AP-PCR和set1、set2两基因PCR用于志贺菌基因多态性研究
作者：夏桂枝 叶礼燕 王红 陈新民 白石山
单位：夏桂枝(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；叶礼燕(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；王红(第一军医大学流行病学教研室)；陈新民(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；白石山(解放军第253医院)
关键词：志贺菌；AP-PCR；志贺菌肠毒素；多态性；基因
医学研究生学报00zk15摘要： 目的与方法： 应用随机引物PCR(简称AP-PCR或PAPD)和set1、set2两基因PCR方法分析了71株F2a志贺菌的基因多态性。 结果：两种引物的AP-PCR中，引物12将71株F2a志贺菌分为两种不同的基因型，引物17和set1、set2两基因PCR将所有菌株分为四种不同的基因型，两种方法结合则可分为七种不同的基因型；其中65株F2a志贺菌基因型相同，其余6株各为独立的型别。本研究表明AP-PCR和set1、set2两基因PCR为志贺菌基因多态性分析的有效手段，二者结合则更为完善；研究结果还表明，在我国南北不同地区不同时间分离到的无论是暴发株还是散发株，均具有相同的优势克隆。 结论：上述菌株是引起国内菌痢散发和暴发的主要基因型，是流行病学研究和防治的重点。
, http://www.100md.com
中图分类号： 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)增刊-0038-02
Study on the polymorphism of shigella flexneri 2a
by using AP-PCR and set1，set2 double-PCR
XIA Gui-zhi YE Li-yan CHEN Xin-min
(Department of Pediatrics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command,PLA,Fuzhou 350025,Fujian,China)
WANG Hong
, http://www.100md.com
(Department of Epidemiology,the 1st Military Medical University)
BAI Shi-shan
(The 253rd Hospital of PLA)
Abstract: Objectives and Methods: AP-PCR and setl,set2 double-PCR were carried out in 71 strains of Shigella flexinert 2a,43 outbreak strains isolated from Inner Mongolia,28 strains isolated from Jiangmen. Results:All strains were divided into 2 different clones by using AP-PCR(perimer 12),four different clones by using AP-PCR(perimer 17) and setl,set2 double-PCR.Combining two methods,all strains were divided into 7 different clones,65 of 71 strains belong to a single clone,the others were not the same among themselves. Conclusions: AP-PCR and setl,set2 double-PCR were effective to analysis gene polymophism of Shigella.Majoring of 71strains,no matter isolated from different place and at different time,outbreak strains or sporadis,belong to a single clone,which caused Shigellosis in different places of our country at different times,must be given priority to research and control.
, http://www.100md.com
Key words: Shigella; AP-PCR； Enterotoxin; Polymorphism; Gene
0 引言
遗传和变异是细菌的基本属性，细菌在承受多种环境压力的条件下，其内部遗传物质可能发生变异，这种变异也许能引起表型特征的明显改变，但也可能仅仅是遗传物质结构的改变，形成许多表型相同而基因型不同的克隆群体，即存在着基因多态性。本研究应用AP-PCR和set1、set2两基因PCR方法对内蒙43株F2a志贺菌暴发株和江门28株F2a志贺菌散发株进行了分析，现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 43株F2a志贺菌暴发株系内蒙呼和浩特市1997年某驾驶学校发生的一起菌痢暴发期间从现患者粪便中分离到的，28株F2a志贺菌散发株分离自1998年1～7月间广东江门市就诊病例，由江门市卫生防疫站提供，F2a、T32为第一军医大学流行病学教研室保存菌种。
, http://www.100md.com
1.1.2 引物和试剂 随机引物12和17参照Akopyanz[1]推荐的引物序列合成，并通过特异性、敏感性分析优选得出；set1、set2两基因PCR引物针对set基因由第一军医大学流行病学教研室协助设计合成，预计扩增片段长度分别为306 bp和530 bp。Tris、dNIP和Taq酶购自上海华夏生物工程公司，100 bp marker购自Promeger公司。
1.2 方法
1.2.1 粗制模板的制备 采用Sakallah[2]介绍的方法，挑起1～2个过夜培养的单个菌落，悬于500 μl的裂解液中(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 1 mmol/L ED-TA, 1% TritonX-100)，100℃煮沸20～30 min，冷却至室温后，-20℃保存备用。
1.2.2 随机引物PCR扩增 反应总体积为50 μl，其中10×PCR缓冲液(引物12采用3 mmol/L Mg2+，引物17采用4 mmol/L Mg2+)5 μl，2 mmol/L dNTP 10 μl，粗制模板DNA 10 μl，随机引物3 μl，Taq酶(1 U/ μl)2 μl，去离子水20 μl，采用Biometra PCR仪，94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环后72℃延伸7 min。
, 百拇医药
1.2.3 set1、set2两基因PCR扩增 反应总体积为50 μl，其中10×PCR缓冲液、粗制模板DNA、2 mmol/L dNTP各5 μl，引物各为1 μl，Taq酶(1 U/ μl)2 μl，去离子水31 μl，采用Biometra PCR仪，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环后72℃延伸5 min。
1.2.4 电泳 取扩增产物8～10 μl，1.4%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，紫外线灯下观察结果。
2 结果
AP-PCR中引物12将71株F2a志贺菌分为两种不同的基因型，江门株JM98101和其他菌株虽均可见三条电泳带，但少一条其他菌株均有的约600 bp电泳带，而多一条约450 bp电泳带。引物17将所有菌株分为四种不同的基因型，除JM98101、J19826、M9729外，其余各株可见大小分布在2.26～200 bp之间7条电泳带，而JM98101明显多出数条大小不同的电泳带，JM9826缺少一条1.0 kb和一条约1.5 kb的电泳带，M9829则缺少约2.0 kb的两条电泳带。
, http://www.100md.com
set1、set2两基因PCR将所有菌株分为四种不同基因型：JM9818未见扩增片段的电泳带，M9728仅见set1 PCR扩增片段的电泳带，M9704、M9732则仅见set2 PCR扩增片段的电泳带，其余各株则均可见set1、set2两基因PCR扩增出的大小分别为306 bp和530 bp的电泳带。
两种方法结合将71株F2a志贺菌分为七种不同的基因型：JM98101、JM9818、JM9826、M9729、M9738、M9704(M9723)以及其他所有菌株都相同的基因型。
3 讨论
目前志贺菌仍是世界不同国家引起腹泻的重要病原体。长期以来，对志贺菌主要根据生化反应、抗原结构、噬菌体等进行分型和鉴定，但这些方法对于内部遗传物质结构已发生改变而表型相同的菌株无法鉴别。近年来，随着分子生物学理论和技术的进展，各种分子生物学方法被逐渐应用于病原菌的基因多态性分析，但这些方法各有利弊，如质粒分析虽然简单快速，但因为质粒是染色体外DNA，容易发生丢失，结果不稳定；核糖体基因分型重复性虽好，但分辨率低；PFGE为较好的基因分型方法，可是需要昂贵的实验仪器，使临床应用受到限制；而PCR技术由于其特异、敏感、简单、快速的优点而受到重视[3]。
, http://www.100md.com
1990年，Williams[1]和Welsh[5]等几乎同时建立了随机引物PCR技术，利用随机引物扩增未知序列的染色体DNA，通过比较扩增产物的多态性在克隆(或株)水平上鉴定染色体DNA的差异，它弥补了标准PCR技术只能应用于已知DNA序列基因片段鉴定和分析的不足，扩展了PCR的应用领域，具有广阔的发展前景。但随机引物PCR方法所受的影响因素很多，需对引物、反应成分和反应条件反复优化，并使每次的反应条件尽量一致，方能保证结果的稳定性。
set1、set2为两种新发现的志贺菌肠毒素基因，set1位于染色体上，主要存在于F2a志贺菌中，在其他血清型中则较少见；set2位于志贺菌相对分子质量1406的大质粒上，广泛存在于各种血清型的志贺菌中，应用set1、set2两基因PCR进行分析，不仅较单基因PCR多态性好，而且可能会比志贺菌侵袭基因的PCR分辨率高。
两种PCR方法均采用粗制模板进行PCR扩增，省去了提取纯化染色体DNA的许多繁琐复杂的步骤，使PCR方法更为简化，且扩增效果不受影响。两种方法分辨率相似，而结合起来则更为完善，为志贺菌的基因多态性分析提供了有效的手段。AP-PCR中引物17的分辨率明显高于引物12，提示在AP-PCR中引物的选择至关重要。
, 百拇医药
本研究中71株志贺菌血清型虽相同，但经AP-PCR和set1、set2两基因PCR分析可分为七种不同的类型，证明存在着遗传物质的差异，即基因多态性；结果还表明，在我国南北不同地区不同时间无论是暴发株还是散发株，均具有相同的优势克隆，说明它是引起国内菌痢散发和流行的主要基因型，是流行病学研究和防治的重点，在流行病学和临床研究中均具有重要意义。
夏桂枝(1970-),女,湖北黄冈市人,医师,医学硕士,从事儿内科专业.
参考文献：
[1] Akopyanz NO, bukanov N, Westblom TU,et al. DNA diversity among clinocal isolates of heiicobacter pylori detected by PCR based RAPD fingerprinting[J]. Nuclieic Acid Res, 1992,20(19):5137-5142.
, 百拇医药
[2] Sakallah SA, Lanning RW, Cooper DI. DNA fingerprinting of crude bacterial lysates using degenerate RAPD primers[J]. PCR Methods and Applications, 1995,5(4):265-268.
[3] Liu PY, Lau YJ, Hu BS,et al. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing mothods[J]. J Clin Microbiol, 1995,33(7):1779-1783.
[4] Williams JGK, Kubelik ARJ, Livak K,et al. DNA polymophisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Res, 1990,18(22):6531-6535.
, 百拇医药
[5] Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primes[J]. Nuclieic Acids Res, 1990,18(24):7213-7218.
[6] Femaclol R, Noriega, liao FM,et al. Prevelance of Shigella entertoxin 1 among Shigella clinical isolates of diverse serotype[J]. J Infect Dis, 1995,172(5):1408-1410.
收稿日期：2000-02-07, http://www.100md.com
单位：夏桂枝(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；叶礼燕(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；王红(第一军医大学流行病学教研室)；陈新民(南京军区福州总医院儿科，福建福州 350025)；白石山(解放军第253医院)
关键词：志贺菌；AP-PCR；志贺菌肠毒素；多态性；基因
医学研究生学报00zk15摘要： 目的与方法： 应用随机引物PCR(简称AP-PCR或PAPD)和set1、set2两基因PCR方法分析了71株F2a志贺菌的基因多态性。 结果：两种引物的AP-PCR中，引物12将71株F2a志贺菌分为两种不同的基因型，引物17和set1、set2两基因PCR将所有菌株分为四种不同的基因型，两种方法结合则可分为七种不同的基因型；其中65株F2a志贺菌基因型相同，其余6株各为独立的型别。本研究表明AP-PCR和set1、set2两基因PCR为志贺菌基因多态性分析的有效手段，二者结合则更为完善；研究结果还表明，在我国南北不同地区不同时间分离到的无论是暴发株还是散发株，均具有相同的优势克隆。 结论：上述菌株是引起国内菌痢散发和暴发的主要基因型，是流行病学研究和防治的重点。
, http://www.100md.com
中图分类号： 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)增刊-0038-02
Study on the polymorphism of shigella flexneri 2a
by using AP-PCR and set1，set2 double-PCR
XIA Gui-zhi YE Li-yan CHEN Xin-min
(Department of Pediatrics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command,PLA,Fuzhou 350025,Fujian,China)
WANG Hong
, http://www.100md.com
(Department of Epidemiology,the 1st Military Medical University)
BAI Shi-shan
(The 253rd Hospital of PLA)
Abstract: Objectives and Methods: AP-PCR and setl,set2 double-PCR were carried out in 71 strains of Shigella flexinert 2a,43 outbreak strains isolated from Inner Mongolia,28 strains isolated from Jiangmen. Results:All strains were divided into 2 different clones by using AP-PCR(perimer 12),four different clones by using AP-PCR(perimer 17) and setl,set2 double-PCR.Combining two methods,all strains were divided into 7 different clones,65 of 71 strains belong to a single clone,the others were not the same among themselves. Conclusions: AP-PCR and setl,set2 double-PCR were effective to analysis gene polymophism of Shigella.Majoring of 71strains,no matter isolated from different place and at different time,outbreak strains or sporadis,belong to a single clone,which caused Shigellosis in different places of our country at different times,must be given priority to research and control.
, http://www.100md.com
Key words: Shigella; AP-PCR； Enterotoxin; Polymorphism; Gene
0 引言
遗传和变异是细菌的基本属性，细菌在承受多种环境压力的条件下，其内部遗传物质可能发生变异，这种变异也许能引起表型特征的明显改变，但也可能仅仅是遗传物质结构的改变，形成许多表型相同而基因型不同的克隆群体，即存在着基因多态性。本研究应用AP-PCR和set1、set2两基因PCR方法对内蒙43株F2a志贺菌暴发株和江门28株F2a志贺菌散发株进行了分析，现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 43株F2a志贺菌暴发株系内蒙呼和浩特市1997年某驾驶学校发生的一起菌痢暴发期间从现患者粪便中分离到的，28株F2a志贺菌散发株分离自1998年1～7月间广东江门市就诊病例，由江门市卫生防疫站提供，F2a、T32为第一军医大学流行病学教研室保存菌种。
, http://www.100md.com
1.1.2 引物和试剂 随机引物12和17参照Akopyanz[1]推荐的引物序列合成，并通过特异性、敏感性分析优选得出；set1、set2两基因PCR引物针对set基因由第一军医大学流行病学教研室协助设计合成，预计扩增片段长度分别为306 bp和530 bp。Tris、dNIP和Taq酶购自上海华夏生物工程公司，100 bp marker购自Promeger公司。
1.2 方法
1.2.1 粗制模板的制备 采用Sakallah[2]介绍的方法，挑起1～2个过夜培养的单个菌落，悬于500 μl的裂解液中(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 1 mmol/L ED-TA, 1% TritonX-100)，100℃煮沸20～30 min，冷却至室温后，-20℃保存备用。
1.2.2 随机引物PCR扩增 反应总体积为50 μl，其中10×PCR缓冲液(引物12采用3 mmol/L Mg2+，引物17采用4 mmol/L Mg2+)5 μl，2 mmol/L dNTP 10 μl，粗制模板DNA 10 μl，随机引物3 μl，Taq酶(1 U/ μl)2 μl，去离子水20 μl，采用Biometra PCR仪，94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环后72℃延伸7 min。
, 百拇医药
1.2.3 set1、set2两基因PCR扩增 反应总体积为50 μl，其中10×PCR缓冲液、粗制模板DNA、2 mmol/L dNTP各5 μl，引物各为1 μl，Taq酶(1 U/ μl)2 μl，去离子水31 μl，采用Biometra PCR仪，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环后72℃延伸5 min。
1.2.4 电泳 取扩增产物8～10 μl，1.4%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，紫外线灯下观察结果。
2 结果
AP-PCR中引物12将71株F2a志贺菌分为两种不同的基因型，江门株JM98101和其他菌株虽均可见三条电泳带，但少一条其他菌株均有的约600 bp电泳带，而多一条约450 bp电泳带。引物17将所有菌株分为四种不同的基因型，除JM98101、J19826、M9729外，其余各株可见大小分布在2.26～200 bp之间7条电泳带，而JM98101明显多出数条大小不同的电泳带，JM9826缺少一条1.0 kb和一条约1.5 kb的电泳带，M9829则缺少约2.0 kb的两条电泳带。
, http://www.100md.com
set1、set2两基因PCR将所有菌株分为四种不同基因型：JM9818未见扩增片段的电泳带，M9728仅见set1 PCR扩增片段的电泳带，M9704、M9732则仅见set2 PCR扩增片段的电泳带，其余各株则均可见set1、set2两基因PCR扩增出的大小分别为306 bp和530 bp的电泳带。
两种方法结合将71株F2a志贺菌分为七种不同的基因型：JM98101、JM9818、JM9826、M9729、M9738、M9704(M9723)以及其他所有菌株都相同的基因型。
3 讨论
目前志贺菌仍是世界不同国家引起腹泻的重要病原体。长期以来，对志贺菌主要根据生化反应、抗原结构、噬菌体等进行分型和鉴定，但这些方法对于内部遗传物质结构已发生改变而表型相同的菌株无法鉴别。近年来，随着分子生物学理论和技术的进展，各种分子生物学方法被逐渐应用于病原菌的基因多态性分析，但这些方法各有利弊，如质粒分析虽然简单快速，但因为质粒是染色体外DNA，容易发生丢失，结果不稳定；核糖体基因分型重复性虽好，但分辨率低；PFGE为较好的基因分型方法，可是需要昂贵的实验仪器，使临床应用受到限制；而PCR技术由于其特异、敏感、简单、快速的优点而受到重视[3]。
, http://www.100md.com
1990年，Williams[1]和Welsh[5]等几乎同时建立了随机引物PCR技术，利用随机引物扩增未知序列的染色体DNA，通过比较扩增产物的多态性在克隆(或株)水平上鉴定染色体DNA的差异，它弥补了标准PCR技术只能应用于已知DNA序列基因片段鉴定和分析的不足，扩展了PCR的应用领域，具有广阔的发展前景。但随机引物PCR方法所受的影响因素很多，需对引物、反应成分和反应条件反复优化，并使每次的反应条件尽量一致，方能保证结果的稳定性。
set1、set2为两种新发现的志贺菌肠毒素基因，set1位于染色体上，主要存在于F2a志贺菌中，在其他血清型中则较少见；set2位于志贺菌相对分子质量1406的大质粒上，广泛存在于各种血清型的志贺菌中，应用set1、set2两基因PCR进行分析，不仅较单基因PCR多态性好，而且可能会比志贺菌侵袭基因的PCR分辨率高。
两种PCR方法均采用粗制模板进行PCR扩增，省去了提取纯化染色体DNA的许多繁琐复杂的步骤，使PCR方法更为简化，且扩增效果不受影响。两种方法分辨率相似，而结合起来则更为完善，为志贺菌的基因多态性分析提供了有效的手段。AP-PCR中引物17的分辨率明显高于引物12，提示在AP-PCR中引物的选择至关重要。
, 百拇医药
本研究中71株志贺菌血清型虽相同，但经AP-PCR和set1、set2两基因PCR分析可分为七种不同的类型，证明存在着遗传物质的差异，即基因多态性；结果还表明，在我国南北不同地区不同时间无论是暴发株还是散发株，均具有相同的优势克隆，说明它是引起国内菌痢散发和流行的主要基因型，是流行病学研究和防治的重点，在流行病学和临床研究中均具有重要意义。
夏桂枝(1970-),女,湖北黄冈市人,医师,医学硕士,从事儿内科专业.
参考文献：
[1] Akopyanz NO, bukanov N, Westblom TU,et al. DNA diversity among clinocal isolates of heiicobacter pylori detected by PCR based RAPD fingerprinting[J]. Nuclieic Acid Res, 1992,20(19):5137-5142.
, 百拇医药
[2] Sakallah SA, Lanning RW, Cooper DI. DNA fingerprinting of crude bacterial lysates using degenerate RAPD primers[J]. PCR Methods and Applications, 1995,5(4):265-268.
[3] Liu PY, Lau YJ, Hu BS,et al. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing mothods[J]. J Clin Microbiol, 1995,33(7):1779-1783.
[4] Williams JGK, Kubelik ARJ, Livak K,et al. DNA polymophisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Res, 1990,18(22):6531-6535.
, 百拇医药
[5] Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primes[J]. Nuclieic Acids Res, 1990,18(24):7213-7218.
[6] Femaclol R, Noriega, liao FM,et al. Prevelance of Shigella entertoxin 1 among Shigella clinical isolates of diverse serotype[J]. J Infect Dis, 1995,172(5):1408-1410.
收稿日期：2000-02-07, http://www.100md.com