP-2和NF-κB等核因子，促进癌基因和细胞因子基因如c-myc、IGF-Ⅰ等的表达，调节细胞的生长和分化[1]。在肝癌组织中已发现HBx基因与X蛋白的阳性率很高[4,5]，但X蛋白对肝癌细胞的恶性行为有何影响，迄今未见报道。在本研究中，我们采用PCR技术从HBV全基因组中获得全长HBx基因，并成功构建了携HBx基因、具有感染能力与较高滴度的的重组逆转录病毒。由于逆转录病毒载体可介导目的基因整合到细胞基因组中，因此，利用本实验构建的携HBx基因重组逆转录病毒来建立HBx+表型肝癌细胞株，可更接近于临床上HBx基因阳性肝癌的特征，从而为深入研究HBx基因对肝癌细胞生物学行为的影响打下基础。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700135，39970718)；国家教委博士点基金资助项目(9750)；广东省博士后基金资助项目
作者简介：闵 军(1965-)，男，湖北黄石人，博士，讲师.
参考文献：
[1] Koike K. Hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis (review) [J]. Intervirology, 1995, 38(3～4):134.
[2] Koide K, Takada S. Biochemistry and functions of heptitis B virus X protein (review) [J]. Intervirology, 1995,38(3～4):89.
, 百拇医药
[3] Schaefer S, Gerlich W H. In vitro transformation by hepatitis B DNA (review) [J]. Intervirology, 1995,38(3～4):143.
[4] 梁小浣，汤钊猷，张 予，等.乙型肝炎病毒X基因在肝癌中的表达[J].中华微生物杂志，1990，10(5)：341.
[5] 张 帆，朱源荣，孙宗棠.中国高发区肝细胞癌中HBVx基因的广泛存在及与p53基因249密码子高频率突变的密切关联 [J].中华肿瘤杂志，1998，20(1)：18.
[6] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验操作指南 [M].第2版.北京：科学出版社，1992.16～68，787～791.
[7] 张腾飞，陈诗书.细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定[J].生物化学杂志，1997，13(1)：1.
收稿日期：1999-04-22, http://www.100md.com