TH和GDNF基因工程细胞脑内移植治疗PD大鼠的实验研究
作者：张京钟 杨慧 段德义 段春礼 孙晓红 赵春礼 张进禄 徐群渊
单位：首都医科大学北京市神经科学研究所，北京 100054
关键词：帕金森病；基因治疗；酪氨酸羟化酶(TH)；胶质细胞系源性 神经营养因子(GDNF)
解剖学报00zk09
【摘要】目的 观察酪氨酸羟化酶(TH)和胶质细胞系源 性神经营养因子(GDNF)基因工程细胞联合移植到纹状体内对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。 方法 重组携带TH基因的质粒表达载体pCMVTH及携带GDNF基 因的质粒表 达载体pCl-neo，分别转染原代培养的成纤维细胞，筛选阳性细胞植入大鼠帕金森病模型纹 状体内，动态观 察行为学变化，并用高效液相色谱于第4、8、12、16、20周测定多巴胺、3，4-二羟苯乙酸 ( DOPAC)及高香草酸(HVA)含量的变化。结果 联合移植TH及GD NF转基因 细胞致PD大鼠纹状体内可明显减少模型单侧旋转行为，可降至移植前旋转圈数的44.3±5. 2%(P<0.01)，其效果优于单独移植TH(65.6±6.1%)或GDNF(64.8±5 .8%)转基因细胞的PD模型(P<0.05)；显著提高纹状体内多巴胺含量， 恢复至移植前水平的21.4±3.47%(P<0.001)，其程度高于单独移植TH (12.9±1.4%)或GDNF(14.5±2.2%)转基因细胞的PD模型(P<0.05)。 结论 TH及GDNF联合基因治疗具有潜在的临床应用价值。
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【中图分类号】R741.05；Q812 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-32
AN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY OF PARKINSONS DISEASE WITH TWO GRAFTS OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS EXPRESSING TYROSINE HYDROXYLASE AND GLIAL CELL LINE-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR IN THE RAT
ZHANG Jing-zhong,YANG Hui,DUAN De-yi,DUAN Chun-li,SUN Xiao-hong,ZHA O Chun-li,ZHANG Jin-lu,XU Qun-yuan
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical S ciences,Beijing 100054,China)
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【Abstract】Objective To observe the improvement of motor ab normalities and striatal levels of dopamine and its metabolites in rat model of Parkinson's disease by combining intracerebral grafts of two kinds of geneticall y modified cells expressing tyrosinehydroxylase and glial cell line-derived n eu rotrophic factor.Methods The cultured primary fibrob lasts were sele cted for genetic modification and intracerebral grafting.The recombinant vectors ,pCMVTH containing TH gene and pCI-neo containing GDNF gene,were transferred in t o the fibroblasts in vitro by using lipofectin technique.The cells expressing TH and the cells expressing GDNF were then grafted ipsilaterally into the striatum in PD models rats.The levels of the striatal dopamine(DA), 3,4-dihydroxyphenyl ac etic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in the rat models were determined by u sing high performance liquid chromatography(HPLC).The tests were done in 4, 8, 1 2,16 and 20 weeks after intracerebral transplantation.Results The g rafted genetically modified cells expressing TH and GDNF could substantially red uce the asymmetric rotational behavior of PD rats with a long-term.The scores o f asymmetric rotation of these rats after apomorphine administration decreased to 44.3±5.2%(P<0.01).The levels dopamine in the striatum decr ease d to 1.92±0.15% and was up to 21.4±3.47%(P<0.001)compare d wi th its normal level.Conclusion The combining transp lantation of TH gene-expressed and GDNF gene-expressed cultured fibroblasts is useful with re gard to the treatment of PD and had a potential usage in the clinic.
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【Key words】Parkinson disease; Gene therapy; TH; GDNF
材料和方法
1.TH及GDNF基因工程细胞的构建、筛选与鉴定
质粒pCMVTH的构建、转染及筛选方法参见文献[6]。用RT-PCR方法从我国自行 建立的BT3 25胶质瘤细胞系中克隆出全长 GDNFcDNA(588bp)，然后插入表达质粒 pCI-neo(Promega)， 酶 切鉴定为正向连接，经Lipofectin 介导转入原代培养的成纤维细胞，根据其携带的neo基因 采用G418筛选转染阳性克隆。采用地高辛标记TH及GDNF探针，原位杂交证实转基因 细胞 内有TH mRNA及GDNF mRNA表达，且免疫细胞组织化学方法在这两种基因工程细胞中可以分别 检测到TH及GDNF免疫反应产物(另文报道)。
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2.大鼠PD的建立及检测
用体重180～210g的雌性SD大鼠，麻醉状态下在左侧纹状体内两点注射6-OHDA(3g/L，含0 .02%的维生素C，生理盐水配制)，坐标分别是：A1 1.0、L1 2.5、V1 5.0、A2 0. 5、L2 3.0、V2 5.5(齿棒均低于耳间线2.4mm)，每点注射2.5μl。注射6-OHDA后第7 d给大鼠皮下注射溶于生理盐水的阿普吗啡(0.05mg/kg)，以大鼠旋转记录仪[7]检 测其 旋转行为40min。此旋转测试每周1次，持续4周。旋转圈数大于6圈/min的大鼠视为帕金森病 模型。
3.实验分组及基因工程细胞的脑内移植
将被选中的PD大鼠模型根据移植物的不同分为5组：TH+GDNF组(20只)、GDNF组(15只)、TH组 (15只)、LacZ组(9只)及未行移植术的空白对照组--Lesion组(5只)。各实验组动物脑内移 植 入相应的细胞悬液。细胞悬液中转基因细胞的浓度为1×105/μl。将细胞悬液立体定位注 射(使用50μl的Hamilton注射器和22号针头)到动物模型的左侧纹状体内(两点注射：A1 1 .8、L1 2.5、V1 4.5、A2 0.6、L2 2.0、V2 4.5，齿棒在零点，每点注射7.5 μl)。移植后，所有动物均按前述方法进行旋转试验。
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4.疗效观察
4.1 行为学观察：细胞移植后每周进行阿普吗啡诱导，观察动物的旋转行为。
4.2 脑内DA及其代谢产物含量的测定：分别在4、8、12、16、20周对各实验组的大鼠进 行 断头取脑，在冰浴中迅速解剖出双侧尾状核，做好标记，放入液氮中速冻后贮存于-80℃冰 箱待测。测定前，将冰冻组织室温融化，称重，置入300μl预冷的0.1mol/L高氯酸(内含0 .3mmol/L Na2EDTA, 0.5mol/L Na2SO3)中，加入适量内标物DHBA，匀浆，高速离 心(15 000r/min)15 min后，取上清液20μl进样，应用高效液相电化学检测器(HPLC)进行多 巴胺及其代谢产物3、4二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)检测。色谱条件：流动相为50mm ol/L 乙酸钠枸橼酸缓冲液，pH3.5(内含1.0mmol/L B-8离子对试剂，0.6mmol/L二正丁胺，0 .3 mmol/L Na2EDTA,2%乙醇)；流速1.0/min；玻璃碳工作电极，Ag/AgCl 参比电及检测电压 为+0.75V；DHBA为内标物，样品中每个组份用内标分析法进行定量。标准品倍比稀释作标 准曲线。
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单胺类试剂及其代谢产物的标准品如肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙 酸、3、4二羟基苯胺、DA、DOPAC和HVA均购自Sigma公司。
5.统计学处理
所有数据均以均数±标准误表示。统计方法为小样本均数t检验和多样本均 数方差分析 ，组间比较用Q检验，P值小于0.05者为差异有显著性 意义。
结 果
1.行为学观察
1.1 各实验组内移植前与移植后旋转行为的比较：结果如图1所示。经t 检验证实，移植后 T H+GDNF组旋转行为明显减轻，下降至44.32%(P<0.01)，TH组及GDNF组 的旋转圈数也分别降至68.12%(P<0.05)和65.55%(P <0.05)，LacZ组与空白对照组行为学移植前后无明显改变(P>0.05) (图1)。
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1.2 各实验组间移植后旋转行为的比较：结果如图2所示。Q 检验表明：(1)LacZ组与 GDNF组及TH+GDNF组的比值在各时间点均有差异显著性意义(P<0.05)；( 2)TH组的比值在1～6周及第10、15、16周与GDNF组相比较无差异显著性(P> 0.05)；(3)TH+GDNF组的比值除在第9周与GDNF组相比无差异显著性(P>0.05)外，其他各时间点与其他各组 相比均有差异显著性意义(P<0.05)。
图1 各实验组移植后与移植前旋转 行为的比较
Fig.1 Apomorphine-induced mean rotation turns Per minute in PD Rats be fore and after receiv ing implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,r espectively.
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图2 各实验组移植后与移植前旋转行为比值的动态比较
Fig.2 The ratio of mean rotation turns per minute in PD rats at differe nt times after receiving implants to before receiving implants of geneticall y modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,respectively.
2.神经生物化学检测
2.1 各实验组脑内DA、DOPAC、HVA术侧与健侧比值的比较：空白对照组术侧DA、DOP AC、HVA含量与健侧之比分别为1.92%、1.56%和5.52%，经t检验证实，与 LacZ组相应指标含 量无统计学意义(P>0.05)。TH组与GDNF组之间DA、DOPAC、HVA含量无统 计学意义(P>0.05)，虽然明显高于LacZ组(P<0.001 )，但仍然低于TH+GDNF移植组(P<0.001)。
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附表 各实验组脑内DA、DOPAC、HVA术侧与健侧比值的比较
Table The ratio of striatal mean levels of dopamine,3,4-dihydroxyphenylacetic acid and homovanillic acid in the lesion side to in the normal side of PD rats in each
of experimental groups. 分组(groups)
多巴胺(DA)(%)
二羟苯乙酸(DOPAC)(%)
高香草酸(HVA)(%)
lesion
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1.92±0.15[ HT〗
1.56±0.28
5.52±0.48
LacZ
1.88±0.12
1.58±0.2 1
5.71±0.56
TH
12.98±1.38
6.38±0.8 4
9.84±1.02
GDNF
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14.51±2.15
6.94±0 .85
10.75±1.22
TH+GDNF
21.42±3.47
20.67 ±2.86
26.85±2.28
2.2 各实验组间移植后脑内DA、DOPAC、HVA的动态观察：结果如图3、4、5所示。 Q检验表明：(1)LacZ组与TH组、GDNF组及TH+GDNF组的生化指标在各时间 点均有差异显著性意义(P<0.05)；(2)TH组的DA含量在第12周与GDNF组相 比有差异显著性(P <0.05)，两组其余指标在 各时相均无统计学差异(P>0.05)；(3)TH+GDNF组的各项 生化指标在各时相与其他各组相比均有差异显著性意义(P<0.001)。
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图3 各实验组移植后DA的动态观察
Fig.3 Mean levels of dopamine in the caudate putamen of PD rats at different tim es after receiving implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDN F+TH and LacZ,respectively.
图4 各实验组移植后DOPAC的动态变化
Fig.4 Mean levels of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid in the cau date putame n of PD rats at different times after receiving implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,respectively.
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图5 各实验组移植后HVA的动态变化
Fig.5 Mean levels of homovanillic in the caudate putamen of PD r ats at different times after receiving implants of geneticarry modified cells expressing GDNF,TH ,GDNF+TH and LacZ,respectively.
讨 论
已经知道，TH是多巴胺合成代谢过程中的限速酶，它催化酪氨酸形成左旋多巴，后者在多巴 脱 羧酶作用下转变为多巴胺[8]。国内外研究都已证明TH转基因细胞脑内移植治疗大 鼠PD 模型具有较好疗效[2，3，9，10]。GDNF最早从大鼠胶质瘤细胞系B49中分离纯化得 到，属糖基化同源二聚体蛋白质，其结构特点属于转化生长因子β超家族(TGF-β)的成员 [11]。GDNF首先以前体形式合成，然后在细胞中加工成含134个氨基酸的成熟蛋白质 并分泌 出来。尽管GDNF mRNA在中枢神经系统表达于纹状体、海马、皮质、小脑和脊髓[12] 等多 个脑区，但由于GDNF对DA能神经元特异的保护作用，致使人们在进行帕金森病的基因治疗时 仍对GDNF寄予厚望[13]。
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本研究重组携带TH基因的质粒表达载体pCMVTH及携带GDNF基因的质粒表达载体pCI-neo，通 过脂质体Lipofectin 介导分别转染原代培养的成纤维细胞，经体外实验证实基因表达产物 具有生物活性，筛选出的阳性细胞植入动物模型纹状体内，动态观察发现移植TH、GDNF、TH +GDNF均可导致旋转行为有不同程度的改善(图1)，神经生物化学亦可观察到类似的变化(表1 ) 。这一结果说明转基因细胞移植治疗是有效的。然而，考察DA含量在第12周的变化可以发现 ，TH组与GDNF组DA含量有统计学意义，说明这种不分时相的统计方法在一定程度上掩盖了数 据的内涵。为此我们观察了第4、8、12、16、20周DA、DOPAC及HVA含量的动态变化；为了比 较不同的移植物对PD大鼠行为学的影响程度，也为了降低不同实验组、不同动物移植前不同 旋转行为引起的误差，进一步研究采取计算各实验组移植前旋转圈数均数、然后比较各实验 组之间移植后每周旋转圈数与其对应均数比值的做法，对照LacZ组观察到第12周，其他各组 则观察到第20周。结果显示：(1)TH组与GDNF组的比值在1～6周非常接近，且第4周DA、DOPA C及HVA含量基本相同(图3，5)，表明在本实验条件下脑内移植TH与移植GDNF治疗PD大鼠模型 在4～6周内疗效相似；(2)尽管TH组DA含量在第8周达到峰值，但其行为学的改善程度从第7 周开始下降，呈不规则波动曲线，这与Jiao[10]等的研究有所不同，可能与所用运 载细 胞不同有关；与此不同，GDNF组的行为学改善及DA、DOPAC及HVA含量相对较为稳定，自第12 周达到峰值之后呈缓慢下降趋势，这可能与GDNF可以保护DA能神经元[14]有关；(3 )TH+ GDNF组DA含量于12周达到峰值，且始终维持在较高水平，DOPAC及HVA含量也明显高于TH组、 GDNF组，表明该组实验动物脑内DA代谢处于相对增强状态，与此对应该组的旋转行为呈显著 、持久的改善。这种效应可能一方面是GDNF能通过保护DA能神经元、重建黑质-纹状体神经 投射，另一方面则可能通过延长转基因细胞在纹状体的存活时间而致[15]。
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本研究证明了联合移植TH和GDNF转基因工程细胞可以在PD大鼠模型纹状体内长期存活(20周) ，能显著改善模型的旋转行为，并较长期维持纹状体内相对较高的DA、DOPAC及HVA水平，因 此应具有潜在的临床应用价值。
【基金项目】国家自然科学基金(39780037)、国家科技攻关项目(96-901 -06-51)、北京市自然科学基金资助项目(7971001)
【作者简介】 张京钟(1973-)，男(汉族)，湖北省钟祥人，硕士，助教
参考文献
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【收稿日期】2000-07-17 【修回日期】2000-08-15, http://www.100md.com
单位：首都医科大学北京市神经科学研究所，北京 100054
关键词：帕金森病；基因治疗；酪氨酸羟化酶(TH)；胶质细胞系源性 神经营养因子(GDNF)
解剖学报00zk09
【摘要】目的 观察酪氨酸羟化酶(TH)和胶质细胞系源 性神经营养因子(GDNF)基因工程细胞联合移植到纹状体内对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。 方法 重组携带TH基因的质粒表达载体pCMVTH及携带GDNF基 因的质粒表 达载体pCl-neo，分别转染原代培养的成纤维细胞，筛选阳性细胞植入大鼠帕金森病模型纹 状体内，动态观 察行为学变化，并用高效液相色谱于第4、8、12、16、20周测定多巴胺、3，4-二羟苯乙酸 ( DOPAC)及高香草酸(HVA)含量的变化。结果 联合移植TH及GD NF转基因 细胞致PD大鼠纹状体内可明显减少模型单侧旋转行为，可降至移植前旋转圈数的44.3±5. 2%(P<0.01)，其效果优于单独移植TH(65.6±6.1%)或GDNF(64.8±5 .8%)转基因细胞的PD模型(P<0.05)；显著提高纹状体内多巴胺含量， 恢复至移植前水平的21.4±3.47%(P<0.001)，其程度高于单独移植TH (12.9±1.4%)或GDNF(14.5±2.2%)转基因细胞的PD模型(P<0.05)。 结论 TH及GDNF联合基因治疗具有潜在的临床应用价值。
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【中图分类号】R741.05；Q812 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-32
AN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY OF PARKINSONS DISEASE WITH TWO GRAFTS OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS EXPRESSING TYROSINE HYDROXYLASE AND GLIAL CELL LINE-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR IN THE RAT
ZHANG Jing-zhong,YANG Hui,DUAN De-yi,DUAN Chun-li,SUN Xiao-hong,ZHA O Chun-li,ZHANG Jin-lu,XU Qun-yuan
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【Key words】Parkinson disease; Gene therapy; TH; GDNF
材料和方法
1.TH及GDNF基因工程细胞的构建、筛选与鉴定
质粒pCMVTH的构建、转染及筛选方法参见文献[6]。用RT-PCR方法从我国自行 建立的BT3 25胶质瘤细胞系中克隆出全长 GDNFcDNA(588bp)，然后插入表达质粒 pCI-neo(Promega)， 酶 切鉴定为正向连接，经Lipofectin 介导转入原代培养的成纤维细胞，根据其携带的neo基因 采用G418筛选转染阳性克隆。采用地高辛标记TH及GDNF探针，原位杂交证实转基因 细胞 内有TH mRNA及GDNF mRNA表达，且免疫细胞组织化学方法在这两种基因工程细胞中可以分别 检测到TH及GDNF免疫反应产物(另文报道)。
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2.大鼠PD的建立及检测
用体重180～210g的雌性SD大鼠，麻醉状态下在左侧纹状体内两点注射6-OHDA(3g/L，含0 .02%的维生素C，生理盐水配制)，坐标分别是：A1 1.0、L1 2.5、V1 5.0、A2 0. 5、L2 3.0、V2 5.5(齿棒均低于耳间线2.4mm)，每点注射2.5μl。注射6-OHDA后第7 d给大鼠皮下注射溶于生理盐水的阿普吗啡(0.05mg/kg)，以大鼠旋转记录仪[7]检 测其 旋转行为40min。此旋转测试每周1次，持续4周。旋转圈数大于6圈/min的大鼠视为帕金森病 模型。
3.实验分组及基因工程细胞的脑内移植
将被选中的PD大鼠模型根据移植物的不同分为5组：TH+GDNF组(20只)、GDNF组(15只)、TH组 (15只)、LacZ组(9只)及未行移植术的空白对照组--Lesion组(5只)。各实验组动物脑内移 植 入相应的细胞悬液。细胞悬液中转基因细胞的浓度为1×105/μl。将细胞悬液立体定位注 射(使用50μl的Hamilton注射器和22号针头)到动物模型的左侧纹状体内(两点注射：A1 1 .8、L1 2.5、V1 4.5、A2 0.6、L2 2.0、V2 4.5，齿棒在零点，每点注射7.5 μl)。移植后，所有动物均按前述方法进行旋转试验。
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4.疗效观察
4.1 行为学观察：细胞移植后每周进行阿普吗啡诱导，观察动物的旋转行为。
4.2 脑内DA及其代谢产物含量的测定：分别在4、8、12、16、20周对各实验组的大鼠进 行 断头取脑，在冰浴中迅速解剖出双侧尾状核，做好标记，放入液氮中速冻后贮存于-80℃冰 箱待测。测定前，将冰冻组织室温融化，称重，置入300μl预冷的0.1mol/L高氯酸(内含0 .3mmol/L Na2EDTA, 0.5mol/L Na2SO3)中，加入适量内标物DHBA，匀浆，高速离 心(15 000r/min)15 min后，取上清液20μl进样，应用高效液相电化学检测器(HPLC)进行多 巴胺及其代谢产物3、4二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)检测。色谱条件：流动相为50mm ol/L 乙酸钠枸橼酸缓冲液，pH3.5(内含1.0mmol/L B-8离子对试剂，0.6mmol/L二正丁胺，0 .3 mmol/L Na2EDTA,2%乙醇)；流速1.0/min；玻璃碳工作电极，Ag/AgCl 参比电及检测电压 为+0.75V；DHBA为内标物，样品中每个组份用内标分析法进行定量。标准品倍比稀释作标 准曲线。
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单胺类试剂及其代谢产物的标准品如肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙 酸、3、4二羟基苯胺、DA、DOPAC和HVA均购自Sigma公司。
5.统计学处理
所有数据均以均数±标准误表示。统计方法为小样本均数t检验和多样本均 数方差分析 ，组间比较用Q检验，P值小于0.05者为差异有显著性 意义。
结 果
1.行为学观察
1.1 各实验组内移植前与移植后旋转行为的比较：结果如图1所示。经t 检验证实，移植后 T H+GDNF组旋转行为明显减轻，下降至44.32%(P<0.01)，TH组及GDNF组 的旋转圈数也分别降至68.12%(P<0.05)和65.55%(P <0.05)，LacZ组与空白对照组行为学移植前后无明显改变(P>0.05) (图1)。
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1.2 各实验组间移植后旋转行为的比较：结果如图2所示。Q 检验表明：(1)LacZ组与 GDNF组及TH+GDNF组的比值在各时间点均有差异显著性意义(P<0.05)；( 2)TH组的比值在1～6周及第10、15、16周与GDNF组相比较无差异显著性(P> 0.05)；(3)TH+GDNF组的比值除在第9周与GDNF组相比无差异显著性(P>0.05)外，其他各时间点与其他各组 相比均有差异显著性意义(P<0.05)。
图1 各实验组移植后与移植前旋转 行为的比较
Fig.1 Apomorphine-induced mean rotation turns Per minute in PD Rats be fore and after receiv ing implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,r espectively.
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图2 各实验组移植后与移植前旋转行为比值的动态比较
Fig.2 The ratio of mean rotation turns per minute in PD rats at differe nt times after receiving implants to before receiving implants of geneticall y modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,respectively.
2.神经生物化学检测
2.1 各实验组脑内DA、DOPAC、HVA术侧与健侧比值的比较：空白对照组术侧DA、DOP AC、HVA含量与健侧之比分别为1.92%、1.56%和5.52%，经t检验证实，与 LacZ组相应指标含 量无统计学意义(P>0.05)。TH组与GDNF组之间DA、DOPAC、HVA含量无统 计学意义(P>0.05)，虽然明显高于LacZ组(P<0.001 )，但仍然低于TH+GDNF移植组(P<0.001)。
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附表 各实验组脑内DA、DOPAC、HVA术侧与健侧比值的比较
Table The ratio of striatal mean levels of dopamine,3,4-dihydroxyphenylacetic acid and homovanillic acid in the lesion side to in the normal side of PD rats in each
of experimental groups. 分组(groups)
多巴胺(DA)(%)
二羟苯乙酸(DOPAC)(%)
高香草酸(HVA)(%)
lesion
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1.92±0.15[ HT〗
1.56±0.28
5.52±0.48
LacZ
1.88±0.12
1.58±0.2 1
5.71±0.56
TH
12.98±1.38
6.38±0.8 4
9.84±1.02
GDNF
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14.51±2.15
6.94±0 .85
10.75±1.22
TH+GDNF
21.42±3.47
20.67 ±2.86
26.85±2.28
2.2 各实验组间移植后脑内DA、DOPAC、HVA的动态观察：结果如图3、4、5所示。 Q检验表明：(1)LacZ组与TH组、GDNF组及TH+GDNF组的生化指标在各时间 点均有差异显著性意义(P<0.05)；(2)TH组的DA含量在第12周与GDNF组相 比有差异显著性(P <0.05)，两组其余指标在 各时相均无统计学差异(P>0.05)；(3)TH+GDNF组的各项 生化指标在各时相与其他各组相比均有差异显著性意义(P<0.001)。
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图3 各实验组移植后DA的动态观察
Fig.3 Mean levels of dopamine in the caudate putamen of PD rats at different tim es after receiving implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDN F+TH and LacZ,respectively.
图4 各实验组移植后DOPAC的动态变化
Fig.4 Mean levels of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid in the cau date putame n of PD rats at different times after receiving implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,respectively.
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图5 各实验组移植后HVA的动态变化
Fig.5 Mean levels of homovanillic in the caudate putamen of PD r ats at different times after receiving implants of geneticarry modified cells expressing GDNF,TH ,GDNF+TH and LacZ,respectively.
讨 论
已经知道，TH是多巴胺合成代谢过程中的限速酶，它催化酪氨酸形成左旋多巴，后者在多巴 脱 羧酶作用下转变为多巴胺[8]。国内外研究都已证明TH转基因细胞脑内移植治疗大 鼠PD 模型具有较好疗效[2，3，9，10]。GDNF最早从大鼠胶质瘤细胞系B49中分离纯化得 到，属糖基化同源二聚体蛋白质，其结构特点属于转化生长因子β超家族(TGF-β)的成员 [11]。GDNF首先以前体形式合成，然后在细胞中加工成含134个氨基酸的成熟蛋白质 并分泌 出来。尽管GDNF mRNA在中枢神经系统表达于纹状体、海马、皮质、小脑和脊髓[12] 等多 个脑区，但由于GDNF对DA能神经元特异的保护作用，致使人们在进行帕金森病的基因治疗时 仍对GDNF寄予厚望[13]。
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本研究重组携带TH基因的质粒表达载体pCMVTH及携带GDNF基因的质粒表达载体pCI-neo，通 过脂质体Lipofectin 介导分别转染原代培养的成纤维细胞，经体外实验证实基因表达产物 具有生物活性，筛选出的阳性细胞植入动物模型纹状体内，动态观察发现移植TH、GDNF、TH +GDNF均可导致旋转行为有不同程度的改善(图1)，神经生物化学亦可观察到类似的变化(表1 ) 。这一结果说明转基因细胞移植治疗是有效的。然而，考察DA含量在第12周的变化可以发现 ，TH组与GDNF组DA含量有统计学意义，说明这种不分时相的统计方法在一定程度上掩盖了数 据的内涵。为此我们观察了第4、8、12、16、20周DA、DOPAC及HVA含量的动态变化；为了比 较不同的移植物对PD大鼠行为学的影响程度，也为了降低不同实验组、不同动物移植前不同 旋转行为引起的误差，进一步研究采取计算各实验组移植前旋转圈数均数、然后比较各实验 组之间移植后每周旋转圈数与其对应均数比值的做法，对照LacZ组观察到第12周，其他各组 则观察到第20周。结果显示：(1)TH组与GDNF组的比值在1～6周非常接近，且第4周DA、DOPA C及HVA含量基本相同(图3，5)，表明在本实验条件下脑内移植TH与移植GDNF治疗PD大鼠模型 在4～6周内疗效相似；(2)尽管TH组DA含量在第8周达到峰值，但其行为学的改善程度从第7 周开始下降，呈不规则波动曲线，这与Jiao[10]等的研究有所不同，可能与所用运 载细 胞不同有关；与此不同，GDNF组的行为学改善及DA、DOPAC及HVA含量相对较为稳定，自第12 周达到峰值之后呈缓慢下降趋势，这可能与GDNF可以保护DA能神经元[14]有关；(3 )TH+ GDNF组DA含量于12周达到峰值，且始终维持在较高水平，DOPAC及HVA含量也明显高于TH组、 GDNF组，表明该组实验动物脑内DA代谢处于相对增强状态，与此对应该组的旋转行为呈显著 、持久的改善。这种效应可能一方面是GDNF能通过保护DA能神经元、重建黑质-纹状体神经 投射，另一方面则可能通过延长转基因细胞在纹状体的存活时间而致[15]。
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本研究证明了联合移植TH和GDNF转基因工程细胞可以在PD大鼠模型纹状体内长期存活(20周) ，能显著改善模型的旋转行为，并较长期维持纹状体内相对较高的DA、DOPAC及HVA水平，因 此应具有潜在的临床应用价值。
【基金项目】国家自然科学基金(39780037)、国家科技攻关项目(96-901 -06-51)、北京市自然科学基金资助项目(7971001)
【作者简介】 张京钟(1973-)，男(汉族)，湖北省钟祥人，硕士，助教
参考文献
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【收稿日期】2000-07-17 【修回日期】2000-08-15, http://www.100md.com